楊玉瑩，樸春紅，王玉華，劉俊梅，胡洋，唐玉芳

吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院（長春 130118）

蛋白質(zhì)非酶糖基化通常指在非酶促條件下，氨基酸或蛋白質(zhì)的游離氨基與葡萄糖（Glucose）或果糖（Fructose）等還原糖，經(jīng)縮合、重排、裂解、氧化修飾產(chǎn)生一系列穩(wěn)定產(chǎn)物的反應(yīng)，其終產(chǎn)物被稱為晚期糖基化終末產(chǎn)物（Advanced glycation end products，AGEs）[1-2]。高血糖糖尿病患者體內(nèi)的AGEs大量蓄積會(huì)引發(fā)糖尿病并發(fā)癥，如糖尿病性腎病、周圍神經(jīng)病變和心血管疾病等[3-6]。在食品加工中尤其是高溫和長時(shí)間反應(yīng)下產(chǎn)生的AGEs，可以被人體吸收，引發(fā)阿爾茨海默病等多種疾病[7]，受到廣泛關(guān)注[8]。

AGEs的生成機(jī)制復(fù)雜，產(chǎn)物也不同，具有交聯(lián)性或熒光性特性，一旦形成就不可逆，在人體內(nèi)以多種不同形式存在[9-11]。其反應(yīng)歷程可分為3個(gè)階段[12-13]：初期階段、中期階段和末期階段。目前，很多帶熒光性的AGEs已經(jīng)成為研究主流。還原糖-蛋白質(zhì)體系形成的AGEs能反映體內(nèi)糖基化反應(yīng)水平，常用于AGEs相關(guān)研究中。最為常見的糖基化體系中的還原糖為葡萄糖或果糖，蛋白質(zhì)為牛血清白蛋白（Bovine serum albumin，BSA），其反應(yīng)溫度為接近人體體溫37 ℃，時(shí)間為一般為4～12周[14-15]。由于反應(yīng)體系中含有較高濃度的糖和蛋白質(zhì)，且反應(yīng)時(shí)間較長，極易滋生細(xì)菌，因此培養(yǎng)時(shí)常加入疊氮化鈉（NaN3）達(dá)到抑菌的目的[16-17]。NaN3具有優(yōu)良的防腐殺菌性能，但尚未有報(bào)道表明其在非酶糖基化反應(yīng)進(jìn)程中是否影響模擬體內(nèi)真正的糖基化反應(yīng)進(jìn)程。微孔濾膜抽濾（Microaperture section filter，MSF）滅菌方式是最接近機(jī)體產(chǎn)生的AGEs的最優(yōu)滅菌方法。體內(nèi)AGEs的積累是一個(gè)長期而緩慢的過程，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長蛋白修飾程度增強(qiáng)，產(chǎn)生高度糖基化的AGEs[18]。試驗(yàn)采用MSF和NaN3滅菌方式，研究了兩種糖基化體系即葡萄糖-牛血清白蛋白（AGE-G-BSA）和果糖-牛血清白蛋白（AGE-F-BSA）反應(yīng)體系在1～6個(gè)月期間AGEs生成的情況以及AGEs特性的變化，為系統(tǒng)的研究AGEs提供可參考的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)試劑

葡萄糖、疊氮化鈉、L-賴氨酸、鄰苯二甲醛、β巰基乙醇，北京化工廠；D-果糖、牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品≥96%、Fructose Assay Kit，美國Sigma試劑公司；彩虹245廣譜蛋白Maker，北京索萊寶科技有限公司；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、BCA蛋白定量測定試劑盒，北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；葡萄糖測定試劑盒，上海榮盛生物技術(shù)有限公司。所有試劑純度均為分析純。

1.2 試驗(yàn)儀器

3K15離心機(jī)，美國Sigma公司；ZHWY-200 B恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司；SYNERGYHT多功能酶標(biāo)儀，美國伯騰儀器有限公司；FLUO star Omega全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀，德國BMG LABTECH；5800 MALDI-TOF/TOF基質(zhì)輔助激光質(zhì)譜儀，美國AB SCIEX；Mini-PROTEAN Tetra Cell小型垂直電泳槽，美國BIO-RAD；Mini BIS Pro以色列DNR凝膠成像儀，以色列DNR成像系統(tǒng)有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 疊氮化鈉條件下體外非酶糖基化體系的建立

