宋朋杰,武小虎,張世棟,王東升,邵 丹,李亞娟,閆文軍,嚴作廷? (.中國農(nóng)業(yè)科學院 蘭州畜牧與獸藥研究所/農(nóng)業(yè)部獸用藥物創(chuàng)制重點實驗室/中國農(nóng)業(yè)科學院臨床獸醫(yī)學研究中心,甘肅 蘭州730050;.廣西大學 動物科技學院,廣西 南寧530000)

奶牛子宮內(nèi)膜炎多發(fā)于產(chǎn)后,奶牛分娩后子宮腔受到細菌污染,致病菌持續(xù)存在,突破機體的防御屏障引起子宮淺表炎癥,危及子宮正常功能,導致子宮疾病[1]。子宮細菌污染是導致不孕不育的1個關鍵原因,如果發(fā)現(xiàn)和治療不及時極易引起子宮病變,從而造成奶牛產(chǎn)犢期延長,產(chǎn)奶量下降,甚至不孕和死亡。給我國乃至世界奶牛產(chǎn)業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。正常母牛在懷孕之前必須排出胎衣、惡露,完成子宮復舊,子宮內(nèi)膜再生,恢復正常的卵巢活動周期[2]。如果產(chǎn)后病原菌排出不及時,極易引起子宮內(nèi)的炎癥,根據(jù)炎癥持續(xù)時間長短可分為子宮炎和子宮內(nèi)膜炎。在奶牛分娩1 周后子宮內(nèi)出現(xiàn)炎癥,陰道內(nèi)流出有清亮或伴有少量膿性分泌物的液體,但是在分娩21 d內(nèi)自愈的稱為子宮炎[3]。分娩后21 d或更長時間經(jīng)直腸觸診宮頸直徑大于或等于7.5 cm,陰道內(nèi)可檢測到膿性(膿性分泌物大于50%)分泌物,或26 d 后陰道內(nèi)可檢測到膿性黏液(膿性物約占50%)分泌物為子宮內(nèi)膜炎[4]。國內(nèi)外學者研究表明子宮內(nèi)膜炎的病原菌主要有大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、芽孢桿菌、化膿鏈球菌、無乳鏈球菌、化膿棒狀桿菌、擬桿菌和梭菌等[5]。目前臨床上對該病的治療還是以抗生素為主,但抗生素易產(chǎn)生耐藥性及藥物殘留,這就給下一步的治療帶來阻力。雖然純中藥制劑能防治奶牛子宮內(nèi)膜炎,但見效慢,給藥量難以控制,而且中藥有效成分提取過程繁瑣,成本高。由于微生態(tài)制劑綠色安全,無殘留、無副作用、成本低,是最理想的抗生素替代品之一。

