王璐陽,曹樂天,王艷歌,崔朝輝,梁 楠,張龍現(xiàn) (河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 牧醫(yī)工程學(xué)院,河南 鄭州450046)

芽囊原蟲是一種常見的胃腸道寄生性原蟲,可以感染人類及非人靈長類,偶蹄類和鳥類等多種動(dòng)物[1]。芽囊原蟲的感染通常伴隨著其他人獸共患腸道寄生蟲的感染,如隱孢子蟲,賈第蟲等,其已經(jīng)被確認(rèn)為是引起腸易激綜合征(IBS)和惡心、腹瀉等臨床病癥的重要病原體[2]。與其他腸道寄生蟲類似,芽囊原蟲更容易感染免疫功能缺陷或者低下的人群,如艾滋病患者或者癌癥患者。報(bào)道顯示,相比于與動(dòng)物沒有密切接觸的人群來說,動(dòng)物飼養(yǎng)員具有更高的感染風(fēng)險(xiǎn)[3]。芽囊原蟲主要經(jīng)過“糞—口”途徑感染宿主,其感染在世界范圍內(nèi)均有報(bào)道,但其感染率在不同的地區(qū)具有顯著的差異[4]。在一些發(fā)達(dá)國家,人芽囊原蟲感染率為10%～15%,在一些欠發(fā)達(dá)地區(qū),其感染率高達(dá)55%～70%[5]。

近些年來,隨著分子生物學(xué)的發(fā)展,人們利用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)世界不同地區(qū)的人和動(dòng)物中分離出的芽囊原蟲基于核糖體小亞基(SSU r RNA)基因位點(diǎn)進(jìn)行亞型鑒定,發(fā)現(xiàn)其在宿主體內(nèi)表現(xiàn)出較高的遺傳多樣性[4]。目前已經(jīng)報(bào)道的有17個(gè)芽囊原蟲亞型(subtypes,STs),其中在人類中鑒定出的亞型有9種(ST1～ST9),在哺乳動(dòng)物和鳥類中共鑒定出17種芽囊原蟲基因亞型(ST1～ST17),其中8 種(ST1～ST8)被認(rèn)定為存在潛在的人獸共患風(fēng)險(xiǎn)[4]。ST1～ST3常見于非人靈長類動(dòng)物,ST1、ST5常見于偶蹄類動(dòng)物,ST6、ST7 常見于鳥類,而ST10、ST14常見于奶牛[5]。在我國,1990 年首次發(fā)現(xiàn)芽囊原蟲感染人類的病例,隨后在廣州地區(qū)非人靈長類動(dòng)物體內(nèi)也發(fā)現(xiàn)了芽囊原蟲的感染[6]。研究表明,?？梢愿腥径喾N人獸共患芽囊原蟲亞型。目前,在我國僅報(bào)道了黑龍江省奶牛芽囊原蟲感染情況[7-8]。本研究旨在了解廣州地區(qū)奶牛芽囊原蟲的感染情況及亞型分布,對(duì)評(píng)估奶牛芽囊原蟲的潛在人獸共患風(fēng)險(xiǎn)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集2016年4月從廣東省4個(gè)奶牛場或養(yǎng)殖基地共采集479份新鮮奶牛糞便樣品,其中從惠州散養(yǎng)戶采集82份,惠州龍華鎮(zhèn)采集107份,惠州龍門縣采集111份,深圳寶安區(qū)采集179份(表1)。通過直腸采集新鮮糞便樣品并分別收集到單獨(dú)的采樣袋中,并標(biāo)記采樣地點(diǎn)、品種、年齡等信息,低溫運(yùn)輸至河南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)寄生蟲學(xué)實(shí)驗(yàn)室,并置2.5%重鉻酸鉀溶液中4℃保存。

1.2 DNA提取與PCR擴(kuò)增取200～300 mg糞便樣品至1.5 m L 離心管中,加入1 m L 蒸餾水,3 500 r/min,離心5 min以洗去糞便樣品中的重鉻酸鉀,直至上清無色透明。之后嚴(yán)格按照美國OMEGA Bio-Tek公司的糞便樣品基因組DNA 提取試劑盒(E.Z.N.A Stool DNA kit,OMEGA)說明書步驟進(jìn)行操作,將提取的樣品DNA 置于－20℃保存,用于PCR 擴(kuò)增。