參照Wang等[19]的方法，稍作修改。向5 mL質(zhì)量濃度為90 mg/mL的葡萄糖（Glucose，G）或果糖（Fructose，F(xiàn)）溶液中加入10 mL質(zhì)量濃度為10.00 mg/mL的BSA溶液，混合均勻后在37 ℃條件下避光反應(yīng)6個(gè)月，這期間分別在第1，第2，第3，第4，第5和第6個(gè)月取出部分樣品，暫存于-80 ℃。

1.3.2 微孔濾膜抽濾條件下體外非酶糖基化體系的建立

參照1.3.1采用微孔濾膜抽濾的方式對(duì)反應(yīng)試劑滅菌。具體為，采用不含NaN3的磷酸鹽緩沖液配置反應(yīng)試劑，隨后將反應(yīng)試劑依次通過孔徑為0.45和0.22 μm的微孔濾膜，混合均勻后在37 ℃條件下避光反應(yīng)6個(gè)月，這期間分別在第1，第2，第3，第4，第5和第6個(gè)月取出部分樣品，暫存于-80 ℃。

1.3.3 體系中AGEs含量的測定

利用熒光酶標(biāo)儀在增益50，激發(fā)波長355 nm，發(fā)射波長460 nm處測定體系的熒光值。同時(shí)以磷酸鹽緩沖溶液作為空白測定空白組熒光值。

1.3.4 AGEs分子量分析

使用BCA蛋白定量測定試劑盒測定樣品的蛋白濃度，確定樣品的稀釋倍數(shù)后分別進(jìn)行Native-PAGE電泳以及SDS-PAGE凝膠電泳[15,20]。

通過基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF/TOF）在正離子模式下選擇線性方法對(duì)體系蛋白分子量進(jìn)行分析[20]，試驗(yàn)產(chǎn)生的原始數(shù)據(jù)及圖譜由4000 Series Explorer V 3.5軟件導(dǎo)出。

1.3.5 AGEs還原糖測定

分別使用葡萄糖測定試劑盒（葡萄糖氧化酶-過氧化物酶法）及Fructose Assay Kit對(duì)體系中的葡萄糖、果糖含量分別進(jìn)行測定。

1.3.6 AGEs游離氨基測定

采用鄰苯二甲醛（OPA）法測定體系中游離氨基的含量[21-22]。取4.0 mL OPA試劑于試管中，加入200 μL樣品，對(duì)照組加入相同體積的蒸餾水，混合均勻后，在35 ℃水浴條件下反應(yīng)2 min，隨后利用酶標(biāo)儀測定體系在340 nm處的吸光度A340，以賴氨酸代替樣品采用相同方法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)曲線計(jì)算游離氨基含量。其計(jì)算公式如下：

式中：N為反應(yīng)后體系游離氨基濃度；N空白為空白組中游離氨基濃度。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

所有的試驗(yàn)均進(jìn)行3次重復(fù)，數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，利用Graphpad Prism 5軟件繪圖。利用SPSS Statistics 19軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理并檢驗(yàn)數(shù)據(jù)間的差異顯著性（p＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同滅菌方式對(duì)AGEs熒光值的影響

