王春艷，袁毅，白雪梅

1. 貴州省糧油產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)站（貴陽(yáng) 550003）；2. 貴州省質(zhì)量發(fā)展服務(wù)中心（貴陽(yáng) 550003）

薏苡仁又名薏米仁、六谷子、川谷等，為禾本科植物薏苡[Coix lacryma-Jobi L. var. mayuen（Roman.）Stapf]干燥成熟種仁[1]，是中國(guó)出口的主要農(nóng)產(chǎn)品之一[2]，出口薏苡仁主要產(chǎn)于貴州、云南、廣西等地，貴州黔西南州興仁縣稱(chēng)為中國(guó)薏米之鄉(xiāng)。薏苡仁的營(yíng)養(yǎng)、抗癌藥效價(jià)值很高[3-7]，被譽(yù)為“世界禾本科之王”[2]。雖然薏苡仁中可溶性糖含量比較低，但可溶性糖含量對(duì)其品質(zhì)鑒定、加工利用以及遺傳育種、植株生長(zhǎng)有著極其重要的影響[8]。因此，測(cè)定薏苡仁中可溶性糖含量有重要意義。

可溶性糖通常是指葡萄糖、果糖等游離單糖及蔗糖等低聚糖[9]，易溶于水及乙醇溶液，是谷物中的重要組成成分，目前尚未有相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定薏苡仁中可溶性糖含量，常見(jiàn)可溶性糖測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)有NY/T 2742—2015《水果及制品可溶性糖的測(cè)定》3, 5-二硝基水楊酸比色法[10]和NY/T 1278—2007《蔬菜及其制品中可溶性糖的測(cè)定》銅還原碘量法[11]。尤亮亮等[12]做了銅還原碘量法測(cè)定玉米、小麥、高粱中可溶性糖含量的研究，由于3, 5-二硝基水楊酸法測(cè)定DNS試劑本身500 nm下有最大吸收，對(duì)結(jié)果干擾大，谷物中可溶性糖含量一般低于3%，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)可溶性糖研究，選擇蔬菜及其制品中可溶性糖的測(cè)定銅還原碘量法來(lái)測(cè)定薏苡仁中微量可溶性糖含量，并通過(guò)單因素試驗(yàn)考察薏苡仁提取最佳條件。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

樣品和標(biāo)準(zhǔn)品：薏苡仁采自貴州省黔西南州、安順市、盤(pán)州市，云南、廣西，共計(jì)35個(gè)樣品；葡萄糖（99.9%），天津普瑞邦公司提供。

1.2 試劑

酒石酸鉀鈉、無(wú)水碳酸鈉、氫氧化鈉、硫酸銅、無(wú)水硫酸鈉、碘化鉀、碘酸鉀、鹽酸、亞鐵氰化鉀、硫酸鋅、硫酸、草酸、硫代硫酸鈉，均為分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

500 mg/L葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱(chēng)取0.125 0 g于80℃干燥2 h的葡萄糖溶于水，定容至250 mL，現(xiàn)用現(xiàn)配。

堿性銅試劑：在1 L的燒杯中按順序溶解30.0 g酒石酸鉀鈉和30.0 g無(wú)水碳酸鈉于200 mL熱水中，再加入40 mL 1 mol/L氫氧化鈉溶液，將8.0 g硫酸銅溶于80 mL熱水中，邊攪拌邊加入到上述溶液中，然后煮沸消除溶存的空氣。將120 g污水碳酸鈉溶解于500 mL熱水中煮沸，冷卻后加入到上述銅溶液中。將8.0 g碘化鉀用少量煮沸的水溶解，加入到上述銅溶液中。然后煮沸過(guò)的水將燒杯中的溶液全部轉(zhuǎn)入1 L容量瓶中。準(zhǔn)確稱(chēng)取0.891 7 g于105 ℃烘2 h的碘酸鉀，用煮沸過(guò)的水溶解，并轉(zhuǎn)入上述容量瓶中。最后用煮沸并冷卻的水定容，過(guò)濾后備用[11]。