基于SSU r RNA 基因位點(diǎn)對(duì)芽囊原蟲進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,引物及反應(yīng)程序參照SCICLUNA 等[9]的報(bào)道。上游引物RD5：5′-ATCTGGTTGATCCTGCCAGT-3′；下 游 引 物 Bh RDr：5′-GAGCTTTTTAACTGCAACAACG-3′。試驗(yàn)中所用引物由上海生工生物工程有限公司合成。PCR 反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min,59℃退火1 min；72℃延伸1 min,循環(huán)30 次；72℃再延伸5 min。每個(gè)PCR 反應(yīng)均設(shè)置陽性和陰性對(duì)照。將PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳,置于紫外凝膠成像系統(tǒng)下進(jìn)行拍照觀察,擴(kuò)增產(chǎn)物目的片段長度約為600 bp。所有的PCR 陽性樣品擴(kuò)增產(chǎn)物送至北京諾賽基因有限公司,用ABI PRISMTM3730 XL DNA 測序儀進(jìn)行雙向測序。

1.3 序列分析與亞型鑒定測序完成后,使用chromas 2.6(http：//www.technelysium.com.au)和Clustal X 2.1(http：//www.clustal.org)軟件將測序得到的芽囊原蟲雙向序列進(jìn)行比對(duì)組裝,從而獲得校正序列。將校正后的序列在NCBI 中的GenBank 數(shù) 據(jù) 庫 中 進(jìn) 行BLAST 檢 索 (http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/),確定芽囊原蟲的基因亞型。使用MEGA 7.0(http：//www.megasoftware.net)軟件并采用鄰接算法(Neighbor-Joining,NJ)、自展值為1 000、Kimura-2參數(shù)模型基于SSU r RNA 基因位點(diǎn)構(gòu)建種系發(fā)育系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有統(tǒng)計(jì)分析均采用SPSS22(http：//www.winwrap.com/)版軟件,采用χ2檢驗(yàn)分析廣東省4個(gè)地區(qū)的奶牛場奶牛的芽囊原蟲在不同地區(qū)、年齡組的感染率的差異,P＜0.05表明差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 芽囊原蟲感染率在采集的479份糞便樣品中,有9份確定為芽囊原蟲陽性,廣東地區(qū)奶牛芽囊原蟲總感染率為1.88%(9/479)。其中,深圳寶安區(qū)芽囊原蟲感染率為3.91%(7/179),惠州龍門縣芽囊原蟲感染率為1.80%(2/111),惠州散養(yǎng)戶和龍華鎮(zhèn)養(yǎng)殖場未發(fā)現(xiàn)芽囊原蟲感染,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)各地區(qū)之間感染率差異顯著(P＜0.05)。對(duì)不同年齡段奶牛芽囊原蟲感染率分析發(fā)現(xiàn),斷奶后犢牛感染率(3.38%,7/207)顯著高于斷奶前犢牛感染率(1.61%,2/124)(P＜0.05)。在育成牛(0/69)和成年牛(0/78)中未發(fā)現(xiàn)芽囊原蟲的感染(表1)。

2.2 芽囊原蟲亞型鑒定基于SSU r RNA 基因位點(diǎn)對(duì)廣東地區(qū)奶牛芽囊原蟲序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),9份奶牛芽囊原蟲陽性樣品中,5份與GenBank數(shù)據(jù)庫中芽囊原蟲ST10亞型位于同一進(jìn)化支上,3份與GenBank數(shù)據(jù)庫中芽囊原蟲ST5亞型位于同一進(jìn)化支上,1份與GenBank數(shù)據(jù)庫中芽囊原蟲ST3亞型位于同一進(jìn)化支上(圖1)。表明本研究共檢測到3種芽囊原蟲基因型,分別為ST3(1/9)、ST5(3/9)、ST10(5/9),其中,ST10亞型為本研究中奶牛芽囊原蟲感染的優(yōu)勢亞型,ST3、ST5為人獸共患亞型。

圖1 基于SSU r RNA 基因位點(diǎn)的芽囊原蟲亞型NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹▲.深圳寶安區(qū)陽品樣品；●.惠州龍門縣陽性樣品

2.3 芽囊原蟲亞型分布在深圳寶安區(qū)奶牛場共檢測到3種亞型ST3、ST5、ST10,而惠州龍門縣奶牛場共檢測到2種亞型ST5、ST10,在惠州散養(yǎng)戶和惠州龍華鎮(zhèn)奶牛場未發(fā)現(xiàn)芽囊原蟲的感染。對(duì)不同年齡段奶牛芽囊原蟲亞型進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),斷奶前犢牛感染的人獸共患亞型為ST3,斷奶后犢牛感染的人獸共患亞型為ST5,ST10基因亞型在斷奶前犢牛和斷奶后犢牛均被發(fā)現(xiàn),見表1。

