魏海潮，王 琳，趙 艷，張學星，胡鈺冰，張楊明慧，王慶輝，曹雅明

瘧疾是由瘧原蟲引起的一種嚴重的寄生蟲病，由感染的按蚊叮咬傳播[1]。至今，全球仍有2.19億瘧疾病例發(fā)生[2]。其中間日瘧原蟲(Plasmodiumvivax，P.vivax)是分布最為廣泛的瘧原蟲，尤其在東南亞地區(qū)普遍流行[3]。東南亞地區(qū)的瘧疾傳播主要集中在國際邊界，中緬邊境地區(qū)就是受威脅地區(qū)之一[4]，該地區(qū)是我國輸入性瘧疾的主要來源，對于我國瘧疾消除計劃的實施是一項復(fù)雜而嚴峻的挑戰(zhàn)[5]。近幾年，瘧原蟲的耐藥性和血液期疫苗候選抗原變異的問題使得制備新藥和開發(fā)有效的傳播阻斷疫苗(Transmission-blocking vaccines, TBVs)變得十分迫切。TBVs靶向瘧原蟲的有性階段[6]，如配子體階段，按蚊只有從受感染的宿主血液中攝取配子體才能導致瘧疾傳播[7]。P.vivax較早產(chǎn)生配子體，在感染者出現(xiàn)瘧疾癥狀之前即有傳播能力，更適合通過開發(fā)TBVs來阻斷其傳播。

Pvs48/45是間日瘧原蟲雌雄配子體表面蛋白，對雄配子受精發(fā)揮十分關(guān)鍵的作用。Pvs48/45屬于六-半胱氨酸(6-Cys)蛋白家族，由3個同名半胱氨酸富集結(jié)構(gòu)域(cysteine-rich domains, CRDs)組成：CRDI區(qū)(aa:26-194)，CRDⅡ區(qū)(aa:195-296)和CRDⅢ區(qū)(aa:297-415)[8]。早期對Pfs48/45的研究表明其單克隆抗體有效的阻斷了惡性瘧原蟲向按蚊的傳播[9]；膜喂養(yǎng)實驗表明，抗Pvs48/45小鼠血清顯著減少了在蚊子中腸發(fā)育的間日瘧原蟲卵囊的數(shù)量[8]；近期在大腸桿菌中構(gòu)建的重組Pvs48/45在小鼠和猴子體內(nèi)具有良好的免疫原性和傳播阻斷活性[10]。這些研究表明Pvs48/45是一種有前途的TBVs候選抗原。

基因的多態(tài)性是評估抗原能否作為疫苗研制靶點的關(guān)鍵。同一基因在不同地區(qū)的遺傳多樣性成為疫苗廣泛應(yīng)用的障礙。因此，對不同地區(qū)Pvs48/45多態(tài)性的分析，可顯著提升疫苗的研究進程。中緬邊境地區(qū)作為我國輸入性瘧疾的主要來源，尚未進行過Pvs48/45多態(tài)性的研究。本研究通過評估中緬邊境地區(qū)Pvs48/45開放閱讀區(qū)(open reading frame, ORF)和CRDs的遺傳特點，為Pvs48/45作為中緬邊境地區(qū)TBVs候選抗原提供有力的證據(jù)。

1 材料與方法

1.1研究地點和樣本采集 經(jīng)中國醫(yī)科大學倫理委員會批準，獲得了所有參與者或其監(jiān)護人知情同意后，本研究在中緬邊境的Laiza鎮(zhèn)瘧疾診所收集了當?shù)匾约爸苓叴迓洳∪说闹讣庋?，并制備濾紙血樣本。經(jīng)專業(yè)人士通過血涂片鏡檢和巢式PCR，確認單純間日瘧原蟲感染樣本39例，用于Pvs48/45基因多態(tài)性分析。

