孫 菱，楊建科，郭桂英，歐陽慧，王燕玲

諾卡菌是革蘭陽性的長(zhǎng)桿狀、有分支的細(xì)菌，抗酸染色呈弱抗酸性，為條件致病菌。諾卡菌屬種類眾多，其中引起人類感染的有十余種，近年來諾卡菌屬的一些新種也陸續(xù)被定義，蓋爾森基興諾卡菌(Nocardiacyriacigeorgica)是2001年在德國(guó)由Yassin等人從一個(gè)慢性支氣管炎病人的支氣管分泌物中發(fā)現(xiàn)并重新定義的[1]。諾卡菌病在國(guó)內(nèi)報(bào)道中相對(duì)少見，其中蓋爾森基興諾卡菌血流感染更為罕見，其臨床表現(xiàn)和影像學(xué)缺乏特異性，因此在臨床工作中易誤診、漏診。然而諾卡菌病的病死率高[2]，早期診斷、及時(shí)正確的治療可提高其治愈率、改善預(yù)后[3]。故本文通過回顧分析樂山市人民醫(yī)院1例蓋爾森基興諾卡菌血流感染的臨床資料及文獻(xiàn)復(fù)習(xí)，加深對(duì)諾卡菌的認(rèn)識(shí)，提高其診治水平。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1菌株來源 收集我院腎內(nèi)科1例諾卡菌感染的臨床分離株，質(zhì)控菌為金黃色葡萄球菌 ATCC29213、大腸埃希菌 ATCC 35218。

1.1.2主要試劑 環(huán)丙沙星、阿米卡星、亞胺培南等抗菌藥物標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)有限公司，血瓊脂培養(yǎng)基購(gòu)自鄭州安圖生物公司。

1.2 方 法

1.2.1臨床資料 患者，男，87歲，因“排尿困難半月，咳嗽、咳痰、言語不清4 d”于2018年1月14日入院。入院半月前患者無明顯誘因出現(xiàn)排尿困難，于4 d前受涼后出現(xiàn)咳嗽、咳痰，咯白色黏液痰，隨后出現(xiàn)言語不清，伴呃逆、雙下肢無力，無意識(shí)障礙、暈厥、一過性黑朦及四肢抽搐。既往有慢支炎、肺氣腫病史30年。查體：雙肺呼吸音粗糙，雙下肺聞及濕啰音及明顯哮鳴音，伸舌稍右偏，右側(cè)鼻厝溝稍變淺，右側(cè)巴氏征可疑陽性。彩超提示：“前列腺測(cè)值偏大；前列腺結(jié)石?！毙行夭緾T、頭顱CT(圖1)，報(bào)告提示：“1、左側(cè)頂葉片狀稍低密度，不除外梗塞可能：雙側(cè)側(cè)腦室旁半卵圓中心多發(fā)缺血缺氧灶，腦白質(zhì)疏松，腦萎縮。慢支炎、肺氣腫，雙肺炎癥，部分間質(zhì)性改變。右肺上葉后段片結(jié)影：腫瘤？炎癥？雙側(cè)胸腔積液。”血常規(guī)：WBC22.9×109/L，NEU21.18×109/L，RBC1.91×1012/L，Hb59g/l；CRP153.5 mg/L ；PCT0.495 ng/mL；血清鐵蛋白>1 650 ng/mL；尿常規(guī)：紅細(xì)胞27/HP，白細(xì)胞295/HP；肝功：谷丙轉(zhuǎn)氨酶87 U/L，谷草轉(zhuǎn)氨酶122 U/L，白蛋白29.5 g/L，直接膽紅素13.7 mo1/L。入院后經(jīng)驗(yàn)性使用哌拉西林他唑巴坦抗感染，并予以擴(kuò)張支氣管、祛痰、輸血等治療，但患者感染未得到控制。1月18日其血、尿、痰細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果回示臨床后，改用米諾環(huán)素100 mg口服2次/d，復(fù)方磺胺甲惡唑片0.96 g口服2次/d。