1.3 儀器與設(shè)備

CUTEL超聲波清洗器（上海冠特超聲儀器有限公司）；LW 20數(shù)顯恒溫水浴鍋（北京萊伯泰科技股份有限公司）；TDZS-WS臺(tái)式離心機(jī)（長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司）；3100波通旋風(fēng)磨（瑞典Perten公司）；TW 423電子天平（島津公司）；DK-98-Ⅰ恒溫水浴鍋（天津泰斯特儀器公司）；移液器（德國(guó)Eppendorf公司）。

1.4 試驗(yàn)方法

薏苡仁可溶性糖定量方法參照NY/T 1278—2007[5]《蔬菜及其制品中可溶性糖的測(cè)定銅》還原碘量法進(jìn)行。

1.4.1 薏苡仁的預(yù)處理

取500 g有代表性薏苡仁，清除雜質(zhì)，用四分法取樣，混勻，經(jīng)波通實(shí)驗(yàn)?zāi)シ鬯椋?0目），備用。

1.4.2 可溶性糖提取的單因素試驗(yàn)方法

1.4.2.1 提取溶劑的選擇方法

可溶性糖易溶解于水及乙醇，NY/T 2742—2015[10]、NY/T 1278—2007[11]以及相關(guān)測(cè)定可溶性糖的方法[13-19]中常用的提取溶劑為水和80%乙醇，故提取溶劑的考察選擇水和80%乙醇溶液。

取5 g（精確至0.001 g）薏苡仁細(xì)粉，置250 mL錐形瓶中，加100 mL提取溶劑，置于45 ℃水浴中振蕩提取60 min，冷卻后靜置。移液器吸取50 mL上清液于100 mL蒸發(fā)皿中，置于70 ℃水浴上蒸發(fā)除去乙醇，至3 mL左右，加入蛋白沉淀劑15%亞鐵氰化鉀溶液和30%硫酸鋅溶液各1 mL，搖勻。用蒸餾水洗入100 mL容量瓶中，定容過(guò)濾，取40 mL濾液于50 mL容量瓶中，加入1 mL 1 moL/L鹽酸溶液，沸水浴水解10 min，冷卻，加入2滴酚酞指示劑，用約0.5 mol/L氫氧化鈉中和至紅色，再用1 moL/L稀鹽酸調(diào)至紅色剛剛消失，定容，過(guò)濾備用；提取溶劑為水時(shí)，無(wú)需揮發(fā)，直接吸取50 mL上清液于100 mL容量瓶中，后續(xù)操作同加入蛋白沉淀劑一致。

1.4.2.2 提取方式的考察方法

可溶性糖的提取結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)方法[20-23]及文獻(xiàn)[8]，采用水浴振蕩提取和超聲提取。分別取兩組5 g薏苡仁細(xì)粉，置于250 mL錐形瓶，加入80 mL水，分別于45 ℃恒溫水浴振蕩和45 ℃超聲提取60 min，放冷，定容，混勻，靜置。取50 mL上清液于100 mL容量瓶中，加水至刻度，過(guò)濾，取40 mL濾液于50 mL容量瓶中，加入1 mL 1 moL/L鹽酸溶液，沸水浴水解10 min，冷卻，加入2滴酚酞指示劑，用約0.5 mol/L氫氧化鈉中和至紅色，再用1 mol/L稀鹽酸調(diào)至紅色剛剛消失，定容，即得供試品溶液，每組樣品取3份平行試樣。

1.4.2.3 不同提取時(shí)間的考察方法

分別取6份5 g薏苡仁細(xì)粉，置250 mL錐形瓶中，加100 mL提取溶劑，分別于45 ℃水浴中振蕩提取15，30，40，60，75，90，105和120 min，靜置冷卻。量取50 mL上清液置100 mL容量瓶中，照“1.4.2.2”項(xiàng)下自“加水至刻度”起處理樣品。

1.4.3 銅還原碘量法的方法學(xué)考察方法

1.4.3.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精確稱(chēng)取0.102 5 g干燥恒質(zhì)量（100 ℃）的葡萄糖，加適量去離子水的溶解，轉(zhuǎn)移至250 mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻，配成質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液，備用。