1.2Pvs48/45基因組DNA提取，擴增和測序 根據(jù)試劑盒說明書，使用TIANamp Blood Spots DNA Kit試劑(DP318-03,TIANGEN,中國)提取基因組DNA，巢式PCR擴增Pvs48/45的ORF(堿基位點：1-1353 bp；氨基酸位點1-450 aa)，特異性引物如下，F(xiàn)irst-PCR-F：5′-TCCTCTACACCGCTCTACCG-3′，F(xiàn)irst-PCR-R：5′-GTGAACCGCATAACTT-TCCC-3′；Nest-PCR-F：5′-GTTTAAACTTAAG-CTTATGTTGAAGCGCCAGCTCGC-3′；Nest-PCR-R：5′-GCCCTCTAGACTCGAGTCAGAAGTACAACAG GAGGAG-3′ 。使用具有強3′-5′校正活性的KOD plus DNA聚合酶(Toyobo，日本)進行擴增。First PCR和 Nest PCR分別在10 μL和30 μL的反應(yīng)體系中進行。反應(yīng)體系包含10×KOD-Plus-Neo buffer，2 mmol/L dNTPs，25 mmol/L MgSO4，100 μmol/L of each primer，0.6 units of KOD-Plus-Neo DNA polymerase，以及1 μL gDNA模板。First PCR的擴增條件為98 ℃ 10 s,55 ℃ 30 s,68 ℃ 1 min(30個循環(huán))，68 ℃ 5 min；Nest PCR將退火溫度調(diào)至62 ℃，循環(huán)數(shù)提高至35次。采用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)物；特異性擴增產(chǎn)物送華大基因測序，測序引物為Pvs48/45 seqF: 5′-GAACCATATTCTTACCTA-CC-3′，Pvs48/45 seqR: 5′-AGGAGCATTCTGCGGTCACG-3′。

1.3Pvs48/45基因序列組裝和多態(tài)性分析 測序獲得的DNA序列通過MEGA 4.0手動編輯組裝，并使用Clus-talW與Sal-I參考株(PlasmoDB: PVX_083235)進行比對。使用DnaSP v5.10估計分離位點數(shù)目(The number of segregating sites，S)，單倍型(The number of haplotypes，H)，單倍型多樣性(Haplotype diversity，Hd)及其標準差(Standard deviation，SD)，以及核苷酸多樣性(Nucleotide diversity，π)[11]。

1.4中性檢驗 為評估Pvs48/45基因的自然選擇模式，通過DnaSP v5.10分別從種內(nèi)和種間進行中性檢驗。使用Tajima’D 檢驗[12]，F(xiàn)u and Li’s F*檢驗和 Fu and Li’s D*檢驗[13]進行種內(nèi)評估。在中性選擇模式下，這些檢驗的期望值為零；正值提示人口瓶頸或平衡選擇；負值則提示人口擴增或方向選擇。以夏氏瘧原蟲(PCYB_121700)作為外群，通過McDonald-Kreitman(MK)檢驗評估Pvs48/45在種間的選擇模式[14]。MK檢驗將種內(nèi)非同義突變與同義突變的比率(Pn/Ps)與種間固定的非同義突變與同義突變的比率(Dn/Ds)進行比較[15]，Pn/Ps>Dn/Ds表示陽性選擇。利用Fisher’ exact test 對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，P<0.05為有統(tǒng)計學意義。

1.5種群分化 使用來自本研究的39例Pvs48/45序列以及從GenBank獲得的27例序列進行種群進化分析，這些序列來自泰國(n=12)、瓦努阿圖(n=9)和哥倫比亞(n=6)[7-8，15]。采用DnaSP v5.10估計Wright固定指數(shù)(FST)，以評估Pvs48/45在中緬邊境地區(qū)與其他間日瘧原蟲流行區(qū)的遺傳分化情況。FST解釋為低分化(>0)，中等分化(>0.05)和高分化(0.15-0.25)[15]。

1.6全球單倍型網(wǎng)絡(luò)分析 為了更直觀的比較Pvs48/45基因在中緬邊境地區(qū)的單倍型與其他地區(qū)的差異和系譜關(guān)系，采用NETWORK 4.6的中位數(shù)連接法構(gòu)建基于Pvs48/45序列的單倍型網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié) 果

2.1Pvs48/45基因的遺傳多樣性 與參考序列相比，我們在中緬邊境地區(qū)Pvs48/45序列中僅發(fā)現(xiàn)了6個突變位點，均為非同義突變(E35K，H211N，K250N，D335Y，A376T，K418R)(圖1A)。其中E35K 位于CRDI區(qū)；H211N，K250N位于CRDⅡ區(qū)；D335Y，A376T位于CRDⅢ區(qū)。H211N、K250N、K418R為固定突變(100%)，D335Y，A376T突變率分別大于60%和80%。基于突變位點，將Pvs48/45序列分為5個單倍型(圖1B)，頻率最高的是ENNYTR(56.41%)。有限的突變導致了Pvs48/45的核苷酸多樣性極低(π=0.00064)，CRDⅢ區(qū)表現(xiàn)出相對較高的多態(tài)性(π=0.00163),而CRDⅡ區(qū)完全保守(π= 0)(表1)。