1 奶牛子宮內(nèi)膜炎的發(fā)病機理

奶牛子宮內(nèi)膜炎是病原菌侵入子宮內(nèi)而引起的的子宮內(nèi)膜層發(fā)生的炎癥。部分革蘭陰性菌的菌毛、外膜蛋白以及緊密素等與子宮內(nèi)膜上皮細胞的受體相結合,子宮內(nèi)膜上皮細胞的模式識別受體(PRRs)如:TLRs(toll-like receptors)、NLRs(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors)等識別病原菌的特征性分子結構,激活體內(nèi)的免疫反應,如果子宮的解剖屏障和功能屏障以及特異性免疫和非特異性免疫不足以消滅病原菌的時候,這些病原菌就在子宮內(nèi)定植下來大量繁殖,釋放外毒素如細胞毒素、熱敏腸毒素、耐熱腸毒素等,對靶細胞產(chǎn)生毒性作用,引起子宮內(nèi)膜的炎癥反應,體內(nèi)IL-6、IL-18、IL-β、TNF-α等細胞因子含量升高。革蘭陽性菌能產(chǎn)生溶血素、凝固酶、耐熱核酸以及多糖抗原等毒力因子,常引起化膿性炎癥。一些革蘭陽性菌如金黃色葡萄球菌能產(chǎn)生抗原蛋白與IgG相結合形成具有抗逆性的復合物,抵抗吞噬細胞的吞噬、損傷血小板、引發(fā)過敏反應、促進細胞分裂等造成子宮炎癥反應的產(chǎn)生。免疫功能低下,BRODZKI等[6]對患有亞臨床子宮內(nèi)膜炎的奶牛進行研究,與健康正常分娩的奶牛相比患有亞臨床子宮內(nèi)膜炎的奶牛外周血和子宮沖洗液中巨噬細胞和單核巨噬細胞的含量顯著降低,并且CD4＋,CD14＋,CD25＋的含量也顯著降低,細胞免疫功能障礙可能是導致亞臨床子宮內(nèi)膜炎的主要因素。菌群失調,據(jù)報道產(chǎn)后不同階段健康和患子宮內(nèi)膜炎奶牛子宮菌群結構的演替規(guī)律,患病牛相關微生態(tài)菌群與正常奶牛相比菌群嚴重失調,一些厭氧的優(yōu)勢菌群如乳酸菌等所占比例明顯減少,菌群變化異常明顯[7]。SHELDON[8]認為雖然細菌感染是奶牛臨床子宮內(nèi)膜炎的主要原因但是產(chǎn)后營養(yǎng)不良、胎衣不下、代謝應激等是導致奶牛子宮內(nèi)膜炎重要因素,分娩后奶牛水鹽流失嚴重,機體虛弱對營養(yǎng)要求相對較高,如果不能及時補充則導致機體整體狀態(tài)下降,造成產(chǎn)后子宮疾病的發(fā)生。

2 微生態(tài)制劑的概念及種類

微生態(tài)學是德國RUSH 博士[9]1977年首次提出的一門新興學科,微生態(tài)制劑即微生態(tài)調節(jié)劑,能調整機體局部微生態(tài)失調,提高機體免疫力,由益生菌及其代謝產(chǎn)物經(jīng)特殊加工制成的一類生物制品。到目前為止微生態(tài)制劑可分為3 類:益生菌、益生元、合生元。國內(nèi)也研發(fā)出各種中草藥-微生態(tài)制劑。

2.1 益生菌制劑益生菌是世界所公認的綠色添加劑,常用的益生菌有:乳酸菌、雙歧桿菌、酵母菌、嗜熱鏈球菌、芽孢桿菌等[10]。益生菌具備以下特點:1.安全無致病性。2.對宿主有益生作用,無毒副作用。3.能在宿主胃腸道或者生殖道穩(wěn)定定殖和代謝。4.具有良好的抗逆性,在正常運輸過程中不會失活[11]。正常的皮膚、呼吸道、生殖道、腸道等常年定植著數(shù)以萬計的微生物菌群,他們相互作用,或免疫排斥或互利共生共同維持著機體的健康水平。當動物機體患病后一些部位的正常菌群會發(fā)生紊亂失調,尤其是發(fā)生在生殖道和腸道疾病時這種變化更加明顯[12]。將植物乳桿菌與枯草芽孢桿菌添加到犢牛飼料中,犢牛日增重提高了9.31%,7.33%,飼料轉化率降低11.47%,10.39%,但是隨著犢牛日齡的逐漸增加犢牛增重優(yōu)勢逐漸減弱[13]。魏娜[14]從健康仔豬中分離的乳酸菌用于預防仔豬細菌性腹瀉,改善仔豬斷奶應激反應,并且極大降低料肉比,顯著促進仔豬的生長。王恒毅等[15]對10 000只肉雛雞飼料里添加微生態(tài)制劑,與對照組相比試驗組肉雞存活率提高了0.2%,平均體質量增加了0.14 kg,料重比降低了0.06,具有很好的經(jīng)濟效益。

2.2 益生元益生元是不可被胃腸道消化的促進胃腸道及生殖道有益菌生長繁殖的有益物質[16]。益生元為益生菌提供生長所需的營養(yǎng)物資,抑制有害菌的生長,誘導激素分泌從而達到維持生殖道和腸道菌群平衡,增加機體免疫力促進免疫球蛋白的分泌,降低一些致病性大腸桿菌、沙門菌等致病菌的感染[17]。益生元大多數(shù)屬于非淀粉的低聚糖、多糖、多元醇、植物中藥提取物等。由于益生元體外加工提取步驟繁瑣,工藝復雜,成本較高,在獸醫(yī)臨床還很少應用。

