孫歡歡,王 娜,孫良振,郭海濤,王婧然,楊 康,周佳勃,譚景和,2? (.東北農(nóng)業(yè)大學 生命科學學院 黑龍江省動物細胞與遺傳工程重點實驗室,黑龍江 哈爾濱50030；2.山東農(nóng)業(yè)大學 動物科技學院,山東 泰安2708)

近年來,隨著工作壓力的激增、生活節(jié)奏的加快、就業(yè)競爭的激烈,多種多樣的應(yīng)激原浮現(xiàn)在我們的日常生活中,應(yīng)激的增加逐漸成為多種生理功能障礙的誘因,甚至能導致多種疾病的發(fā)生發(fā)展。研究表明,應(yīng)激是對雄性生育能力最有影響力的因素之一[1]。

應(yīng)激會增強下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸的活動,并且促進腎上腺皮質(zhì)分泌糖皮質(zhì)激素。應(yīng)激狀態(tài)下的小鼠血清皮質(zhì)酮從0.1 mg/L 顯著升高到0.2～1.0 mg/L[2]；皮 質(zhì) 醇 從0.01 mg/L 升 高 到0.05 mg/L[2-3],促腎上腺皮質(zhì)激素可顯著提高母豬皮質(zhì)醇質(zhì)量濃度[4]。糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid,GC)參與調(diào)節(jié)多種生理過程,包括能量代謝、炎癥、免疫、生長、滲透調(diào)節(jié)、神經(jīng)元功能和動物行為等[5]。在體內(nèi),應(yīng)激水平的血漿GC 質(zhì)量濃度能顯著增加青春期和成年期大鼠生精細胞凋亡比例。在皮質(zhì)醇增多綜合征中,高質(zhì)量濃度GC 也是與生精障礙和無精癥密切有關(guān)。試驗表明,外源性GC 引起的生殖細胞的凋亡可完全被糖皮質(zhì)激素受體(glucocorticoid receptor,GR)拮抗劑所抑制,所以GC可能是通過GR 調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄基因直接作用于生精細胞的,但其機制還不清楚。

GC對精子影響的研究主要集中于精子發(fā)生階段,主要在體內(nèi),但是體內(nèi)環(huán)境是受多因素共同作用的,不同條件下得到的試驗結(jié)果存在差異。有報道認為口服低劑量可的松或氫化可的松是一種有望治療少精子癥的方法[6-7]。然而,也有報道表明采用該方法對患有先天性不育的男性進行治療并沒有提高患者精子的受精能力也沒有增加患者精子總數(shù)或精子活率[8]。因此,本研究以體外保存過程中的豬精子為研究對象,排除體內(nèi)復雜因素的干擾,旨在進一步探討GC對豬精子是否存在影響,為降低應(yīng)激,以及GC對雄性動物生殖的影響提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑除特殊說明外,本研究所用試劑均來自Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品。

BTS稀釋液作為保存液,其包含205.37 mmol/LD-葡萄糖,20.40 mmol/L 二水檸檬酸鈉,3.69 mmol/L乙二胺四乙酸二鈉,14.88 mmol/L 碳酸氫鈉,10.06 mmol/L 氯化鉀,50 IU/m L 青霉素鈉,0.1 g/L 硫酸鏈霉素；p H 7.2。

1.2 精液采集與保存精液采自5頭健康可育長白種公豬,用手握法采集富精期的濃精液。將采集的鮮精液溫度保持在35℃,30 min內(nèi)運至實驗室。鏡檢精子活力≥80%以上的精液樣品用于試驗。鮮精液避光置于室溫2 h使溫度緩慢降至室溫,將精液按稀釋比例分裝于15 m L的離心管中,離心去除精漿；然后分別用含有不同質(zhì)量濃度(0.1,0.25,0.5,10.0,50.0 mg/L)氫化可的松、50μmol/L米非司酮以及氫化可的松和米非司酮聯(lián)合作用的保存液稀釋,不含氫化可的松的處理作為對照組,分裝至1.8 m L 凍存管中,使精子的終濃度為3×107～5×107個/m L。將含有不同處理的凍存管置于17℃恒溫箱中保存5 d,每隔24 h取精液樣本并檢測。

