王浩，賈婧怡，于曉瑾，張杉，張旭，陳江龍

國(guó)家食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)中心（北京 100094）

壬基酚（NP）是一種重要的精細(xì)化工原料和中間體，主要用于生產(chǎn)表面活性劑及抗氧化劑、紡織印染助劑、潤(rùn)滑油添加劑、農(nóng)藥乳化劑、樹脂改性劑、樹脂及橡膠穩(wěn)定劑等。目前，全世界壬基酚產(chǎn)量接近40萬(wàn) t。壬基酚是一種半揮發(fā)性有機(jī)化合物，易于在不同環(huán)境中遷移，廣泛存在于環(huán)境中。飼喂動(dòng)物的飼料、土壤和灌溉水源都有可能受到壬基酚污染，從而導(dǎo)致食品中壬基酚殘留。若長(zhǎng)期食用含有壬基酚的食品，可直接干擾內(nèi)分泌功能，導(dǎo)致性早熟、免疫力下降等，對(duì)嬰幼兒的正常發(fā)育影響尤為顯著。在缺少國(guó)家限量標(biāo)準(zhǔn)的情況下，相關(guān)監(jiān)管部門已將其作為風(fēng)險(xiǎn)因子進(jìn)行監(jiān)測(cè)，且規(guī)定了嬰幼兒配方乳粉中壬基酚殘留臨時(shí)限量值，為≤600 μg/kg。國(guó)家食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)中心依據(jù)此次試驗(yàn)方法對(duì)國(guó)內(nèi)116份常見食品（包裝飲用水、植物油、液體乳、飲料、面包、餅干、畜產(chǎn)品、水產(chǎn)品、果蔬、嬰幼兒配方乳粉、嬰幼兒配方米粉及嬰幼兒果泥等）進(jìn)行檢測(cè)，共檢出109份陽(yáng)性樣品，含量為2.1～479 μg/kg，檢出率為94.0%，說(shuō)明壬基酚殘留問(wèn)題在我國(guó)食品中普遍存在。因此，為給監(jiān)督執(zhí)法機(jī)構(gòu)提供強(qiáng)有力的技術(shù)支撐和依據(jù)，以便在最大程度上保護(hù)消費(fèi)者健康、維護(hù)我國(guó)產(chǎn)品在國(guó)際市場(chǎng)上的地位和信譽(yù)，開發(fā)簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、靈敏度高且適用于常見食品類的壬基酚殘留國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法具有重大的現(xiàn)實(shí)意義。

目前，測(cè)定壬基酚殘留的文獻(xiàn)比較多，方法主要是氣相色譜-質(zhì)譜法[1-3]、高效液相色譜法[4-6]和液相-質(zhì)譜聯(lián)用法[7-9]等。此次試驗(yàn)針對(duì)不同食品基質(zhì)特點(diǎn)，對(duì)樣品提取、凈化，色譜、質(zhì)譜條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了靈敏度高、操作簡(jiǎn)單且適用于各類食品中壬基酚殘留的準(zhǔn)確定性、定量分析方法。

1 試驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

甲醇、乙腈（色譜純，德國(guó)Fisher公司）；壬基酚、3, 5, 3-壬基酚-13C6（≥99%，Dr. Ehrenstorfer公司）；試驗(yàn)所選用樣品為國(guó)家食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)中心檢驗(yàn)樣品；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

Agilent 6410型串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀，配Agilent 1200型液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司）；GL-16G-II型離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；KQ-5200型超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；Milli-Q去離子水發(fā)生器（美國(guó)Milli-Q公司）。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱取10.0 mg（精確至0.1 mg）4-壬基酚標(biāo)準(zhǔn)品，置于50 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配成質(zhì)量濃度為200 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-18 ℃保存，存效期為6個(gè)月。

同位素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱取10.0 mg（精確至0.1 mg）3, 5, 3-壬基酚-13C6標(biāo)準(zhǔn)品，置于50 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配成質(zhì)量濃度為200 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-18 ℃保存，存效期為6個(gè)月。