2.3 合生元合生元是益生菌和益生元的組合,益生元容易被益生菌消化利用有助于益生菌的生存。合生元調節(jié)生殖道健康的功能主要包括抑制病原菌的定植和繁殖、調節(jié)生殖道菌群平衡、保護子宮內(nèi)膜和生殖道黏膜免疫屏障功能、提高機體免疫力、下調炎癥因子等,從而有益于宿主的健康[18]。

2.4 中草藥微生態(tài)制劑中草藥微生態(tài)制劑是在微生態(tài)學的理論指導下將中草藥或提取物與一種或多種益生菌共同發(fā)酵轉化成含有中藥活性成分或菌體代謝產(chǎn)物,能夠調節(jié)機體菌群平衡、抑制病原菌的生長繁殖、增強機體免疫力的新型微生態(tài)制劑。謝全喜等[19]研究發(fā)現(xiàn)鼠李糖桿菌和枯草芽孢桿菌發(fā)酵的中草藥制成新型中草藥微生態(tài)制劑能使黃羽肉雞抵抗大腸桿菌的感染,并且對脾臟和法氏囊發(fā)育沒有影響。于佳民等[20]發(fā)現(xiàn)中草藥復合微生態(tài)制劑對蛋雞急性肝臟損傷有很好的治療作用,能減少肉雞肝細胞壞死,降低血清轉氨酶活性。蔣小強等[21]研究發(fā)現(xiàn)中草藥紅茶菌具有多種抗口蹄疫的作用機制,對豬口鼻噴霧中草藥紅茶菌微生態(tài)制劑后可防止口蹄疫的傳播和發(fā)生,這對建立口蹄疫非免疫無疫區(qū)有很重要的意義。

3 微生態(tài)制劑防治奶牛子宮內(nèi)膜炎應用

目前國內(nèi)用于防治奶牛子宮內(nèi)膜炎的微生態(tài)制劑都在研發(fā)階段,市場上還未出現(xiàn)防治奶牛子宮內(nèi)膜炎效果較好的微生態(tài)制劑。研究發(fā)現(xiàn)患有臨床和亞臨床子宮內(nèi)膜炎奶牛的子宮微生物群多樣性很復雜,產(chǎn)后健康奶牛子宮內(nèi)以乳酸菌和不動桿菌為主,患病牛子宮中沒有發(fā)現(xiàn)乳酸菌的存在[22],菌群失調可能是奶牛子宮內(nèi)膜炎發(fā)病原因之一。PETER等[23]對產(chǎn)后24～30 d的56頭奶牛子宮灌注布氏乳桿菌,結果顯示與對照組的60頭牛相比子宮內(nèi)膜炎性因子IL-1β、IL-8等明顯降低,并且試驗組受孕率有所提高,布氏乳桿菌對改善子宮環(huán)境、對子宮良好的生殖功能具有促進作用。OTERO 等[24]從健康奶牛生殖道內(nèi)分離純化出76 株乳酸菌,76株乳酸菌中大多數(shù)都能抑制牛源大腸桿菌,少數(shù)能抑制患有奶牛子宮內(nèi)膜炎子宮分離出的產(chǎn)膿放線菌,通過篩選對奶牛子宮內(nèi)膜炎特異性病原體具有抑制作用的乳酸菌研制出1種防治奶牛子宮內(nèi)膜炎的微生態(tài)制劑。張志焱等[25]用微生態(tài)制劑對泰安地區(qū)患子宮內(nèi)膜炎的20頭奶牛進行治療,有效率95%,治愈率75%,具有顯著地治療效果。薛洋洋[26]從健康奶牛子宮內(nèi)分離出乳酸菌,制成微生態(tài)制劑,對10頭患病奶牛進行治療,治愈4頭、有效2頭,有效率達60%。

4 微生態(tài)制劑防治奶牛子宮內(nèi)膜炎機制探究

乳酸菌是益生菌的一種,它是健康奶牛生殖道、胃腸道、呼吸道內(nèi)的優(yōu)勢菌群,乳酸菌競爭性黏附在宿主細胞表面通過產(chǎn)生乳酸、過氧化氫、細菌素等來抑制或殺死病原菌從而達到抑菌目的[27]。近些年來微生態(tài)制劑在奶牛生殖疾病方面的研究和應用越來越熱,尤其是在改善生殖道微生態(tài)環(huán)境和飼料添加方向。

