張 志,張麗麗,2,吳發(fā)興,劉 爽,董雅琴,張 慧,張 峰,崔 進(jìn),李曉成? (.中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心,山東 青島266032;2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院,山東 青島26609)

塞尼卡病毒(Senecavirus A,SVA)為單股正鏈不分節(jié)段的RNA 病毒,是小RNA 病毒科(Picornaviridae)的塞尼卡病毒屬的唯一成員[1]。與其他小RNA 病毒科的病毒類似,其直徑約為27 nm,基因組大小約為7.3 kb,SVA 的基因組由5′端、3′端和1個大的開放閱讀框架(ORF)組成,ORF編碼形成1個由2 181氨基酸組成的多聚蛋白前體,多聚蛋白前體可進(jìn)一步水解形成VP4～1等4個結(jié)構(gòu)蛋白和2A～2C、3A～3D 等7個非結(jié)構(gòu)蛋白[2]。2012年有學(xué)者發(fā)現(xiàn)SVA 可引起豬的水泡樣病變,感染豬的鼻吻部、蹄部冠狀帶等出現(xiàn)明顯水泡[3],自此以后,人們對SVA 逐漸重視,美國、加拿大、巴西、中國、泰國、哥倫比亞等養(yǎng)豬業(yè)比較發(fā)達(dá)的國家陸續(xù)也從出現(xiàn)水泡病的豬病料中檢測到SVA[4-8]。但是SVA 感染引起的病變在臨床上與口蹄疫(FMD)、豬水泡性口炎、豬水皰病、豬水泡性疹等疾病的病變十分相似[9],僅依靠臨床病變很難做出確診,迫切需要新的實驗室診斷方法。熒光RT-PCR 方法因其特異性強(qiáng)、敏感性高、重復(fù)性好的特點在獸醫(yī)領(lǐng)域廣為應(yīng)用,本研究在前期分離到1株SVA 的基礎(chǔ)上,設(shè)計不同的探針和引物,并經(jīng)過臨床應(yīng)用,建立了一種檢測SVA 的TaqMan探針熒光RT-PCR 方法。

1 材料與方法

1.1 樣品和病毒來源48份豬SVA 臨床樣品,采自我國部分屠宰場。SVA 病毒株GXT91,由本實驗室分離鑒定和保存。口蹄疫O 型RNA 提取自FMDV O 型滅活苗,豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬流行性腹瀉病毒等均由本實驗室保存。

1.2 主要試劑Premix 實時RT-PCR(探針法)試劑盒、Premix RT-PCR 一步法擴(kuò)增試劑盒、p MD-18T vector和DH5α感受態(tài)細(xì)胞為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品,病毒RNA 提取試劑盒(TRIzol)為Life公司產(chǎn)品。

1.3 引物設(shè)計和合成選擇GenBank上公布的我國SVA 流行毒株序列(KY419132)為參考序列設(shè)計引物,用于構(gòu)建SVA 的熒光RT-PCR 方法。上游引物為SVA-F:ctgcgctgggaccgtatctca;下游引物為:SVA-R:cgccgcgccacctcatt;熒光引物為SVA-P:5′-FAM-tcgccgtaagcgtgcaccgagacag-3′-BHQ1,引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。

1.4 樣品的處理和RNA 的提取將樣品稱重后加入4倍體積的PBS(0.01 mol/L,PH 7.2)進(jìn)行研磨,待樣品全部乳化后,以8 000 r/m 離心5 min,取上清液提取RNA。RNA 提取步驟按照TRIzol試劑盒的操作說明書進(jìn)行,最后加入適量無RNA 酶水溶解,置－70℃?zhèn)溆?。同時用SVA 病毒GXT91作為陽性對照,用PBS作為空白對照同步提取RNA。