1.4.3.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的滴定

用移液管吸取0，1.0，2.0，3.0，4.0和5.0 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液于100 mL錐形瓶里，各加水至總體積5.0 mL，加入5.00 mL銅試劑，錐形瓶或試管口上加蓋小漏斗，用相應(yīng)的架子固定，置沸水浴中加熱15 min。取出后立即置于冷水中，冷卻至常溫，沿壁加入2 mL硫酸+草酸混合液，立即搖動(dòng)，使氧化亞銅沉淀完全溶解。當(dāng)用0.005 mol/L的硫代硫酸鈉工作溶液滴定至淺黃綠色時(shí)，加入約0.5 mL淀粉指示劑，滴定至藍(lán)色消失為終點(diǎn)。以空白試驗(yàn)與標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖液滴定值差為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

1.4.3.3 薏苡仁可溶性糖的測(cè)定方法

用移液管吸取1～5 mL濾液于錐形瓶中，加水至5.00 mL，加入5.00 mL銅試劑，以下按上述“1.4.3.2”標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作起操作，記錄滴定值V，同時(shí)以水代替試樣做空白，將空白試驗(yàn)與試樣滴定差值代入回歸方程即可求得試樣中可溶性糖質(zhì)量濃度（mg/mL），薏苡仁可溶性糖含量按式（1）計(jì)算。

式中：X表示樣品中可溶性糖的含量，%；A表示將空白與樣品滴定值差代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)求得樣液中葡萄糖的質(zhì)量，mg；m表示樣品質(zhì)量，g；V表示測(cè)定時(shí)吸取的樣液體積，mL；H表示樣品水分含量，%。

取兩次測(cè)定結(jié)果的平均值，計(jì)算結(jié)果保留到小數(shù)點(diǎn)后兩位。如試樣與銅試劑加熱反應(yīng)后，磚紅色氧化亞銅沉淀較多看不到藍(lán)色，則樣品含糖量偏高，可酌情吸取1～4 mL樣液，加水至5.00 mL測(cè)定，滴定值應(yīng)不高于標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的最高點(diǎn)。

1.4.3.4 精密度考察方法

選取黔西南州Q2018001、Q2018002樣品，按“1.4.2.1”項(xiàng)下方法制成樣品溶液，分別取2 mL濾液于150 mL錐形瓶里，照“1.4.3.2”項(xiàng)下“加水至5 mL”起依法測(cè)定硫代硫酸鈉消耗體積，同法平行操作6份，得出平均消耗體積，計(jì)算樣品含量及變異系數(shù)（%）。

1.4.3.5 樣品處理液穩(wěn)定性考察方法

取樣品水解液，過(guò)濾，在室溫下放置0，10，20，30和60 min，分別取2 mL濾液于150 mL錐形瓶里，照“1.4.3.2”項(xiàng)下“加水至5 mL”起依法測(cè)定硫代硫酸鈉消耗體積，同法平行操作3份，得出平均消耗體積。

1.4.3.6 加樣回收率考察方法

準(zhǔn)確稱(chēng)取12份同一份薏苡仁樣品，分4組，其中3組分別加入25，50和100 mg三個(gè)不同梯度的葡萄糖，按“1.4.2.1”項(xiàng)下方法制成樣品溶液，分別取2 mL濾液于150 mL錐形瓶里，照“1.4.3.2”項(xiàng)下“加水至5 mL”起依法測(cè)定硫代硫酸鈉消耗體積，同法平行操作3份，得出平均消耗體積，計(jì)算可溶性糖含量。

1.4.3.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)穩(wěn)定性考察方法

在間隔3個(gè)月后，重新配置葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“1.4.3.2”項(xiàng)下制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑及溫度的選擇結(jié)果

