徐佩佩，丁細(xì)霞

基孔肯雅病毒(Chikungunya virus,CHIKV)為單股正鏈RNA病毒，包含2個開放閱讀框，分別編碼4種非結(jié)構(gòu)蛋白(nsP1-4)和5種結(jié)構(gòu)蛋白(C、E3、E2、6K、E1蛋白),根據(jù)E1氨基酸同源性被分為ECSA、亞洲、西非3種基因型[1]。CHIKV于1953年首次分離于坦桑尼亞，隨后在非洲、亞洲、歐洲散發(fā)，2005年留尼汪島的暴發(fā)波及138萬人，出現(xiàn)嚴(yán)重腦炎、出血熱而導(dǎo)致死亡率急劇上升，截止2013年基孔肯雅熱(Chikungunya fever,CHIKF)已播散至美洲?；颊咂鸩〕跗谥饕憩F(xiàn)為發(fā)熱、頭痛、肌痛、關(guān)節(jié)痛、皮疹、乏力等非特異性臨床癥狀，與登革病毒(dengue virus, DENV)、寨卡病毒(Zika virus, ZIKV)、黃熱病毒(yellow fever virus, YFV)、西尼羅病毒(west nile virus, WNV)感染早期癥狀相似，均以蚊子為傳播媒介，存在混合感染。且這幾種病毒感染的治療方法不同，尤其是對CHIKF有效的非甾體類抗炎藥被嚴(yán)禁于DENV感染，而高水平的炎癥細(xì)胞因子使15%～30%的CHIKF患者最終發(fā)展成關(guān)節(jié)畸形甚至死亡[2]。2009年WHO公布的東南亞CHIKV防控指南提出：診斷CHIKF至少具備以下一項：病毒分離陽性、CHIKV IgM抗體陽性、間隔至少3周的CHIKV IgG抗體滴度4倍升高和RT-PCR陽性，可通過噬斑減少中和試驗或血細(xì)胞凝集抑制試驗排除阿尼昂-尼昂病毒(O’nyong-nyong Virus，ONNV)或森林腦炎病毒等其他甲病毒或黃病毒感染[3]。2019年泛美抗風(fēng)濕聯(lián)盟聯(lián)合加勒比與安第斯風(fēng)濕病學(xué)會規(guī)定確診CHIKF的ELISA或RT-PCR試驗敏感性需高于74.2%且特異性高于88.4%[2]。本文將從病毒分離、血清學(xué)抗體檢測、抗原檢測、分子生物學(xué)檢測4個方面介紹CHIKF的實驗室診斷進(jìn)展(表1)。

表1 基孔肯雅熱診斷方法及其特征
Tab.1 Characteristics of diagnosis method for CHIKF

檢測方法標(biāo)本類型最佳檢測時限優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)參考文獻(xiàn)病毒分離血漿、血清,全血或組織發(fā)病3 d內(nèi)診斷金標(biāo)準(zhǔn);可對病毒株進(jìn)行溯源需在BSL-3實驗室中進(jìn)行;對實驗技術(shù)及設(shè)備要求高;無法早期診斷;敏感性低[4]抗體檢測血清或血漿IgM:發(fā)病第4 d到第2個月;IgG:發(fā)病第7 d到半年操作簡單、快速;成本低;無需特殊設(shè)備,適合大規(guī)模篩查與其他甲病毒、黃病毒屬存在交叉;IgM檢測不能區(qū)分急性感染與近期感染;無法早期診斷[4][5]抗原檢測血清或血漿發(fā)病10 d內(nèi)早期診斷方法;操作簡單、快速;成本低;適合大規(guī)模篩查僅適于早期檢測[6]分子生物學(xué)檢測血清、血漿或全血發(fā)病第1 d到第8 d早期診斷方法;可用于基因分型設(shè)備及價格昂貴;不適合大規(guī)模篩查;僅適于早期檢測[4]