標(biāo)準(zhǔn)中間液：準(zhǔn)確吸取0.5 mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，置于100 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配成質(zhì)量濃度為1.0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)中間液，于-18 ℃保存，存效期為3個(gè)月。

同位素內(nèi)標(biāo)中間液：準(zhǔn)確吸取0.5 mL同位素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，置于100 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配成質(zhì)量濃度為1.0 mg/L的同位素內(nèi)標(biāo)中間液，于-18 ℃保存，存效期為3個(gè)月。

標(biāo)準(zhǔn)系列工作液：分別準(zhǔn)確吸取10，20，50，100，200和1 000 μL標(biāo)準(zhǔn)中間液，以及200 μL同位素內(nèi)標(biāo)中間液，用乙腈稀釋并定容至10 mL。壬基酚質(zhì)量濃度依次為1.00，2.00，5.00，10.0，20.0和100 ng/mL，標(biāo)準(zhǔn)工作液中3, 5, 3-壬基酚-13C6質(zhì)量濃度為20 ng/mL?，F(xiàn)配現(xiàn)用。

包裝飲用水壬基酚標(biāo)準(zhǔn)系列工作液質(zhì)量濃度配制為0.025，0.050，0.10，0.20，0.50和1.0 ng/mL，標(biāo)準(zhǔn)工作液中3, 5, 3-壬基酚-13C6質(zhì)量濃度為20 ng/mL。現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3 色譜和質(zhì)譜分析條件

1.3.1 色譜分析條件

色譜柱：Hypersil GOLD C18柱，1.9 μ m，4.6 mm×50 mm，配備預(yù)柱。流速0.35 mL/min，柱溫25 ℃，進(jìn)樣量3 μL（包裝飲用水樣品，進(jìn)樣量50 μL）。流動(dòng)相，甲醇-水（10∶90，V/V）。

1.3.2 質(zhì)譜分析條件

離子源，電噴霧離子源（ESI）；掃描方式，負(fù)離子模式；檢測(cè)方式，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)；干燥氣，N2；霧化氣壓力，413.8 kPa；干燥氣溫度，340 ℃；干燥氣流速，8 L/min。

1.4 樣品處理

包裝飲用水：準(zhǔn)確稱取1 g（精確至0.01 g）試樣，加入20.0 μL同位素內(nèi)標(biāo)中間液，渦旋振蕩10 s，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。

液體乳、果汁等液態(tài)飲品：準(zhǔn)確稱取1 g（精確至0.01 g）試樣，置于5 mL玻璃離心管中，加入20.0 μL同位素內(nèi)標(biāo)中間液，渦旋振蕩10 s后，再加入乙腈3.0 mL（酸奶、果汁等酸性樣品加入2%氨水乙腈），加塞后劇烈振搖1 min左右，超聲提取10 min。吸取1 mL上清液，在4 ℃條件下以15 000 r/min離心5 min（如需要，可再離心1次），液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。

油脂類食品：準(zhǔn)確稱取1 g（精確至0.01 g）試樣（固態(tài)試樣需60 ℃水浴液化），置于5 mL玻璃離心管中，加入20.0 μL同位素內(nèi)標(biāo)中間液，渦旋振蕩10 s后，再加入3.0 mL乙腈，加塞后用手劇烈振搖1 min左右，靜置30 min，待分層后，吸取1 mL上清液，在4 ℃條件下以15 000 r/min離心5 min（如需要，可再離心1次），液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。

面包、餅干、大米、面條等谷物及其制品：準(zhǔn)確稱取1 g（精確至0.01 g）試樣，置于10 mL玻璃離心管中，加入20.0 μ L同位素內(nèi)標(biāo)中間液，再加入4.0 mL 70%乙腈水溶液（面包樣品加入6.0 mL），渦旋振蕩30 s后，超聲提取40 min。吸取1 mL上清液，在4 ℃條件下以15 000 r/min離心5 min（如需要，可再離心1次），液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。