AGEs是一類復(fù)雜的混合物，其中含有大量的具有熒光交聯(lián)性的物質(zhì)，如戊糖素，因此熒光值成為AGEs量化的重要指標(biāo)[9,23]。兩種還原糖與BSA在1～6個(gè)月期間產(chǎn)生的熒光值的變化情況如圖1所示。總體上AGE-F-BSA體系的熒光值顯著高于AGE-G-BSA體系，該結(jié)果與李曉明等[24]的結(jié)論一致，證實(shí)了果糖更容易引發(fā)牛血清白蛋白糖基化而且反應(yīng)相對(duì)劇烈，可產(chǎn)生較多的AGEs。在AGE-G-BSA體系中，熒光值隨反應(yīng)時(shí)間的延長大體呈現(xiàn)增長趨勢，只是第5個(gè)月時(shí)略有下降，當(dāng)?shù)?個(gè)月時(shí)MSF滅菌條件下其熒光值為132 916.67±50.00（p＜0.05），為反應(yīng)1個(gè)月時(shí)的3倍以上（圖1A）。但是在AGE-F-BSA體系中，熒光值的變化與AGE-G-BSA呈現(xiàn)不同的趨勢，NaN3存在對(duì)其熒光值變化產(chǎn)生重大的影響，即無NaN3時(shí)，AGEF-BSA第3個(gè)月熒光值基本達(dá)到飽和，而NaN3存在條件下，熒光值呈現(xiàn)以3個(gè)月為周期的周期性變化（圖1B）。劉貴梅等[25]采用酪蛋白分別與甲基乙二醛、乙二醛在37 ℃條件下反應(yīng)，結(jié)果表明兩種體系的熒光值均在反應(yīng)第20天達(dá)到最大，而當(dāng)反應(yīng)進(jìn)行到30 d時(shí)熒光值顯著減少（p＜0.05），與研究結(jié)果有相似之處。這可能與非酶糖基化反應(yīng)復(fù)雜，部分反應(yīng)產(chǎn)物在達(dá)到一定反應(yīng)時(shí)間時(shí)發(fā)生了降解或熒光交聯(lián)鍵斷裂有關(guān)，具體原因還需進(jìn)一步探究。

兩個(gè)AGEs體系中，NaN3與MSF相比，其熒光值普遍較低，說明NaN3部分地影響了體系中AGEs的形成。又由于當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為1、3、6個(gè)月時(shí)體系的熒光值可以反映整體AGEs產(chǎn)生情況，在接下來的試驗(yàn)中為了簡化試驗(yàn)步驟，選擇了具有代表性的1、3、6個(gè)月的體系進(jìn)行進(jìn)一步研究。

圖1 非酶糖基化體系熒光值

2.2 不同滅菌方式對(duì)AGEs分子量的影響

AGEs的形成過程中會(huì)產(chǎn)生大量的交聯(lián)產(chǎn)物，導(dǎo)致分子量的增加[26-28]。用Native-PAGE（圖2A、B）及SDS-PAGE（圖2C、D）分析在不同滅菌條件下兩個(gè)體系中蛋白分子量的變化，發(fā)現(xiàn)三個(gè)時(shí)間段產(chǎn)生的AGEs與BSA相比無明顯變化，并未出現(xiàn)孔陽輝[26]，Kong等[29]報(bào)道中提到的97 kDa的片段。然而采用MALDITOF/TOF對(duì)蛋白分子量分析后發(fā)現(xiàn)，隨著反應(yīng)時(shí)間的增長，體系分子量逐漸增加，增加范圍為23.36～1 765.68 Da（見表1）。Nagai等[18]報(bào)道輕度糖基化的AGEs（培養(yǎng)24周）和高度糖基化的AGEs（培養(yǎng)40周）與BSA相比蛋白分子量分別增加了658和9 389 Da，與試驗(yàn)結(jié)果趨勢相似，表明隨著反應(yīng)時(shí)間的推進(jìn)其蛋白糖基化修飾程度也隨之增強(qiáng)。Annett[16]曾報(bào)道人血清白蛋白（HSA）與葡萄糖反應(yīng)一個(gè)月后，其分子量與初始分子量相比增加了4 169 Da，高于試驗(yàn)結(jié)果。這可能是HSA和BSA與還原糖結(jié)合的游離氨基數(shù)量不同以及結(jié)構(gòu)差異，導(dǎo)致糖基化程度不同。有趣的是，兩個(gè)體系、兩個(gè)滅菌方式對(duì)分子量的增加均呈現(xiàn)不同的趨勢。具體是，AGE-G-BSA體系的分子量均高于AGEF-BSA體系的分子量，MSF滅菌組的分子量高于NaN3滅菌組的分子量。在AGE-F-BSA體系中第1個(gè)月時(shí)的分子量甚至低于BSA。Annett[16]報(bào)道中提出熒光強(qiáng)度較高的體系其蛋白修飾水平并不高，這一現(xiàn)象與試驗(yàn)結(jié)果相似。這可能與非酶糖基化反應(yīng)過程中不同修飾劑與蛋白間反應(yīng)的比率不同有關(guān)。