4.1 增強機體免疫力,降低炎癥反應按照傳統(tǒng)的觀點機體免疫系統(tǒng)的進化是為了阻止微生物的定植,但是在動物生殖道內(nèi)能耐受復雜的細菌共生,這些復雜的微生物可以從Ig A 中獲益以建立黏膜細菌群,他們與機體共生從而增強機體免疫力[28]。乳酸菌在體內(nèi)對先天性免疫進行調節(jié),通過NF-k B途徑和p38 MAP途徑激活機體先天免疫從而控制炎癥反應的發(fā)生[29]。劉明超[30]研究發(fā)現(xiàn)鼠李糖乳桿菌GR-1改善了大腸桿菌誘導的細胞超微結構破壞,從而降低了子宮內(nèi)膜上皮細胞凋亡的百分比,通過減弱My D88 依賴和My D88 獨立的通路激活限制炎癥反應。羅茜[31]研究發(fā)現(xiàn)微生態(tài)制劑可以維持腸道生殖道、微生物菌群平衡、增強免疫力、促進生長、防控疾病等益生能功。鼠李糖乳桿菌GR-1對大腸桿菌誘導的牛原代子宮內(nèi)膜上皮細胞損傷和炎癥具有保護作用,鼠李糖乳桿菌GR-1減少了大腸桿菌誘導的原代子宮內(nèi)膜上皮細胞超微結構的改變,限制了炎癥反應的產(chǎn)生,使細胞凋亡的百分比明顯下降[32]。鼠李糖乳桿菌、乳酸片球菌、羅伊乳酸桿菌和清酒乳酸桿菌能調節(jié)子宮內(nèi)膜上皮細胞被大腸桿菌感染后引起的炎癥反應,清酒乳酸桿菌和羅伊乳桿菌對預防大腸桿菌的感染有良好的作用(分別為87%,78%,P＜0.001),在鼠李糖乳桿菌的存在下大腸桿菌的感染明顯降低,與乳酸片球菌相比促炎細胞因子IL-8和IL-1β的表達顯著下降(P＜0.001),乳酸菌在調節(jié)牛子宮內(nèi)膜感染和限制炎癥反應具有明顯的作用[33]。孫海英等[34]研究復合微生態(tài)制劑對子宮內(nèi)膜炎家兔模型治療效果,微生態(tài)制劑治療組與對照組相比具有明顯的治療效果,與對照組相比炎癥反應明顯減弱,有效率達95%以上。G?RTNER 等[35]從健康奶牛子宮內(nèi)分離出乳酸桿菌,體外與子宮內(nèi)膜上皮細胞共同培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)乳酸菌存在的情況下子宮內(nèi)膜上皮細胞促炎性因子明顯減少。KUMMER 等[36]用篩選的2 株乳酸桿菌CCM 1753和G013對發(fā)情后8～12 d 的8頭奶牛進行子宮注射,在注射后的第6,12天進行子宮內(nèi)膜組織采樣,與空白對照組相比這2株乳酸桿菌對子宮內(nèi)膜的影響無顯著性差異,但各種免疫細胞的數(shù)目明顯增加,單核細胞的沉積導致子宮內(nèi)膜上皮細胞有明顯的細胞浸潤現(xiàn)象,肥大細胞和巨噬細胞浸潤也非常顯著,乳酸桿菌刺激機體產(chǎn)生細胞免疫,這2株菌對致病菌有明顯的抑制作用,有望用于臨床上對奶牛子宮內(nèi)膜炎的預防和治療。