豬肉、魚肉等動(dòng)物源性食品：準(zhǔn)確稱取1 g（精確至0.01 g）試樣，置于5 mL玻璃離心管中，加入20.0 μL同位素內(nèi)標(biāo)中間液，再加入4.0 mL乙腈，渦旋振蕩10 s后，超聲提取40 min。吸取1 mL上清液，在4 ℃條件下以15 000 r/min離心5 min（如需要，可再離心1次），液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。

胡蘿卜、蘋果等果蔬類食品：準(zhǔn)確稱取1 g（精確至0.01 g）試樣，置于5 mL玻璃離心管中，加入20.0 μL同位素內(nèi)標(biāo)中間液，再加入3.0 mL乙腈（蘋果等酸性水果樣品加入2%氨水乙腈），渦旋振蕩10 s后，超聲提取30 min。吸取1 mL上清液，在4 ℃條件下以15 000 r/min離心5 min（如需要，可再離心1次），液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。

乳粉（含嬰幼兒配方乳粉）：準(zhǔn)確稱取1 g（精確至0.01 g）試樣，置于10 mL玻璃離心管中，依次加入20.0 μL同位素內(nèi)標(biāo)中間液和2.0 mL 50 ℃左右熱水，渦旋振蕩10 s后，再加入4.0 mL乙腈，加塞后劇烈振搖至蛋白質(zhì)沉淀，超聲提取10 min。吸取1 mL上清液，在4 ℃條件下以15 000 r/min離心5 min（如需要，可再離心1次），液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。

米粉（含嬰幼兒配方米粉）：準(zhǔn)確稱取1 g（精確至0.01 g）試樣，置于10 mL玻璃離心管中，加入20.0 μL同位素內(nèi)標(biāo)中間液，再加入6.0 mL 50%乙腈水溶液，渦旋振蕩30 s后，超聲提取40 min。吸取1 mL上清液，在4 ℃條件下以15 000 r/min離心5 min（如需要，可再離心1次），液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。

嬰幼兒營(yíng)養(yǎng)果泥：準(zhǔn)確稱取1 g（精確至0.01 g）試樣，置于5 mL玻璃離心管中，加入20.0 μL同位素內(nèi)標(biāo)中間液，再加入3.0 mL 2%氨水乙腈，渦旋振蕩10 s后，超聲提取30 min。吸取1 mL上清液，在4 ℃條件下以15 000 r/min離心5 min（如需要，可再離心1次），液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理?xiàng)l件選擇

壬基酚是一種重要的精細(xì)化工原料和中間體，不溶于水，略溶于石油醚，溶于丙酮、四氯化碳、乙腈、乙醇和氯仿。在該方法所適用的食品基質(zhì)范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)組分對(duì)壬基酚提取、檢測(cè)產(chǎn)生最大干擾，比較上述這幾種有機(jī)試劑的除蛋白效果，發(fā)現(xiàn)乙腈既能有效提取壬基酚，又能去除樣品中蛋白質(zhì)，其余幾種去除蛋白效果不好，所以采用乙腈超聲提取目標(biāo)化合物。經(jīng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，對(duì)壬基酚進(jìn)行減壓旋蒸濃縮和氮吹濃縮時(shí)，目標(biāo)化合物低濃度時(shí)重現(xiàn)性比較差，所以不宜采取濃縮富集處理。由于食品基質(zhì)成分比較復(fù)雜，且普遍存在油脂成分，所以樣品前處理通常采用化學(xué)除油、過(guò)膜等凈化步驟。經(jīng)大量試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，很多溶劑（正己烷、乙酸乙酯等）、固相萃取柱、各種QuEChERS填料、各種濾膜均有壬基酚殘留，所以該方法不采用除油和過(guò)膜處理，最終采用4 ℃條件下以15 000 r/min后直接進(jìn)樣。同時(shí)通過(guò)大量試驗(yàn)優(yōu)化，最終確定3 μL進(jìn)樣量，且該方法規(guī)定色譜柱需要配保護(hù)預(yù)柱，這樣極大減小了測(cè)定液中雜質(zhì)對(duì)色譜柱的不良影響。標(biāo)準(zhǔn)起草單位用這種前處理方法每年完成3 000批次左右的壬基酚檢測(cè)任務(wù)，均未發(fā)現(xiàn)對(duì)色譜柱和質(zhì)譜有不良影響。