1.5 陽性標(biāo)準(zhǔn)品的制備以引物SVA-F 和SVAR 作為擴(kuò)增引物,以SVA 流行病毒株GXT91提取的RNA 作為模板進(jìn)行RT-PCR 擴(kuò)增,然后將RTPCR 擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到p MD-18T 載體中,再轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞,藍(lán)白斑篩選,挑取陽性克隆測序、提取質(zhì)粒和測定濃度,并將此質(zhì)粒作為SVA 的陽性標(biāo)準(zhǔn)品,命名為pSVA-GXT91,用于后續(xù)熒光RT-PCR 試驗。

1.6 熒光RT-PCR 方法的建立用Premix 實時RT-PCR(探針法)試劑盒進(jìn)行SVA 的熒光RTPCR 擴(kuò)增,反應(yīng)體系為:12.5μL 2×Premix,1μL SVA-F 引 物(10 μmol/L),1 μL SVA-R 引 物(10μmol/L),1μL SVA-P 引物(5μmol/L),2μL樣品RNA 模板或陽性標(biāo)準(zhǔn)品,加水至25μL。RTPCR 的反應(yīng)程序為:42℃5 min,95℃預(yù)變性3 min,95℃8 s、60℃16 s,45個擴(kuò)增循環(huán),60℃讀取熒光。

1.7 標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增曲線的建立和敏感性試驗將pSVA-GXT91陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品從起始濃度為1.74×1010個分子/μL 開始,分別進(jìn)行10 倍倍比稀釋,然后以10－3～10－9等7個稀釋度作為模板進(jìn)行熒光RT-PCR 擴(kuò)增,確定熒光RT-PCR 的敏感性和最小檢測極限。并以各濃度得到的Ct值為縱坐標(biāo),以稀釋倍數(shù)的負(fù)對數(shù)作為橫坐標(biāo),制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,評價本方法的檢測效果。

1.8 特異性試驗以豬口蹄疫病毒、豬瘟病毒、豬呼吸與綜合征病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒等提取的RNA 作為模板,用已經(jīng)建立好的SVA 熒光RT-PCR 方法進(jìn)行擴(kuò)增,觀察本方法檢測其他病原時是否出現(xiàn)非特異性熒光反應(yīng),以評價本方法的特異性。

1.9 重復(fù)性試驗將已知濃度的pSVA-GXT91陽性標(biāo)準(zhǔn)品分別稀釋至10－5,10－6,10－7共3個梯度,分別進(jìn)行組間和組內(nèi)重復(fù)性試驗。組內(nèi)重復(fù)性試驗時,每個濃度分別用本方法重復(fù)檢測3次;組間重復(fù)性試驗時,分別在3次不同的時間用本方法重復(fù)檢測3次,最后對檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,評價本方法的重復(fù)性。

1.10 熒光RT-PCR方法的應(yīng)用采用建立的熒光RT-PCR 方法對從臨床采集的48份豬樣品進(jìn)行檢測,評價本方法在實際生產(chǎn)應(yīng)用中的可行性。

2 結(jié)果

2.1 pSVA-GXT91 陽性標(biāo)準(zhǔn)品的制備和濃度測定以本實驗室分離到的SVA 病毒株GXT91 提取的RNA 作為模板,用引物SVA-F 和SVA-R 進(jìn)行擴(kuò)增,可以擴(kuò)增到1 條大小為120 bp 的特異性條帶,該特異性條帶與p MD18-T 載體連接和轉(zhuǎn)化DH5ɑ感受態(tài)細(xì)胞后,經(jīng)藍(lán)白斑篩選和測序驗證,獲得了含有SVA 部分基因的陽性質(zhì)粒pSVAGXT91,調(diào)整質(zhì)量濃度為58.1 g/L,作為陽性標(biāo)準(zhǔn)品,同時將質(zhì)粒p MD18-T 空白載體也稀釋成58.1 g/L 作為陰性標(biāo)準(zhǔn)品。