1 病毒分離

病毒分離，是一種傳統(tǒng)的檢測技術(shù)，仍是目前診斷CHIKF的“金標(biāo)準(zhǔn)”。主要通過將病毒血癥患者的血液或感染組織接種于小鼠腦內(nèi)或接種于伊蚊細(xì)胞系(如C6/36、Aag-2)和其他病變效應(yīng)明顯的哺乳動物細(xì)胞系(如BHK-21，HeLa和Vero細(xì)胞)進(jìn)行分離[3]。不同基因型病毒對各種細(xì)胞敏感性存在差異，其中C6/36和BHK-21細(xì)胞較適合印度洋譜系CHIKV的分離；Aag-2、HeLa和Vero細(xì)胞較適合亞洲基因型CHIKV的分離[7]。盡管病毒分離的特異性高，同時可對所分離病毒株的來源及特征進(jìn)行鑒定，但其靈敏度低，對實驗技術(shù)、條件要求高，需要在生物安全3級實驗室進(jìn)行，且病毒分離時間長，不適合于CHIKF的快速早期診斷及基層單位的推廣應(yīng)用。

2 血清學(xué)抗體檢測

目前用于檢測CHIKV的抗體方法, 主要包括免疫印跡、間接免疫熒光法、ELISA、血凝抑制試驗(HI)、中和試驗及膠體金免疫層析法。其中,包被抗原的間接ELISA法與檢測IgM 和(或)IgG 的ELISA 捕捉法是檢測CHIKV最常用的抗體檢測方法。

2.1免疫印跡法 2016年，Yang等[8]以重組E2為檢測抗原開發(fā)了用于檢測CHIKV IgG的免疫印跡檢測試劑,其靈敏度為83.3%，特異性為96.7%。同年，Verma等[9]將重組E2應(yīng)用于免疫印跡以檢測10對血清樣本中的CHIKV IgM和IgG，準(zhǔn)確率達(dá)100%。但由于該方法的操作繁瑣，而很少應(yīng)用于臨床診斷。2019年泛美抗風(fēng)濕聯(lián)盟聯(lián)合加勒比與安第斯風(fēng)濕病學(xué)會發(fā)布的共識也未將免疫印跡法納入CHIKV的診斷標(biāo)準(zhǔn)[2]。

2.2間接免疫熒光法 間接免疫熒光法的應(yīng)用要求具備專業(yè)技術(shù)人員及相關(guān)設(shè)備。目前，歐盟已開發(fā)出診斷CHIKF的間接免疫熒光商品化試劑盒，該試劑盒在臨床應(yīng)用中也存在很多問題，部分樣本結(jié)果判定困難，主觀意識較強(qiáng)，需要重復(fù)檢測樣品較多。但目前美國疾控中心和加勒比公共衛(wèi)生署對該試劑盒檢測的準(zhǔn)確性評估分別為96%和97%[10]。

2.3ELISA法 ELISA是目前最常用于傳染性病原的抗原、抗體檢測方法，該方法具有良好的特異性和敏感性，操作簡單，適合于大規(guī)模篩查。近年來針對CHIKV抗體檢測的間接ELISA法主要以E2蛋白為靶標(biāo)抗原，但因E2蛋白存在較多的半胱氨酸殘基導(dǎo)致蛋白可溶性差，一般以基因重組的E2蛋白[9,11-12]較常用于抗體檢測。其中，F(xiàn)umagalli等[12]以重組E2開發(fā)的間接ELISA與Mayaro病毒、東部馬腦炎病毒、西部馬腦炎病毒、Mucambo病毒和Aura病毒均無交叉反應(yīng)，可用于Mayaro病毒與CHIKV共同流行區(qū)(如巴西等)作為鑒別診斷。美國疾控中心曾對2015年6月之前開發(fā)的6種CHIKV IgM捕獲ELISA商品化試劑盒進(jìn)行評估，發(fā)現(xiàn)歐盟和Inbios生產(chǎn)的試劑盒診斷準(zhǔn)確率分別為99%和100%，優(yōu)化后的Abcam試劑盒與疾控中心的診斷結(jié)果一致性高達(dá)99%，而另外3種試劑盒的敏感性均低于50%[13]。目前，也有報道應(yīng)用抗C蛋白單抗、E1單抗和E2單抗建立CHIKV IgM和(或)IgG捕獲ELISA法。其中，Damle等[14]首次應(yīng)用抗C蛋白IgG開發(fā)捕獲ELISA以診斷CHIKF，與辛德畢斯病毒無交叉反應(yīng)；Galo等[15]開發(fā)的IgM捕獲ELISA和競爭法ELISA均與DENV無交叉反應(yīng)。為了進(jìn)一步降低成本與加速檢測，Theillet等[16]把CHIKV IgM捕獲ELISA法的原理應(yīng)用于由自黏塑料與玻璃纖維紙組成的紙基分析裝置，上樣8～10 min后，檢測結(jié)果可由手機(jī)讀出，與ONNV無交叉反應(yīng)，但與DENV和ZIKV存在交叉反應(yīng)。為避免不同操作者采用手機(jī)讀取結(jié)果引起的偏差，Wang等[17]采用自制閱讀器開發(fā)了可同時診斷CHIKV和DENV IgM及IgG的側(cè)向?qū)游鲈囼?，診斷性能較市售快速診斷試劑盒高。