1.3 精子活力檢測在檢測前將精子樣本混勻并放到37℃恒溫箱中預(yù)熱20 min,使用清華同方精子分析儀(MX 7.5)分析精子的各項運動參數(shù)。取10μL預(yù)熱后的精子樣本涂于計數(shù)池上,每次檢測6個視野,精子數(shù)量不少于200個。

1.4 精子蛋白的Western blot分析取1 m L 精液,1 500 r/min離心10 min,棄上清,并用PBS洗滌2次,每次10 min；離心后的沉淀重懸于含有蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解液中,并進行超聲處理,處理后的樣品在冰上裂解40 min。將等量的蛋白質(zhì)煮沸10 min,然后用10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,并轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。將PVDF 膜用5%脫脂奶粉37℃封閉1 h,一抗4℃孵育過夜。次日,用PBST 緩沖液洗去一抗后用山羊抗兔辣根過氧化物酶標記的二抗37℃孵育1 h。PBST 緩沖液洗去二抗后用ECL Plus蛋白質(zhì)印跡檢測系統(tǒng)顯示印跡。β-actin(1∶1 000,＃M20615,TransGen Biotech)；GR(1∶1 000,＃ WL02695,Wanleibio)。

1.5 精子免疫熒光檢測取1 m L 精液,1 500 r/min離心5 min,棄上清并用PBS洗滌2次,然后取60μL 細胞懸液加入到200μL 溫熱的PBS 中,1 500 r/min 離心5 min；棄上清,沉淀重懸于200μL 4%多聚甲醛中,固定30 min后,去除多聚甲醛并用200μL含0.1%Triton X-100的PBS緩沖液通透20 min,并對GR 進行免疫熒光染色處理。然后用含10%正常牛血清(BSA)的PBS緩沖液室溫封閉1 h后,使用兔多克隆抗GR 作為一抗,FITC標記的山羊抗兔IgG 作為二抗孵育同上。在倒置熒光顯微鏡下觀察。GR(1∶200,＃ WL02695,Wanleibio)。

1.6 精子DNA 完整性的檢測根據(jù)VIRANT等[9]報道的方法,取20μL精子懸液涂于載玻片上。風干后,在Carnoy溶液(甲醇/醋酸,3∶1)中固定過夜。沖洗風干后,將載玻片用新鮮制備的吖啶橙(AO)染色劑染色5 min,洗滌干燥后,立即在倒置熒光顯微鏡400倍下觀察。具有染色質(zhì)完整的精子頭部呈現(xiàn)綠色熒光,具有染色質(zhì)變性(DNA 不完整)的精子頭部呈現(xiàn)橙紅或黃色熒光。

1.7 精子線粒體膜電位的檢測采用MitoProbe JC-1試劑盒對線粒體膜電位進行檢測[10]。取0.5 m L 精子數(shù)量為2×106個精子的樣品,加入0.5 m L JC-1染色工作液,顛倒數(shù)次混勻。在37℃培養(yǎng)箱中孵育20 min。37℃孵育結(jié)束后,4℃下1 000 r/min離心5 min。再用JC-1緩沖液(1×)重懸后,涂片,倒置熒光顯微鏡400倍下觀察。

1.8 精子凋亡的檢測精子凋亡水平采用Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒進行檢測[11]。測時,先將1 m L 精液1 500 r/min離心5 min,棄上清,再用0℃的PBS重懸并計數(shù)。將精子(1×106)重懸于500μL 的結(jié)合緩沖液中,并與10μL Annexin V-FITC 和5 μL PI 一 起 避 光 室 溫 孵 育20 min,通過流式細胞儀測量凋亡率(%)。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標準誤(±s x) 表示。每個試驗處理至少重復3次,數(shù)據(jù)使用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析,P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 氫化可的松對保存過程中精子活力的影響