圖1 CT檢查Fig.1 CT Examination of the patient

1.2.2病原學(xué)鑒定 檢驗(yàn)科微生物室將該患者尿、痰標(biāo)本接種于血瓊脂平板，同時(shí)對(duì)標(biāo)本進(jìn)行了革蘭氏染色，隨后又行改良抗酸染色。將血培養(yǎng)儀提示有細(xì)菌生長(zhǎng)的血培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)接種至血瓊脂平板培養(yǎng)，35 ℃孵育2 d，觀察菌落形態(tài)，并染色鏡檢。

1.2.316S rRNA測(cè)序 分別從接種血、尿、痰標(biāo)本的瓊脂平板中挑取多個(gè)可疑菌落送成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序鑒定。實(shí)驗(yàn)室提取細(xì)菌DNA作為模板，引物為細(xì)菌16S rRNA通用引物[4]：27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，1492R：GGTTACCTTGTTACGACTT，目的片段長(zhǎng)度約1 500 bp，反應(yīng)參數(shù)：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃后延伸7 min。

1.2.4藥敏試驗(yàn) 用微量肉湯稀釋法測(cè)8種諾卡菌常用抗菌藥物的最小抑菌濃度(MIC)，包括阿米卡星、頭孢曲松、環(huán)丙沙星、亞胺培南、利奈唑胺、米諾環(huán)素、莫西沙星、復(fù)方磺胺甲惡唑，操作和判讀標(biāo)準(zhǔn)參照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI) M24-2A。設(shè)置陰、陽性對(duì)照，并按相同方法步驟進(jìn)行質(zhì)控菌的操作。35 ℃孵育3 d后讀取結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1患者情況 經(jīng)抗諾卡菌治療后，于2018年1月27日復(fù)查血常規(guī)WBC 14.87×109/L， Hb 87 g/L；CRP 33.1 mg/L；PCT 0.118 ng/mL；尿常規(guī)：紅細(xì)胞5/HP，白細(xì)胞5/HP，感染指標(biāo)較入院時(shí)明顯下降，且癥狀較前減輕，但1月31日患者要求自動(dòng)出院，囑其繼續(xù)抗感染治療，并定期門診隨訪以指導(dǎo)用藥，患者依從性差，未執(zhí)行。

2.2細(xì)菌培養(yǎng)及涂片染色結(jié)果 鏡檢發(fā)現(xiàn)革蘭陽性、分叉的樹枝狀菌體(圖2，B)，檢驗(yàn)者懷疑為諾卡菌感染，遂行改良抗酸染色(圖2,C)。分別將其血、尿、痰標(biāo)本的諾卡菌分離株接種于血瓊脂平板分離培養(yǎng)，35 ℃孵育2 d，觀察菌落形態(tài)見表面褶皺、干燥的圓形菌落(圖2,A)，不嵌入培養(yǎng)基生長(zhǎng)，挑取培養(yǎng)菌落進(jìn)行改良抗酸染色，呈弱抗酸性(圖2,D)。

2.3測(cè)序分析鑒定至種 PCR擴(kuò)增得到1 500 bp 左右的產(chǎn)物，經(jīng)BLAST比對(duì)分析PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)Nocardiacyriacigeorgica的16S序列(KY363801.1)相似度為99.93%，結(jié)果證實(shí)該患者血、尿、痰標(biāo)本中均含有蓋爾森基興諾卡菌。

2.4藥敏試驗(yàn)結(jié)果 結(jié)果顯示此株諾卡菌對(duì)上述8種抗菌藥物均敏感。

A.Colonies after incubating 48h；B. Sputum smear with Gram staining, ×1000；C. Sputum smear with Kinyoun’stain, ×1000；D.48h Colonies with Kinyoun’stain, ×1000圖2 諾卡菌菌落形態(tài)及鏡檢結(jié)果Fig.2 Colonial morphology of Nocardia and the result of smear detection