3 抗原檢測方法

目前尚未有商品化的CHIKV抗原檢測試劑盒，但關(guān)于CHIKV的抗原診斷方法的研究報道不少。由于E1為CHIKV相對保守的結(jié)構(gòu)蛋白，因此，檢測患者血清中E1抗原成為CHIKV抗原檢測試劑研究的靶標(biāo)。2015年，Okabayashi等[18]用E1單抗開發(fā)了診斷CHIKF的膠體金免疫層析法，敏感性為89.4%，特異性為94.4%，但待檢樣本中亞洲基因型較少。2018年，Huits等[19]增加亞洲基因型樣本，并使用同對單抗進(jìn)行免疫層析試驗，發(fā)現(xiàn)這對單抗對亞洲基因型CHIKV的檢測敏感性只有33.3%。為進(jìn)一步了解該方法對不同基因型檢測的差異性，Tuekprakhon等[20]對3種基因型CHIKV的E1氨基酸序列比對，發(fā)現(xiàn)配對單抗來源的ECSA型CHIKV在350位點(diǎn)處為谷氨酸，而亞洲型和西非型為天冬氨酸。并通過定點(diǎn)突變證實了該表位的突變是導(dǎo)致單抗結(jié)合能力下降的主要原因。為進(jìn)一步提高檢測方法的敏感性及對不同基因型的檢測差異性，Tuekprakhon等[21]重新以ECSA型和亞洲型CHIKV免疫小鼠制備獲得一批能夠同時檢測到3個基因型的CHIKV特異性單抗，且其中兩株抗E1單抗與DENV、ZIKV、辛德畢斯病毒、ONNV、羅斯河病毒、Mayaro病毒、西部、東部及委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒均無交叉反應(yīng)，有望發(fā)展出一種特異性的CHIKV抗原檢測試劑盒。

4 分子生物學(xué)檢測

4.1RT-PCR 近年來, 隨著分子生物學(xué)診斷方法的日益完善,各種RT-PCR方案已嘗試于病毒感染早期、抗體尚未出現(xiàn)時的檢測，其一般針對非結(jié)構(gòu)蛋白nsP1基因[22-23]及包膜糖蛋白基因[24-25]。CHIKV的RT-PCR通常應(yīng)用于發(fā)病2～6 d的血漿或血清標(biāo)本。最近發(fā)現(xiàn)全血也可作為標(biāo)本檢測，且診斷性能與商品化檢測試劑盒基本一致[26]；對于發(fā)病1周內(nèi)難以采集血液標(biāo)本的患者，可以唾液標(biāo)本代替檢測[27]；對于哺乳期患者，母乳標(biāo)本的檢測時限可延長至發(fā)病第23 d[28]；精液和尿液檢測時限還可延長至發(fā)病第30 d[29]。針對CHIKF與其他蟲媒病毒病共同流行的特點(diǎn)，Cecilia等[30]開發(fā)了可用于同時診斷CHIKV和DENV的多重實時RT-PCR，Liu等[22]和Calvo等[24]分別開發(fā)了可用于同時診斷CHIKV和ZIKV感染的一步法多重實時定量RT-PCR及同時診斷CHIKV、ZIKV與DENV的一步法多重RT-PCR。Giry等[25]針對DENV、鉤體病等在留尼汪島的交叉流行特點(diǎn)，開發(fā)了能同時區(qū)分CHIKV、DENV和鉤端螺旋體感染的一步法多重實時RT-PCR。最近，Wu等[31]開發(fā)了可用于同時診斷CHIKV、DENV、ZIKV和YFV的單管四重實時RT-PCR，該方法對CHIKV的檢測下限為11拷貝/反應(yīng)，與乙腦、乙肝、丙肝、腸道病毒71型、巨細(xì)胞病毒均無交叉，且與商品化試劑檢測結(jié)果相一致。Boga等[32]還開發(fā)了可用于同時診斷CHIKV、DENV、ZIKV、YFV和WNV的多重實時RT-PCR，該檢測體系的準(zhǔn)確率為94.4%，與蜱傳腦炎病毒和日本腦炎病毒均無交叉，這些多重RT-PCR試劑可用于疫區(qū)旅行者的感染篩查及常見蟲媒病毒的流行病學(xué)監(jiān)測。