3 討論

芽囊原蟲廣泛寄生于人與動(dòng)物的胃腸道中,在世界范圍內(nèi)均有報(bào)道。由于芽囊原蟲具有廣泛的宿主范圍,且不同宿主來源的芽囊原蟲在形態(tài)學(xué)上缺乏獨(dú)特的特征,目前對(duì)芽囊原蟲的分類、致病性、基因分型和作用仍存在爭議[10]。近年來,基于芽囊原蟲在SSU r RNA 基因位點(diǎn)的遺傳多樣性研究,已經(jīng)積累了大量非人類宿主源芽囊原蟲STs數(shù)據(jù)。然而,國內(nèi)關(guān)于奶牛芽囊原蟲感染情況及遺傳多樣性研究缺乏數(shù)據(jù)支持,僅在我國東北地區(qū)有奶牛感染芽囊原蟲的報(bào)道[7-8]。因此,本研究以芽囊原蟲SSU r RNA 基因位點(diǎn)為靶點(diǎn),采用分子生物學(xué)方法對(duì)我國廣東地區(qū)奶牛芽囊原蟲的感染率和亞型分布進(jìn)行了調(diào)查。

表1 廣東地區(qū)部分奶牛場芽囊原蟲感染相關(guān)情況

研究結(jié)果顯示,廣東地區(qū)奶牛芽囊原蟲總感染率為1.88% (9/479),低于我國黑龍江地區(qū)(9.5%)[8],以及伊朗(9.7%)[11]和日本(54.1%)[12]等國家奶牛芽囊原蟲感染率。造成這種差異的原因可能與采樣季節(jié)、宿主年齡及地理區(qū)域有關(guān)。此外,相比于芽囊原蟲在我國黑龍江省綿羊(5.5%)、豬(8.8%)[8]及 陜 西 地 區(qū) 山 羊 (58%)[13]、豬(74.8%)[14]的感染率,廣州地區(qū)的奶牛芽囊原蟲感染率偏低,可能與不同宿主、生態(tài)環(huán)境及檢測方法等因素有關(guān)。研究表明,芽囊原蟲感染率在不同年齡段宿主之間存在較大差異[12]。本研究發(fā)現(xiàn),芽囊原蟲在犢牛中的感染率顯著高于育成牛及成年牛,且斷奶后犢牛芽囊原蟲感染率顯著高于斷奶前犢牛,這與ZHU 等[7]和WANG 等[8]的研究報(bào)道一致。

本次調(diào)查在廣東省奶牛中共檢測到3種芽囊原蟲亞型(ST3、ST5、ST10)。其中,ST3、ST5為人畜共患亞型,斷奶前犢牛檢測到2種亞型ST3、ST10,斷奶后犢牛檢測到2種亞型ST5、ST10,表明斷奶前后犢牛都能感染芽囊原蟲人獸共患亞型,ST10亞型廣泛分布于斷奶前后犢牛。在世界各地,也經(jīng)常有ST5、ST3亞型感染人的報(bào)道[15-16],以人源亞型ST3為主,ST5多見于牛、羊、豬和狗[17],提示該地區(qū)奶牛芽囊原蟲具有潛在的人畜共患風(fēng)險(xiǎn),需做好防控措施。此外,本次調(diào)查還發(fā)現(xiàn)ST10 亞型為奶牛感染芽囊原蟲的優(yōu)勢亞型,與ZHU 等[7-8,12]在中國黑龍江地區(qū)、丹麥和日本東部地區(qū)的研究結(jié)果一致,提示ST10亞型是奶牛感染優(yōu)勢基因亞型。

綜上所述,本研究首次對(duì)廣東地區(qū)奶牛芽囊原蟲感染情況進(jìn)行調(diào)查,共發(fā)現(xiàn)3種芽囊原蟲基因型。其中,ST10為感染優(yōu)勢基因亞型。人獸共患亞型ST3、ST5的發(fā)現(xiàn),提示芽囊原蟲在本地區(qū)具有潛在的人畜共患風(fēng)險(xiǎn)。關(guān)于我國奶牛芽囊原蟲的感染情況及亞型分布情況,需要更多的研究來闡明其人畜共患風(fēng)險(xiǎn)及公共衛(wèi)生學(xué)意義。