如圖1可知,在保存豬精液過程中各組活力均隨保存時間的延長而逐漸降低。0.1 mg/L 氫化可的松處理組與對照組(0.0 mg/L)差異不顯著。0.25～50.0 mg/L 從保存第1天起與對照組和0.1 mg/L組精子活力出現(xiàn)差異,且隨著氫化可的松作用時間的延長精子活力顯著降低(P＜0.05)。高質(zhì)量濃度的氫化可的松組(10.0～50.0 mg/L)精子活力下降幅度更大,顯著高于對照組。

圖1 不同質(zhì)量濃度的氫化可的松對精子活力的影響 注：所標字母不同者表示差異顯著(P＜0.05)

2.2 GR在豬精子中的表達采用Western blot方法檢測射出的豬精子是否存在GR 的表達,結(jié)果如圖2所示,5頭不同公豬射出的精子混合樣品都檢測到了GR 蛋白的表達,相對分子質(zhì)量95 000,其中用小鼠精子作為陽性對照。

圖2 豬精子蛋白的Western blot分析 P1,P2.混合樣品；Ms.小鼠精子陽性對照；β-actin.上樣對照

圖3 豬射出的精子中GR 的免疫定位 A.光鏡下的豬精子；B.GR 在豬精子中的表達(400×)

采用免疫熒光技術(shù)進一步研究GR 的在豬精子上的定位,如圖3所示GR 主要表達在豬精子頂體后區(qū)及尾部中段線粒體鞘周圍,而尾部其余部分未見信號；提示GR 受體可能在氫化可的松作用精子過程中起作用。

2.3 米非司酮與氫化可的松聯(lián)合作用對精子活力的影響米非司酮是GR 的競爭性抑制劑。采用50μmol/L米非司酮抑制GR,結(jié)果如圖4所示,米非司酮可有效拮抗氫化可的松的作用,精子保存第5天時氫化可的松＋米非司酮處理組精子活力顯著高于氫化可的松單獨處理組(P＜0.05),與對照組差異不顯著。近一步證實氫化可的松可能是通過其受體作用于精子的。

2.4 氫化可的松對體外精子DNA碎裂(DFI),線粒體膜電位(MMP)和細胞凋亡的影響在添加或不添加50μmol/L米非司酮的條件下,用0.25 mg/L氫化可的松體外保存豬精液5 d后檢測氫化可的松對DFI,MMP以及精子細胞凋亡的影響,結(jié)果見表1。

對DNA 碎片指數(shù)(DFI)的影響：氫化可的松處理組精子DFI(23.77±1.17)%顯著高于對照組(12.50±1.54)%(P＜0.05),氫化可的松＋米非司酮處理組(13.84±1.67)% 與對照組差異不顯著。

精子線粒體膜電位(MMP)影響：氫化可的松處理組精子MMP(27.19±1.55)%顯著低于對照組(59.51±2.09)%和與米非司酮聯(lián)合處理組(58.92±1.55)%,而后2組差異不顯著。