2.2Pvs48/45基因的中性檢驗 種內(nèi)和種間中性檢驗的結(jié)果一致(表2)。Tajima’D 檢驗、Fu and Li’s F* 檢驗和 Fu and Li’s D* 檢驗結(jié)果均大于零，在Pvs48/45基因開放閱讀區(qū)分別為0.435、0.919、0.901；在CRDI區(qū)分別為0.187，0.567，0.530，在CRDⅢ區(qū)分別為0.442，0.774，0.785。MK檢驗結(jié)果顯示Pn/Ps均大于Dn/Ds,P值在ORF區(qū)為0.029；在 CRDⅠ和CRDⅢ區(qū)分別為0.190和0.103。

圖1 中緬邊境地區(qū)Pvs48/45序列突變位點及單倍型Fig.1 Mutations and haplotypes of Pvs48/45 sequences in the China-Myanmar border

表1 中緬邊境地區(qū)39例間日瘧原蟲分離株P(guān)vs48/45基因多態(tài)性分析
Tab.1 Polymorphism ofPvs48/45 gene in the China-Myanmar border

NSiteSHHd(SD)πORF391-1326350.633(0.069)0.00064CRDI3976-582120.267(0.081)0.00053CRDⅡ39583-888010.000(0.000)0.00000CRDⅢ39889-1245230.474(0.076)0.00163

N為基因序列數(shù)量； Site 為基因位點； S為分離位點； H為單倍型； Hd(SD)為單倍型多樣性(標準差)；π為核苷酸多樣性； ORF為開放閱讀區(qū)； CRD為半胱氨酸重復(fù)結(jié)構(gòu)域.

2.3種群分化Pvs48/45基因在中緬邊境地區(qū)與泰國幾乎沒有分化(FST=0.03)；而與哥倫比亞和瓦努阿圖種群之間呈高遺傳分化(FST>0. 50)(表3)。

2.4單倍型網(wǎng)絡(luò)分析 單倍型網(wǎng)絡(luò)圖顯示，在東南亞、美洲和大洋洲樣本中共有15種單倍型(圖2)，形成3個明顯的地理集群。中緬邊境地區(qū)有5種單倍型(H2、H3、H4、H5、H6)，其中H6為其特異的單倍型；H2為中緬邊境地區(qū)頻率最高的單倍型。中緬邊境與泰國地區(qū)具有較多相同單倍型，與美洲地區(qū)沒有相同單倍型，而與大洋洲只有一個相同的單倍型：H2。

表2 中緬邊境地區(qū)間日瘧原蟲分離株P(guān)vs48/45中性檢驗分析
Tab.2 Neutrality tests ofPvs48/45 in the China-Myanmar border

NTajima’DFu&Li’sPvPv/PcD*F*PsPnDsDnPORF390.4350.9190.90103123530.029①CRDI390.1870.5670.5300147100.190CRDⅡ39NANANA002721NACRDⅢ390.4420.7740.7850237160.103

Ps為種內(nèi)同義突變； Pn為種內(nèi)非同義突變； Ds為種間同義突變； Dn為種間非同義突變; ①P<0.05

表3 中緬邊境地區(qū)與不同流行區(qū)間日瘧原蟲種群Pvs48/45基因的遺傳分化程度(FST)
Tab.3 Genetic differentiation (FST) ofPvs48/45 gene in the China-Myanmar border and otherPlasmodiumvivaxepidemic regions

中緬邊境泰國哥倫比亞瓦努阿圖中緬邊境----泰國0.03---哥倫比亞0.710.56--瓦努阿圖0.570.450.80-

圖2 間日瘧原蟲流行區(qū)Pvs48/45基因的單倍型網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 Haplotype network map of Pvs48/45 gene