2.3 不同滅菌方式對(duì)體系中還原糖含量的影響

還原糖的羰基是與蛋白的氨基結(jié)合生成熒光性AGEs的重要活性基團(tuán)，在AGEs生成過程中，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長果糖參加反應(yīng)不斷消耗導(dǎo)致果糖含量減少[30]。圖3為非酶糖基化體系中剩余葡萄糖含量的變化，AGE-F-BSA體系中剩余果糖含量與AGE-G-BSA體系中剩余葡萄糖含量趨勢基本一致，即在反應(yīng)時(shí)間為1個(gè)月時(shí)，兩個(gè)體系中NaN3和MSF條件下殘留還原糖含量均約為反應(yīng)初始質(zhì)量濃度（30.00 mg/mL）的2%，這表明非酶糖基化反應(yīng)在1個(gè)月時(shí)，其還原糖的利用已經(jīng)基本達(dá)到了飽和狀態(tài)，在隨后反應(yīng)時(shí)間為3、6個(gè)月的體系中，還原糖含量基本無顯著變化（p＞0.05）。這些數(shù)據(jù)表明添加NaN3并未顯著影響熒光性AGEs形成時(shí)還原糖的消耗進(jìn)程。

圖3 非酶糖基化體系葡萄糖含量

2.4 不同滅菌方式對(duì)體系中游離氨基含量的影響

BSA分子結(jié)構(gòu)中的游離氨基是熒光性AGEs生成所必須的活性基團(tuán)，BSA濃度越高，氨基基團(tuán)濃度越大，使得反應(yīng)物分子之間碰撞作用逐步增大加快反應(yīng)速率，導(dǎo)致熒光性AGEs大量積累，因此游離氨基含量的變化常被用來表示蛋白質(zhì)與糖接枝反應(yīng)的程度[30]。由圖4可知，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，AGE-G-BSA體系中的游離氨基逐漸減少，當(dāng)反應(yīng)6個(gè)月時(shí)，其游離氨基為反應(yīng)前BSA的10.3%（NaN3條件，圖4A）和6.4%（MSF條件，圖4B），而AGE-F-BSA體系中，當(dāng)糖基化反應(yīng)進(jìn)行到第1個(gè)月時(shí)，其游離氨基為原BSA的11.4%（NaN3條件，圖4C）和10.0%（MSF條件，圖4D），之后無顯著變化，且兩種滅菌條件下其變化趨勢一致。這種變化規(guī)律也與體系熒光值的變化趨勢一致（圖1），表明游離氨基的含量與熒光性AGEs的形成進(jìn)程密切相關(guān)，類似結(jié)果目前無相關(guān)報(bào)道。AGEG-BSA體系中MSF條件下的游離氨基均少于NaN3條件，說明NaN3對(duì)游離氨基的消耗有一定的制約作用。

3 結(jié)論

在1、3和6個(gè)月的BSA-還原糖非酶促反應(yīng)發(fā)生過程中，AGE-G-BSA體系的熒光值逐漸增加，葡萄糖和游離氨基隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加而逐漸減少；而在AGE-F-BSA體系中，MSF條件下果糖含量無明顯變化，體系的游離氨基含量在培養(yǎng)1個(gè)月時(shí)基本上達(dá)到最低，之后無顯著變化。對(duì)于不同滅菌方式而言，NaN3對(duì)體系產(chǎn)物的形成具有一定的影響，且在AGEG-BSA和AGE-F-BSA體系中表現(xiàn)形式并不一致。MSF滅菌方式下對(duì)反應(yīng)產(chǎn)生的AGEs并未見明顯影響，因此研究AGEs需要考慮NaN3對(duì)AGEs形成的影響因素。試驗(yàn)主要針對(duì)熒光性AGEs的特性進(jìn)行研究，并未涉及非熒光性AGEs。非熒光性AGEs，如羧甲基賴氨酸（Carboxy methyl lysine，CML），是主要的AGEs組分之一，是非熒光AGEs的代表，因此有必要對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)的評(píng)估，這將是下一步的研究內(nèi)容。