2.2 色譜條件選擇

2.2.1 色譜柱的選擇

該方法分別采用資生堂MGⅢ-C18色譜柱（150 mm×2.1 mm，1.8 μ m）、Hypersil GOLD C18色譜柱（50 mm×4.6 mm，1.9 μm）和Agilent Extend-C18色譜柱（150 mm×2.1 mm，5 μm）進(jìn)行分離試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)Hypersil GOLD C18色譜柱（50 mm×4.6 mm，1.9 μm）峰形及出峰時(shí)間較為合適。

2.2.2 流動(dòng)相的選擇

壬基酚為中等極性化合物，為了利于色譜峰的分離及峰型的改善，該方法的流動(dòng)相首先采用梯度洗脫，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以空白試劑為樣品會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性的情況。經(jīng)過(guò)反復(fù)試驗(yàn)，確定采用等度洗脫，流動(dòng)相為甲醇-水（10∶90，V/V）；流速為0.35 mL/min，出峰時(shí)間在4 min左右，5 min能完成1次樣品測(cè)定。結(jié)果見圖1。

圖1 壬基酚及其同位素內(nèi)標(biāo)的MRM 色譜圖

2.2.3 進(jìn)樣量選擇

為了減少測(cè)定液中雜質(zhì)對(duì)色譜柱影響，且確保目標(biāo)物的出峰時(shí)間、峰型、響應(yīng)強(qiáng)度達(dá)到最優(yōu)狀態(tài)，采用進(jìn)樣3 μL、配保護(hù)預(yù)柱。針對(duì)包裝飲用水樣品，為了提高樣品中壬基酚的檢出限，選擇進(jìn)樣50 μL。

2.3 同位素內(nèi)標(biāo)選擇

試驗(yàn)分別選取了氘代4-正-壬基酚和碳13標(biāo)記3,5, 3-壬基酚作為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行對(duì)比研究。具有直鏈結(jié)構(gòu)的氘代4-正-壬基酚，其碎片離子質(zhì)荷比為112，標(biāo)準(zhǔn)品4-壬基酚的碎片離子質(zhì)荷比分別為132.9和147。因此，二者母離子碎裂方式可能不同，且液相保留時(shí)間也不相同。這可能會(huì)造成目標(biāo)化合物在離子源中的離子化效率不同而影響定量結(jié)果。具有支鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)標(biāo)（碳13標(biāo)記3, 5, 3-壬基酚）的碎片離子與標(biāo)準(zhǔn)品4-壬基酚相同。所以碳13標(biāo)記的3, 5, 3-壬基酚可以更好地校正測(cè)定過(guò)程對(duì)目標(biāo)化合物的影響，更適合作4-壬基酚混合物標(biāo)準(zhǔn)品的內(nèi)標(biāo)。