圖4 米非司酮與氫化可的松聯(lián)合作用對豬精子活力的影響 注：同列數(shù)據(jù)所標字母不同者表示差異顯著(P＜0.05)。下同

對細胞凋亡的影響：氫化可的松促進精子細胞凋亡,細胞凋亡比例顯著高于對照組及與米非司酮聯(lián)合處理組。

表1 氫化可的松對體外精子DFI、MMP和精子凋亡的影響 %

3 討論

應(yīng)激反應(yīng)會促進腎上腺皮質(zhì)分泌糖皮質(zhì)激素(GC),長期處于高水平GC 的作用下能夠損傷生精上皮,導致生殖細胞和支持細胞間隙擴大,生殖細胞結(jié)構(gòu)受損,影響生殖細胞的正常功能,雄激素合成減少,精子發(fā)生障礙[12]。然而GC 對射出的成熟精子是否有影響還有待于研究。事實上,哺乳動物精子在雄性和雌性生殖道中的遷移過程,生殖道為它們提供了一個與各種激素相互作用的機會。許多的研究表明哺乳動物雄性和雌性生殖道中存在大量類固醇激素[13]。為了減少體內(nèi)多種因素的干擾,本研究采用BTS為豬精液稀釋液,在該稀釋液中17℃保存7 d的豬精液,仍可穩(wěn)定維持活力60%以上[14],為研究GC對精子的影響提供了一個比較適宜的研究體系。有報道表明血清中GC 的生理質(zhì)量濃度約為0.1 mg/L[15-17]；應(yīng)激狀態(tài)下豬血清中皮質(zhì)醇的質(zhì)量濃度達到0.25 mg/L[18]。因此本研究中采用的氫化可的松的質(zhì)量濃度分別為0.1,0.25,0.5,10.0 和50.0 mg/L。結(jié)果表明,生理質(zhì)量濃度0.1 mg/L 氫化可的松對豬精子活力影響不大,但是應(yīng)激質(zhì)量濃度0.25,0.5 mg/L氫化可的松處理組可降低精子的活力,特別是長期作用下精子活力顯著降低。而高質(zhì)量濃度的氫化可的松組(10.0～50.0 mg/L)精子活力下降幅度更大。

GC需要結(jié)合到糖皮質(zhì)激素受體(GR)形成復合體后,在熱休克蛋白的作用下進入到細胞核內(nèi),作用于下游轉(zhuǎn)錄因子從而發(fā)揮生物學效應(yīng)。研究表明小鼠成熟精子存在GR 的表達[19],豬的射出精子是否表達GR 如何定位尚未見報道。本研究中采用Western blot和免疫熒光的方法進行定位及定量的研究,證明豬精子存在GR 的表達,而且集中表達在豬精子頂體后區(qū)及尾部中段線粒體鞘周圍,而尾部其余部分未見信號,提示GC 很可能通過GR 起作用,而且很有可能影響精子線粒體功能。采用GR抑制劑米非司酮可拮抗氫化可的松作用,進一步證實了我們的猜想。體外保存5 d,與對照組相比0.25 mg/L氫化可的松可顯著降低精子活力,而米非司酮與氫化可的松聯(lián)合作用組精子活力與對照組差異不顯著(P＞0.05)。

為了進一步研究氫化可的松對精子的影響,采用0.25 mg/L的氫化可的松體外保存豬精液5 d后檢測氫化可的松對DFI、MMP 以及精子細胞凋亡的影響。結(jié)果表明,長期應(yīng)激質(zhì)量濃度的氫化可的松處理組DFI顯著提高,MMP降低,細胞凋亡比例提高,米非司酮可有效拮抗氫化可的松的作用,表明氫化可的松可能是通過與其受體GR 結(jié)合,干擾線粒體功能從而促進細胞凋亡。TOME 等[20]報道,合成的GC地塞米松會誘導小鼠胸腺淋巴細胞的凋亡且線粒體是該凋亡信號傳導的核心。這些結(jié)果進一步證明GC可能間接啟動線粒體凋亡通路來影響豬精子。

綜上所述,保存過程中添加0.25 mg/L 氫化可的松開始會降低精子活力影響精液質(zhì)量。添加50μmol/L 米非司酮可拮抗氫化可的松的作用提高精子活力。在長期(5 d)應(yīng)激質(zhì)量濃度氫化可的松作用下,精子DFI增加,線粒體功能下降,凋亡比例增加,這些作用可以被米非司酮拮抗。表明氫化可的松可能是通過與其受體GR 結(jié)合干擾線粒體功能從而促進細胞凋亡。這些結(jié)果為降低應(yīng)激,以及GC對雄性動物生殖的影響提供理論參考。