4.2 黏附占位,維持菌群平衡黏附力的大小是評價1株益生菌很重要的標準之一,黏附力越強說明其在動物機體內(nèi)生存下來的可能性越大在,篩選益生菌的過程中,黏附性作為篩選乳酸菌的第1 步。目前研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌表面的黏附素即:脂多糖、肽聚糖、脂磷壁酸以及S-層蛋白等在黏附過程中起到一定的作用[37]。益生菌可以利用多種直接具有黏附功能的蛋白質而向生殖道黏附,如黏液結合蛋白、黏附素等,或來源于中間代謝產(chǎn)物的某些蛋白質參與黏附作用[38],益生菌與病原菌競爭性的與上皮細胞上的受體相結合使病原菌的感染量大大降低。健康產(chǎn)后奶牛陰道細菌菌群以乳酸菌為主,而患子宮內(nèi)膜炎的產(chǎn)后奶牛陰道菌群中沒有優(yōu)勢菌種,WANG等[39]檢測健康奶牛和患子宮內(nèi)膜炎奶牛陰道內(nèi)菌群多樣性,與健康奶牛相比,患子宮內(nèi)膜炎奶牛陰道菌群多樣性更強,缺乏優(yōu)勢菌種,正常菌群的破壞可能是子宮內(nèi)膜炎發(fā)病的原因之一。白東寧[40]研究發(fā)現(xiàn)3株乳酸菌(嗜酸乳桿菌、糞腸球菌、盲腸球菌)對拮抗大腸桿菌黏附子宮內(nèi)膜上皮細胞具有很好的效果,其中嗜酸乳桿菌對大腸桿菌的黏附拮抗作用最強,使大腸桿菌(C83903)的黏附率由38.33% 下降至9.95%,盲腸球菌和糞腸球菌對金黃色葡萄球菌的黏附率由86.18%降低到8.71%,8.63%,乳酸菌通過競爭黏附減少大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的感染具有很好的效果。

4.3 調節(jié)子宮、生殖道p H 值,抑制病原菌增殖

4.3.1 產(chǎn)乳酸、H2O2乳酸菌屬于乳酸菌屬,在健康動物的生殖道和胃腸道中已經(jīng)分離出產(chǎn)酸、產(chǎn)H2O2和細菌素的乳酸菌。奶牛子宮和陰道內(nèi)的乳酸菌通過產(chǎn)生乳酸、H2O2以及細菌素來抑制病原菌的生長,乳酸菌通過產(chǎn)生H2O2來激活腸道的過氧化物酶-硫氰酸鹽反應系統(tǒng),來參與腸道中抑菌的過程,這可能與乳酸菌產(chǎn)生的H2O2能夠調節(jié)PPAR-γ(過氧化物酶體增殖物激活受體)的活性,提高PPAR-γ的表達有關[41]。OTERO 等[42]從健康奶牛陰道內(nèi)分離的乳酸菌經(jīng)過檢測后發(fā)現(xiàn)這種乳酸菌能分泌酸和H2O2,并且具有良好的抑菌效果,對預防金黃色葡萄球菌感染就有良好的效果。子宮灌注大腸埃希桿菌引起的家兔子宮內(nèi)膜炎模型,臨床分離株唾液乳桿菌和魏斯菌組合治療家兔病理模型,有效率為80%,治愈率為60%,唾液乳桿菌和魏斯菌組合制備微生態(tài)制劑能夠用于防治臨床奶牛子宮內(nèi)膜炎[43]。GENíS等[44]對經(jīng)產(chǎn)的20 頭健康奶牛進行試驗,在3 周時間內(nèi)對10 頭奶牛陰道內(nèi)每周2次使用鼠李糖桿菌、乳酸片球菌和羅伊乳桿菌復合制劑,另外10頭用無菌生理鹽水以同樣的方法處理陰道,3 周后收集子宮分泌物,分析10個與先天免疫和感染有關的基因表達情況,結果顯示試驗組和對照組IL-8、IL-1β和IL-6的分泌差異不顯著,在奶牛陰道沒有感染的情況下乳酸菌組合物應用于陰道時無法到達子宮,無法調節(jié)子宮先天免疫,乳酸菌可能通過產(chǎn)生代謝物來調節(jié)陰道內(nèi)的致病環(huán)境從而達到抑菌的目的。