2.2 熒光RT-PCR 方法的建立以提取的SVA RNA 為模板,用推薦的熒光RT-PCR 程序進(jìn)行擴(kuò)增,第1次擴(kuò)增即得到特異性的S 曲線,在此基礎(chǔ)上,對引物濃度、退火溫度和時間等逐步進(jìn)行組合比對,最后得到了最佳的反應(yīng)條件,即42℃7 min,95℃預(yù)變性2 min30 s,95℃8 s、60℃16 s;45個擴(kuò)增循環(huán),60℃讀取熒光,這時獲得的反應(yīng)結(jié)果最好。

2.3 SVA熒光RT-PCR 方法的特異性試驗在本方法建立的熒光RT-PCR 中,以SVA 病毒株GXT91提取的RNA 作為模板可以擴(kuò)增出1條特異性的“S”形曲線,而豬口蹄疫病毒、豬瘟病毒、豬呼吸與綜合征病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒等提取的RNA 模板均不能擴(kuò)增出特異性的條帶,表明本方法對SVA 具有較好的特異性(圖1)。

2.4 SVA熒光RT-PCR 方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線和敏感性試驗將質(zhì)量濃度為58.1g/L 的pSVA-GXT91陽性標(biāo)準(zhǔn)品10倍倍比稀釋后作為模板進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增,以10－3,10－4,10－5,10－6,10－7,10－8等不同濃度的反對數(shù)作為橫軸,以對應(yīng)的Ct值作為縱軸制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2),可以得到相關(guān)的回歸方程:Y＝3.630 9X＋5.130 3,相關(guān)系數(shù)R2＝0.999 1,這說明擴(kuò)增的Ct值與病毒的拷貝數(shù)之間呈現(xiàn)非常強(qiáng)的線性關(guān)系,表明本方法適應(yīng)范圍廣,不同濃度的模板使用本方法檢測都可以得到較好的試驗結(jié)果。

圖1 SVA 熒光RT-PCR 方法的特異性試驗結(jié)果

敏感性試驗中,當(dāng)模板的濃度稀釋為原始模板濃度的10－3,10－4,10－5,10－6,10－7,10－8和10－9時,對應(yīng)擴(kuò)增的Ct值分別為15.91,19.53,23.41,27.21,30.64,33.90和35.99,擴(kuò)增曲線仍然為1 條典型的“S”形擴(kuò)增曲線,但當(dāng)模板濃度稀釋為原始模板濃度的10－10時,熒光PCR 擴(kuò)增不出典型的“S”型曲線。這表明,本方法的檢測極限是樣品的10－9稀釋倍數(shù)(圖3)。

圖2 SVA 熒光RT-PCR 方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖3 SVA 熒光RT-PCR 方法的敏感性試驗結(jié)果

2.5 SVA熒光RT-PCR 方法的重復(fù)性用上述稀釋倍數(shù)為10－5,10－6,10－7的標(biāo)準(zhǔn)品作為模板進(jìn)行組間和組內(nèi)重復(fù)性試驗,統(tǒng)計分析顯示,3種不同濃度的樣品、3 次組間和組內(nèi)重復(fù)試驗的變異系數(shù)(CV)均小于2%,表明本方法的重復(fù)性較好(表1,圖4)。

表1 SVA 熒光RT-PCR 方法份重復(fù)性試驗結(jié)果

圖4 SVA 熒光RT-PCR 方法的重復(fù)性試驗結(jié)果

圖5 SVA 熒光RT-PCR 方法檢測臨床樣品的結(jié)果

2.6 熒光探針方法的應(yīng)用用本試驗建立的熒光方法對48份豬樣品進(jìn)行檢測,共有12份樣品擴(kuò)增出典型的“S”型曲線(圖5),與陽性樣品的結(jié)果一致,陽性率為25%,表明本方法完全可以用于臨床樣品的檢測。