在45 ℃條件下，兩種提取溶劑測(cè)定薏苡仁可溶性糖含量結(jié)果見(jiàn)表1。兩種提取液對(duì)薏苡仁可溶性糖的測(cè)定結(jié)果相差不大，平行測(cè)定3次的結(jié)果差值為0.20%，絕對(duì)差值不超過(guò)算術(shù)平均值的5%。因此，水和80%的乙醇均可用于薏苡仁可溶性糖的提取。但提取溶劑為80%乙醇時(shí)，處理過(guò)程需要將80%乙醇水浴揮干，耗時(shí)長(zhǎng)約3 h；然而，當(dāng)提取溶劑為水時(shí)，不需要揮發(fā)，為節(jié)約處理樣品時(shí)間，提取溶劑選擇水。

由于薏苡仁中淀粉含量較高，平均約50%，淀粉不溶于冷水，在高溫高壓下易溶于熱水，參考GB 5009.7—2016[24]及GB/T 5513—2008[25]，含淀粉的食品測(cè)定還原糖時(shí)，提取溫度為45 ℃，因此薏苡仁提取溫度選擇為45 ℃。

表1 兩種提取液測(cè)定薏苡仁可溶性糖含量結(jié)果

2.2 提取方式的考察結(jié)果

超聲提取和水浴振蕩提取，薏苡仁可溶性糖含量平均值分別為：2.38%，RSD=4.20%（n=3）；2.48%，RSD=4.03%（n=3）。這兩種提取方式RSD值均小于5%，結(jié)果并無(wú)顯著性差異，由于超聲提取噪音較大，運(yùn)行時(shí)間超過(guò)1 h后，超聲波機(jī)體溫度升高，不利于提取溫度的控制，故提取方式選擇水浴振蕩。

2.3 不同提取時(shí)間的考察結(jié)果

由圖1可以看出，不同提取時(shí)間對(duì)薏苡仁可溶性糖提取有一定影響。提取時(shí)間在15～60 min范圍內(nèi)，可溶性糖含量隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而大幅度提高，60 min后趨于平穩(wěn)。這說(shuō)明隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，提取溶劑較好地滲入薏苡仁顆粒的組織和細(xì)胞中，使其充分溶脹，骨架結(jié)構(gòu)伸展，可溶性糖充分溶出，提取時(shí)間的延長(zhǎng)，其提取效率接近極限，不再增加。因此，水浴振蕩時(shí)間選擇60 min。

圖1 不同提取時(shí)間對(duì)薏苡仁可溶性糖含量的影響

2.4 方法學(xué)考察結(jié)果

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制與薏苡仁可溶性糖的測(cè)定結(jié)果

如圖2所示，經(jīng)Excel表格數(shù)據(jù)處理，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程y=4.902 9x+0.238 1，R2=0.998 8。結(jié)果表明葡萄糖含量在0～2.5 mg范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。

圖2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

2.4.2 薏苡仁可溶性糖的測(cè)定結(jié)果

根據(jù)以上單因素試驗(yàn)考察結(jié)果，薏苡仁中可溶性糖提取條件為：取5 g（精確至0.001 g）薏苡仁細(xì)粉，置250 mL錐形瓶中，加100 mL提取溶劑，置于45 ℃水浴中振蕩提取60 min，冷卻后靜置。移液器吸取50 mL上清液于100 mL容量瓶中，加入蛋白沉淀劑15%亞鐵氰化鉀溶液和30%硫酸鋅溶液各1 mL，搖勻，定容過(guò)濾，取40 mL濾液于50 mL容量瓶中，加入1 mL 1 moL/L鹽酸溶液，沸水浴水解10 min，冷卻，加入2滴酚酞指示劑，用約0.5 mol/L氫氧化鈉中和至紅色，再用1 mol/L稀鹽酸調(diào)至紅色剛剛消失，定容，過(guò)濾備用。按1.4.3.3測(cè)定計(jì)算結(jié)果，最終35批次薏苡仁可溶性糖含量見(jiàn)表2。

2.4.3 精密度試驗(yàn)結(jié)果

選取黔西南州Q2018001、Q2018002樣品，按照上述方法進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果表明，使用銅還原碘量法測(cè)定的結(jié)果具有良好的重復(fù)性，變異系數(shù)小于5%。