4.2RT-LAMP 這是一種逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)的等溫擴(kuò)增技術(shù)，無需特殊儀器設(shè)備，只需水浴鍋或金屬浴，適合于基層醫(yī)療單位及出入境口岸等機(jī)構(gòu)使用。然而，早期的RT-LAMP試劑是2007年到2012年開發(fā)的，引物設(shè)計所能利用的信息有限。2018年，Lopez-Jimena等[33]利用NCBI數(shù)據(jù)庫中的110條CHIKV序列，通過LAVA軟件重新設(shè)計了靶向保守區(qū)域6K-E1的引物，開發(fā)了單管一步法實時RT-LAMP，力求涵蓋所有可能流行的CHIKV毒株，該法陽性預(yù)測值為97%，陰性預(yù)測值為100%，在標(biāo)本儲存條件不佳的情況下仍表現(xiàn)出較好的診斷性能。

4.3宏基因組測序 宏基因組測序是目前唯一能識別臨床樣品中所有潛在病原體的序列信息的診斷方法。2015年，Greninger等[34]首次將宏基因組納米孔測序與實時生物信息學(xué)分析應(yīng)用于CHIKF診斷，6 h內(nèi)即可完成檢測，但平均納米孔讀取錯誤率高達(dá)20.6%，與樣本間交叉污染有關(guān)。2016年，Sardi等[35]將宏基因組測序應(yīng)用于診斷CHIKV與ZIKV的共同感染。2018年，Kafetzopoulou等[36]成功將宏基因組測序應(yīng)用于CHIKV與DENV共同感染的鑒定。進(jìn)一步縮短文庫構(gòu)建時間、降低檢測閾值、優(yōu)化生物信息學(xué)工具、控制交叉污染與降低成本之后，有望將宏基因組測序應(yīng)用于基層醫(yī)療點(diǎn)的急性發(fā)熱性疾病的鑒別診斷與共同感染的鑒定。

綜上所述，鑒于CHIKV與其他蟲媒病毒感染存在相似的臨床癥狀，不同病毒感染的臨床治療方式存在差異。因此，方便、快捷的CHIKV實驗室診斷方法將有利于CHIKF的臨床診治。由于流行疫區(qū)往往存在幾種蟲媒病毒交替流行的特點(diǎn)，患者也可出現(xiàn)幾種病毒同時感染的可能。因此，近3年CHIKV在實驗室診斷方面主要致力于：制備特異性單克隆抗體建立ELISA法檢測IgM 和(或)IgG、針對保守區(qū)域開發(fā)敏感性高且涵蓋3種基因型CHIKV的抗原檢測試劑、開發(fā)可用于同時診斷CHIKV與其他蟲媒病毒感染的多重RT-PCR方法，以及簡化診斷方法與降低成本以促進(jìn)CHIKV診斷試劑在基層的推廣。盡管目前針對CHIKV開發(fā)的實驗室診斷方法已經(jīng)不少，但真正獲得生產(chǎn)許可的商品化診斷試劑為數(shù)不多，相對于昂貴的核酸檢測試劑，基于ELISA和膠體金免疫層析的IgM/IgG抗體和抗原檢測方法將是更好的選擇。

利益沖突：無

引用本文格式：徐佩佩，丁細(xì)霞.基孔肯雅病毒實驗診斷進(jìn)展[J].中國人獸共患病學(xué)報，2020，36(1):60-64. DOI: 10.3969/j.issn.1002-2694.2019.00.188