3 討論

熒光PCR 方法是檢測核酸常用的方法,它具有敏感性高、特異性強(qiáng)、可重復(fù)性好的特點,在醫(yī)學(xué)、獸醫(yī)學(xué)以及生物學(xué)領(lǐng)域廣為應(yīng)用。本研究建立的用于檢測SVA 的TaqMan探針熒光RT-PCR 方法同樣具有上述特點,且本研究設(shè)計引物時選取的靶基因是SVA 的3D 基因,該基因編碼非結(jié)構(gòu)蛋白,屬于SVA 病毒株中最保守的區(qū)域,針對該區(qū)域建立的熒光PCR 方法覆蓋的毒株范圍更廣,檢測到的SVA病毒株更全面。在敏感性方面,本方法的檢測極限病毒拷貝達(dá)到了17.4個/μL,與其他病毒的檢測敏感性一致。特異性方面,由于條件所限,本實驗室沒有保存豬水泡性口炎、豬水皰病、豬水泡性疹等疫病的病原,因此僅選擇了口蹄疫病毒、豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬流行性腹瀉病毒等常見的幾種RNA 病毒作為參考病毒進(jìn)行特異性試驗,試驗結(jié)果顯示本研究建立的熒光RT-PCR 方法可以將SVA 與上述幾種豬病的病原鑒別開,表明本方法具有較強(qiáng)的特異性。組間和組內(nèi)的變異系數(shù)均小于2%,顯示本方法的重復(fù)性良好。以上研究表明,本研究建立的熒光RT-PCR 方法是一種較好的診斷SVA 的方法。

SVA 感染豬以后,有的毒株致病性較強(qiáng),可引起豬發(fā)生水泡樣病變、跛行和新生仔豬的突然死亡,其臨床表現(xiàn)與口蹄疫病毒、豬水泡性口炎病毒、豬水皰病病毒等引起的病變類似,僅靠臨床表現(xiàn)很難與這幾種病原進(jìn)行區(qū)別。而有的毒株致病性較弱,引起的臨床癥狀不典型。因此,SVA 的確診必須依靠實驗室診斷技術(shù)[10]。國內(nèi)外已經(jīng)用于SVA 診斷的實驗室技術(shù)包括病毒的分離培養(yǎng)、病毒中和、ELISA、普通的RT-PCR 方法和熒光PCR 方法等[11-14],這些方法在SVA 的診斷中發(fā)揮了重要作用。

同時,國內(nèi)也陸續(xù)發(fā)表了SVA 的診斷方法,樊曉旭等[15-18]先后建立了TaqMan熒光定量PCR 方法、重組酶聚合酶擴(kuò)增方法(RDA)及配套的側(cè)流層析試紙條檢測方法。本方法與其建立的TaqMan探針的熒光PCR 方法類似,而他們是以SVV-001參考毒株作為靶序列進(jìn)行引物設(shè)計的,但SVV-001已經(jīng)與目前的SVA 流行毒株存在一定的差異。因此用SVV-001作為靶序列建立的檢測方法在應(yīng)用中可能會存在假陰性的結(jié)果。另外,RDA 和側(cè)流層析試紙條的變異系數(shù)范圍分別為2.44%～14.95%和4.49%～9.73%,表明這些方法的穩(wěn)定性尚待進(jìn)一步改進(jìn)。而本研究的熒光RT-PCR 方法基于最近的SVA 流行病毒株,即本實驗室分離鑒定的SVA 流行病毒株GXT91的基礎(chǔ)上,不但彌補(bǔ)了該方法的不足之處,而且進(jìn)一步用48份臨床樣品進(jìn)行復(fù)核,結(jié)果表明該方法可以從中檢測出12份陽性樣品,表明本方法完全可以用于SVA 的流行病學(xué)調(diào)查和監(jiān)測等。到目前為止,對SVA 的傳播途徑、致病機(jī)制、組織分布等了解不多,本試驗建立的熒光RTPCR 方法對于了解SVA 的發(fā)病機(jī)制和流行病學(xué)研究具有重要意義。