表2 薏仁米中可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù) %

表3 精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.4.4 樣品處理液穩(wěn)定性考察結(jié)果

精密吸取2 mL濾液在室溫下放置0，10，20，30和60 min，按照“1.4.3.2”項(xiàng)下“加水至5 mL”起依法測(cè)定硫代硫酸鈉消耗體積，結(jié)果顯示RSD為1.6%，表明樣品處理液在室溫下放置1 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.5 加標(biāo)回收率考察結(jié)果

準(zhǔn)確稱(chēng)取12份同一薏苡仁樣品，分成4組，其中1組為本底，2，3和4組各添加一定量的葡萄糖，每個(gè)水平重復(fù)3次，結(jié)果如表4所示?；厥章试?9.5%～95.4%之間，平均回收率為91.6%。

表4 加標(biāo)回收率結(jié)果

2.4.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)穩(wěn)定性考察結(jié)果

在間隔3個(gè)月后，重新配置葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，硫代硫酸鈉所耗體積與3個(gè)月前一致，表明銅試劑在3個(gè)月內(nèi)穩(wěn)定，重復(fù)測(cè)樣時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)可不用重新制作。

3 討論

含淀粉類(lèi)樣品測(cè)定可溶性糖時(shí)，提取溶劑多為80%的乙醇，但后續(xù)處理過(guò)程需要揮干乙醇，耗時(shí)較長(zhǎng)，試驗(yàn)選擇水為提取溶劑，無(wú)需揮發(fā)，減少試驗(yàn)操作時(shí)間。在間隔3個(gè)月后重新取銅試劑制作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，硫代硫酸鈉所耗體積與3個(gè)月前一致，表明銅試劑在3個(gè)月內(nèi)穩(wěn)定，重復(fù)測(cè)樣時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)可不用重新制作。

對(duì)于檢出限的確證，根據(jù)文獻(xiàn)[26]，檢出限大多是空白溶液的測(cè)試上線(xiàn)，即能與空白溶液有明顯差別。此次試驗(yàn)中空白溶液消耗硫代硫酸鈉的體積為22.0 mL，檢出限確證試驗(yàn)為：在100 mL水溶液中加入1 mg葡萄糖，按“1.4.2.1”項(xiàng)下方法制成樣品溶液，分別取5 mL濾液于150 mL錐形瓶里，按照“1.4.3.2”項(xiàng)下“加水至5 mL”起依法測(cè)定硫代硫酸鈉消耗體積，平行操作3份，消耗的硫代硫酸鈉體積分別為21.7，21.6和21.6 mL，與空白值22.0 mL有差異，因此，此方法對(duì)可溶性糖含量的檢出限為0.2 mg/g。

4 結(jié)論

通過(guò)單因素試驗(yàn)，優(yōu)化確定薏苡仁可溶性糖的最佳提取條件：取5 g薏苡仁細(xì)粉，置250 mL錐形瓶中，加100 mL水（提取溶劑），置于45 ℃水浴中振蕩提取60 min。并依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 1278—2007，探索銅還原碘量法測(cè)定薏苡仁可溶性糖含量的適用性，做方法學(xué)考察試驗(yàn)。結(jié)果表明，此方法靈敏度高，穩(wěn)定性強(qiáng)，重復(fù)性好，銅還原碘量法適用于薏苡仁可溶性糖含量測(cè)定。在此基礎(chǔ)上測(cè)定35批次薏苡仁可溶性糖含量，結(jié)果均在3%以下，且各地區(qū)薏苡仁可溶性糖含量不同，黔西南州薏苡仁可溶性糖含量最高值達(dá)到2.99%，安順和盤(pán)州兩地薏苡可溶性糖含量均在1%以下，省外云南、廣西兩地，由于樣品數(shù)量有限，代表性不強(qiáng)，需做進(jìn)一步樣品收集。研究為后續(xù)薏苡仁品質(zhì)資源開(kāi)發(fā)，標(biāo)準(zhǔn)制定奠定了基礎(chǔ)。