3 討 論

瘧疾疫苗是阻斷瘧原蟲傳播的重要手段之一。理想的瘧疾疫苗主要靶向能夠誘導強免疫應(yīng)答的保守靶位。與紅前期和紅內(nèi)期疫苗相比，TBVs因具有較低的基因多態(tài)性而受到研究者的關(guān)注。配子體膜蛋白Pvs48/45是極具應(yīng)用前景的TBVs候選抗原之一。本研究分析了中緬邊境地區(qū)Pvs48/45基因的遺傳特點，并與已報道的全球不同區(qū)域的間日瘧原蟲株進行種群分析，評估Pvs48/45的遺傳分化特點，為以Pvs48/45為靶點的TBVs的研發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

與以往報道一致，Pvs48/45非常保守。我們在中緬邊境地區(qū)Pvs48/45 ORF中發(fā)現(xiàn)了6個非同義突變位點。其中 H211N ，K250N為全球性突變位點，且在目前報道的研究中均為固定突變，提示這兩種突變可能不會影響Pvs48/45在雄配子受精中的作用。在本研究中，H211N ，K250N是CRDⅡ區(qū)僅有的突變，所以在多態(tài)性研究中被識別為未突變位點，而導致無核苷酸多態(tài)性(π=0)以及無相應(yīng)的中性檢驗值。在中緬邊境地區(qū)發(fā)現(xiàn)的突變位點均是已報道過的突變類型，表明Pvs48/45在中緬邊境地區(qū)的高度保守性。有限的核苷酸多態(tài)性(π=0.00064)也說明Pvs48/45進化保守，這遠低于以往報道的Pvs48/45全球多態(tài)性(π=0.00173)[16]。在3個CRD區(qū)，CRDⅢ區(qū)的核苷酸多態(tài)性最高(π=0.00163)，CRDⅡ區(qū)最低(π= 0)。且CRDⅢ區(qū)的單倍型多樣性(Hd)也明顯高于其他兩個區(qū)(Hd=0.474)?？傊?，Pvs48/45核苷酸多態(tài)性在中緬邊境地區(qū)非常低， CRDⅢ區(qū)為基因中多態(tài)性相對較高的區(qū)域。

在種內(nèi)中性檢驗結(jié)果中，Pvs48/45基因全長以及CRD I區(qū)和CRDⅢ的檢驗結(jié)果均大于零；在種間檢驗結(jié)果中，這些基因片段的Pn/Ps 均大于 Dn/Ds，且在全長基因中具有顯著的統(tǒng)計學意義。這些結(jié)果均表明Pvs48/45基因處于平衡選擇，以維持基因在群體中的有限多態(tài)性。

種群分化結(jié)果顯示Pvs48/45在中緬邊境地區(qū)與東南亞國家(泰國)分化程度很低(FST=0.03)，這可能是由于地理上的接近；而與美洲地區(qū)(哥倫比亞)和大洋洲地區(qū)(瓦努阿圖)之間有著極高的分化水平，尤其與哥倫比亞地區(qū)FST大于0.7。由此表明瘧原蟲傳播具有地域局限性。3個明顯的地理集群也說明了這一點，在H1-H11中，除H1為美洲單倍型，其他均為東南亞特異性單倍型；H12和H13為大洋洲特異性單倍型；H14-H15為美洲特異性單倍型。中緬邊境地區(qū)有五種單倍型(H2、H3、H4、H5、H6)，其中H6為其特異的單倍型，但其所占頻率很低；H2為中緬邊境地區(qū)頻率最高的單倍型，且該單倍型在泰國也存在，因此，在東南亞流行區(qū)以H2為基礎(chǔ)的Pvs48/45疫苗有望成為有效的瘧疾傳播阻斷疫苗。

4 展 望

Pvs48/45基因在中緬邊境地區(qū)具有低水平的多態(tài)性，是一個正在經(jīng)歷平衡選擇的基因。CRDⅢ區(qū)為保守基因中的高多態(tài)區(qū)，因此可能為疫苗研制的重要靶點。Pvs48/45在全球具有較強的地理分化，進一步提示根據(jù)流行區(qū)的基因多態(tài)性特點開發(fā)高效疫苗的重要性。本研究為中緬邊境地區(qū)間日瘧原蟲傳播阻斷疫苗的研究和應(yīng)用提供理論參考。

利益沖突：無

引用本文格式：魏海潮，王琳，趙艷，等. 疫苗候選抗原Pvs48/45在中緬邊境的遺傳多樣性特點[J].中國人獸共患病學報，2020，36(1):07-11. DOI: 10.3969/j.issn.1002-2694.2019.00.187