2.4 質(zhì)譜條件優(yōu)化

采用直接進(jìn)樣方式分別將質(zhì)量濃度為100 ng/mL的壬基酚和3, 5, 3-壬基酚-13C6注入離子源中，在負(fù)離子掃描模式下進(jìn)行母離子全掃描，得到壬基酚和3, 5, 3-壬基酚-13C6的分子離子峰，分別為219.2和225.2。根據(jù)歐盟2002/657/EC指令規(guī)定對(duì)于質(zhì)譜確證方法必須達(dá)到4個(gè)確證點(diǎn)的要求，低分辨液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測(cè)應(yīng)在確定母離子的基礎(chǔ)上選擇兩個(gè)以上的子離子。以該離子峰為母離子，進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，最后采集全掃描的二級(jí)質(zhì)譜圖，得到碎片離子信息，然后再對(duì)得到的二級(jí)質(zhì)譜參數(shù)如破碎電壓、碰撞能量等進(jìn)行優(yōu)化，定性離子與定量離子產(chǎn)生的離子對(duì)強(qiáng)度比例達(dá)到最大時(shí)為最佳，得到壬基酚和3, 5, 3-壬基酚-13C6的最佳質(zhì)譜參數(shù)。壬基酚在碰撞能量分別為30和20 eV時(shí)，m/z132.9和m/z147.0碎片離子的強(qiáng)度比較大，因此選擇這兩個(gè)離子作為定量及定性的檢測(cè)離子。3, 5,3-壬基酚-13C6在碰撞能量為35 eV時(shí)，m/z139.1碎片離子的強(qiáng)度比較大，因此選擇這個(gè)離子作為定量檢測(cè)離子，結(jié)果見表1。

2.5 線性關(guān)系、檢出限及定量限

用標(biāo)準(zhǔn)系列工作液，分別進(jìn)樣3 μL（包裝飲用水樣品，進(jìn)樣量50 μL），測(cè)定結(jié)果經(jīng)線性回歸（y為峰面積，Counts；x為質(zhì)量濃度，μg/L），同時(shí)用選擇空白樣品，定量添加標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照方法中介紹的步驟操作，當(dāng)所得譜圖的信噪比大于3時(shí)，將此添加量定為最低檢出限；當(dāng)信噪比大于10時(shí)，將此添加量定為最低定量限，結(jié)果見表2。

表1 壬基酚和3, 5, 3-壬基酚-13C6的質(zhì)譜參數(shù)

表2 壬基酚的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)檢出限及定量限

2.6 方法的回收率和精密度

分別選取具有代表性的樣品進(jìn)行回收率與精密度試驗(yàn)。準(zhǔn)確稱取包裝飲用水、椰汁、植物油、餅干、魚肉、蘋果、嬰幼兒配方乳粉、嬰幼兒配方米粉、嬰幼兒營(yíng)養(yǎng)果泥等典型樣品各6份，每份1.0 g，共3組，分別定量加入4-壬基酚標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和內(nèi)標(biāo)物，因?yàn)榭紤]到很難找到陰性樣品，為了更好考察方法的回收率與精密度，加標(biāo)水平分別設(shè)定為10，20和100 μ g/kg，按樣品前處理進(jìn)行測(cè)定。試驗(yàn)結(jié)果表明，不同濃度平均加標(biāo)回收率為86.0%～114.3%，平均相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.8%～9.5%（n=6）。

表4 典型樣品基質(zhì)中壬基酚的加標(biāo)回收率和精密度

接表4

2.7 實(shí)際樣品檢測(cè)

使用該方法對(duì)市售的116份食品進(jìn)行了檢測(cè)，共檢出109份陽(yáng)性樣品，含量為2.1～479 μg/kg，檢出率為94.0%，其中嬰幼兒配方乳粉殘留量較高，但含量未超出我國(guó)臨時(shí)限量值（≤600 μ g/kg）。上述結(jié)果表明，我國(guó)食品中確實(shí)存在壬基酚殘留，其對(duì)消費(fèi)者健康存在的風(fēng)險(xiǎn)應(yīng)當(dāng)引起重視。

3 結(jié)論

根據(jù)實(shí)際樣品檢測(cè)數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)嬰幼兒營(yíng)養(yǎng)乳粉中壬基酚的檢出率較高，考慮到嬰兒配方乳粉是0～6個(gè)月齡的嬰兒的唯一食物來(lái)源，長(zhǎng)期食用含有壬基酚的乳粉對(duì)嬰兒的危害是極為顯著的，必須引起高度重視。此次試驗(yàn)所建立的高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法，實(shí)現(xiàn)了食品壬基酚殘留準(zhǔn)確測(cè)定，該方法為相關(guān)執(zhí)法監(jiān)督和食品生產(chǎn)企業(yè)質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)，為我國(guó)的食品質(zhì)量安全工作給予技術(shù)支持。