3 討 論

諾卡菌可引起各種臨床感染，從皮膚和軟組織感染到呼吸道、中樞神經(jīng)等全身各個(gè)系統(tǒng)的感染，以肺部感染最為常見。諾卡菌呼吸道定植的重要危險(xiǎn)因素有支氣管擴(kuò)張或其他結(jié)構(gòu)性肺疾病[5]，易感人群為免疫功能低下或合并有慢性基礎(chǔ)疾病的患者，如長(zhǎng)期應(yīng)用免疫抑制劑的患者，獲得性免疫缺陷綜合征、糖尿病、慢性阻塞性肺病等患者[6]，健康人群仍存在感染風(fēng)險(xiǎn)。諾卡菌病的肺部臨床表現(xiàn)主要為咳嗽、發(fā)熱、胸痛等非特異性感染的癥狀，實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)結(jié)果中常有中性粒細(xì)胞、CRP、血沉等感染指標(biāo)升高，影像學(xué)檢查亦缺乏特異性改變，可有滲出、空洞、實(shí)變、結(jié)節(jié)、胸腔積液等一種或多種表現(xiàn)。諾卡菌病與普通細(xì)菌、真菌感染有相似之處，且涂片呈弱抗酸性易與結(jié)核分枝桿菌相混淆，常被誤診以致延誤最佳治療時(shí)機(jī)。因此對(duì)于經(jīng)驗(yàn)性抗一般細(xì)菌、抗真菌或抗結(jié)核治療無效且存在以上危險(xiǎn)因素的肺部感染患者，應(yīng)考慮到此菌感染的可能。

諾卡菌繁殖速度慢，固體培養(yǎng)基上一般需3～5 d肉眼可見，而有些實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)時(shí)間不夠，或留取標(biāo)本前已使用抗生素，另外不合格痰標(biāo)本進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)，口腔菌群的迅速生長(zhǎng)使諾卡菌受到抑制，均可一定程度地影響細(xì)菌培養(yǎng)的陽性率，造成漏檢。因此對(duì)于可疑病例標(biāo)本，應(yīng)適當(dāng)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間，并在接種培養(yǎng)的同時(shí)進(jìn)行標(biāo)本的革蘭氏染色涂片鏡檢，當(dāng)標(biāo)本中有色素顆粒，取其用玻片壓碎涂片，并做革蘭氏染色，若發(fā)現(xiàn)革蘭氏染色陽性分支狀的長(zhǎng)桿菌應(yīng)高度警惕諾卡菌感染，繼續(xù)做弱抗酸染色，結(jié)果為革蘭染色及弱抗酸染色陽性時(shí)，可初步確定為諾卡菌。本例檢驗(yàn)科微生物室對(duì)細(xì)菌培養(yǎng)標(biāo)本進(jìn)行了常規(guī)的革蘭氏染色涂片鏡檢，減少了漏檢率，使臨床第4 d可以正確用藥，對(duì)疾病的診斷、治療、預(yù)后起到了非常重要的作用。Yasuo T對(duì)30份肺諾卡菌病臨床病例進(jìn)行了研究，革蘭氏染色對(duì)諾卡菌病的早期診斷和適當(dāng)治療是最重要的一步[7]。

北京大學(xué)第一醫(yī)院的黃磊等人在9年的時(shí)間里搜集了我國(guó)7個(gè)城市的53株諾卡菌進(jìn)行了分析，研究表明盡管其耐藥率在世界不同區(qū)域之間差異很大，磺胺類藥物仍是目前治療諾卡菌病的一線治療藥物，首選復(fù)方磺胺甲惡唑。研究結(jié)果顯示，在我國(guó)，阿米卡星、亞胺培南和利奈唑胺可作為初始經(jīng)驗(yàn)性治療諾卡菌病的替代用藥[8]。

綜上，諾卡菌病的診斷主要依靠實(shí)驗(yàn)室檢出病原菌，合格標(biāo)本的采集和革蘭氏染色涂片對(duì)諾卡菌病的早期診斷具有重要作用。不同種別的諾卡菌藥物敏感性有較大差異，建議進(jìn)行藥敏試驗(yàn)及精確鑒定以指導(dǎo)正確用藥，16S rRNA測(cè)序分析能快速、精確地將諾卡菌鑒定至種。本例病例中檢驗(yàn)科微生物室對(duì)細(xì)菌培養(yǎng)標(biāo)本常規(guī)地進(jìn)行了革蘭染色涂片鏡檢，故及時(shí)有效地檢出了諾卡菌，且通過16S rRNA測(cè)序分析鑒定此例為蓋爾森基興諾卡菌感染，以期為該細(xì)菌今后的研究提供臨床資料參考。

利益沖突：無

本文引用格式：孫菱,楊建科,郭桂英,等.1例蓋爾森基興諾卡菌血流感染病原學(xué)診斷報(bào)告[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào),2020,36(1):80-83. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2019.00.166