4.3.2 產(chǎn)細菌素 細菌素是某些乳酸菌在代謝過程中產(chǎn)生的具有抑菌活性的多肽或前體肽,通過靶細胞穿孔,耗散細胞膜質子移動勢,增加細胞膜通透性,形成孔洞,進而破壞細胞膜完整性,使小分子物質(K＋和無機磷離子)和大分子物質(ATP)同時泄漏并最終瓦解細胞,達到殺菌或者抑菌的目的[45]。乳酸菌細菌素主要對革蘭陽性菌有高效的抑制作用,乳酸菌細菌素通過與細胞膜受體特異性結合,促進細菌素在目標細菌的細胞膜上形成“核結構”,破壞細胞膜的完整性,造成目標細菌的質子動力的消散,從而達到抑菌的目的[46]。趙瑞香等[47]研究發(fā)現(xiàn)嗜酸乳桿菌產(chǎn)生的細菌素Lactobacillin-XH2作用于大腸桿菌后使菌體細胞變形,細胞膜通透性增大,胞內(nèi)大量K＋快速流失,使菌體代謝失常,最終導致死亡。趙圣明[48]從植物乳桿菌代謝物中分離出細菌素對芽孢桿菌具有明顯的抑制作用,經(jīng)細菌素處理后,蠟樣芽孢桿菌芽孢形成相關的重要調控基因sig E、sig F、sig K和sigG的表達下調,芽孢形成不同階段的芽孢形成基因rac A和cotE等也明顯的下調,該細菌素能明顯抑制蠟樣芽孢桿菌芽孢的形成。

5 展望

奶牛子宮內(nèi)膜炎一直阻礙著奶牛行業(yè)的發(fā)展,每年給全球造成巨大的經(jīng)濟損失,在畜牧行業(yè)抗生素作為主要的疾病治療藥物和飼料添加劑被廣泛使用。隨著抗生素的大量使用病原菌抗菌譜的不斷增大,耐藥基因逐漸增多,如何減少抗生素的使用、如何減少耐藥菌的產(chǎn)生,成為人們研究的熱點。子宮健康對奶牛成功繁育具有非常重要的意義,如何在減少抗生素使用的情況下控制奶牛子宮內(nèi)膜炎的發(fā)生成為奶牛行業(yè)研究的熱點。微生態(tài)制劑以新的理念和方法提出了一種全新的治療和防治策略,其無毒、無害等優(yōu)點日益受到科研工作者的重視。微生態(tài)制劑通過增強機體免疫力、與病原菌競爭性黏附占位、代謝產(chǎn)物抑制病原菌的生存繁殖等達到防治奶牛子宮內(nèi)膜炎的目的。許多益生菌代謝產(chǎn)物具有抑菌作用,比如細菌素、小分子肽等,如果能借助宏基因組、轉錄組、代謝組等多組學分析手段,利用基因工程菌將這些抑菌物質批量生產(chǎn),定會給奶牛業(yè)乃至畜牧養(yǎng)殖業(yè)帶來不可估量的經(jīng)濟效益。將益生菌和中草藥共同發(fā)酵,發(fā)揮益生菌無毒無殘留和中草藥無耐藥的特性,將成為研發(fā)新型、綠色微生態(tài)制劑的發(fā)展方向。

因此臨床篩選抗菌性強,黏附率高,安全性好的益生菌來降低預防和治療成本、控制耐藥基因產(chǎn)生、開發(fā)綠色全新型微生態(tài)制劑將是未來研究的主要方向。但是益生菌與子宮內(nèi)膜上皮細胞的黏附機制,一些細菌素、小分子肽抑菌機制尚不完全清楚,許多空白留待探索。研制一種理想的復合微生態(tài)制劑既能抑制子宮內(nèi)膜炎病原菌的感染又對奶牛無毒無害作用,具有很大的研究開發(fā)前景。一些微生態(tài)制劑的研究成果已經(jīng)在人醫(yī)臨床上展開應用,尤其在治療女性生殖道疾病和腸道疾病方面應用十分廣泛,并且取得患者的公認。劑鑒于國內(nèi)外微生態(tài)制劑的研究熱潮及微生態(tài)制劑在奶牛領域的研究越來越深入,我們相信通過微生態(tài)領域和奶牛領域的相互滲透,一定能研究出更好的微生態(tài)制劑,為奶牛行業(yè)、畜牧行業(yè)做出應有的貢獻。