王科智,許祺欣,蘇仁偉 (華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院,廣東 廣州510000)

子宮腺體是雌性哺乳動物子宮的重要組成部分,腺體以及其分泌物對妊娠的建立和維持是十分重要的[1]。包括畜牧動物豬、牛、羊和人以及嚙齒類在內(nèi)的多種哺乳動物中,子宮腺體都被證明可以合成并分泌多種酶類、生長因子、細胞因子、淋巴因子、激素、轉(zhuǎn)運蛋白以及其他一些物質(zhì),這些物質(zhì)為著床前胚胎、胎兒以及胎盤提供營養(yǎng)物質(zhì)以支持其著床,妊娠識別以及生長發(fā)育[2]。在妊娠期間,受來自卵巢和胎盤的激素的時空性調(diào)控,腺體會發(fā)生增生和肥大[3-4],分泌量增加,并為整個妊娠期間胎兒的發(fā)育提供營養(yǎng)物質(zhì)。人懷孕的前3個月,由于胎盤發(fā)育不完全,胎兒的營養(yǎng)供給主要以這種組織營養(yǎng)為主,在后期胎盤發(fā)育完全以后才轉(zhuǎn)為以血液營養(yǎng)為主。而在其他畜牧動物特別是豬、馬等胚胎著床方式為表面著床的動物中,由子宮腺體帶來的組織性營養(yǎng)貫穿其整個妊娠過程,為胎兒的發(fā)育提供營養(yǎng)支持[5]。研究表明,在多種哺乳動物中,因各種因素導(dǎo)致子宮腺體缺失的雌性個體都是不孕的[6-8]。

大部分雌性哺乳動物在剛出生的時候子宮是處于未發(fā)育完全的狀態(tài),僅由數(shù)層間充質(zhì)細胞和單層腔上皮細胞組成,此時的子宮內(nèi)不含有任何的腺體。根據(jù)物種的不同,子宮內(nèi)的腺體發(fā)育一般持續(xù)一到兩周的時間,在此期間部分子宮腔上皮增殖分化,向基質(zhì)遷移,最終形成腺體,該過程稱之為子宮腺體的發(fā)生。以小鼠為例：在出生后第5天(postnatal day 5,PND5)左右,子宮內(nèi)膜腔上皮在部分位點開始內(nèi)陷到子宮間充質(zhì)中,直到PND7,才能在組織學(xué)上分辨出子宮腺芽的存在,腺體從PND10左右開始向子宮內(nèi)膜基質(zhì)中擴展,直到PND15基本發(fā)育完成[8]。在山羊和小鼠等多種哺乳動物,給新生雌性幼崽連續(xù)皮下注射一定劑量的孕酮(P4),可導(dǎo)致其子宮內(nèi)腺體發(fā)生障礙從而造成成年動物子宮腺體的缺失,進而導(dǎo)致雌性動物不孕[8]。然而,P4導(dǎo)致小鼠子宮腺體缺失的機制仍不是很清楚,目前已經(jīng)證明與該過程有關(guān)的只有Wnt信號通路[9]。

轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor β,Tgfβ)超家族成員在卵泡發(fā)育、排卵、卵母細胞-卵丘細胞交流、子宮蛻膜化以及胚胎發(fā)育和機體成熟過程中參與了很多細胞分化過程并起到了決定性的作用[10-12]。該超家族的配體包括Tgfβs、activins和骨形成蛋白(bone morphogenetic proteins,Bmps),這些配體與它們的膜結(jié)合Ⅰ型和Ⅱ型受體結(jié)合,形成一個復(fù)雜的結(jié)合物進而發(fā)揮作用[13]。其中Tgfβ信號通路包括配體Tgfβs、受體Tgfβrs、轉(zhuǎn)錄因子Smads以及下游靶基因[12]。在小鼠中,能夠與Tgfβ結(jié)合的受體有3種：Tgfβr1、Tgfβr2和Tgfβr3,分別由Tgfbr1-3基因編碼。Tgfβr2可以直接與配體結(jié)合,Tgfβr1 只 能 與 結(jié) 合 在Tgfβr2 上 的 配 體 結(jié) 合,Tgfβr3則是Tgfβ的共同受體,能夠作為Tgfβ儲存庫幫助Tgfβs與Tgfβr1和Tgfβr2結(jié)合。有研究表明,在新生小鼠子宮特異性過激活Tgfβr1能夠抑制子宮腺體的發(fā)育并影響Wnt信號通路的表達[14-15]。因此,我們假設(shè)Tgfβ信號通路可能參與了P4注射導(dǎo)致小鼠子宮腺體缺失的過程。為了驗證這一假設(shè),收集經(jīng)P4處理過的新生仔鼠子宮上皮細胞,檢測Tgfb信號通路受體基因Tgfbr1、Tgfbr2、Tgfbr3以及下游靶基因的m RNA 表達水平,并使用Tgfβ信號通路抑制劑LY364947部分挽救了P4處理組小鼠子宮腺體的發(fā)生。

1 材料與方法

1.1 實驗動物所使用到的孕鼠為C57BL/6J品系,購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司,飼養(yǎng)于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗動物中心,室內(nèi)溫度22～24℃,相對濕度60%～70%,光照和黑暗時間各12 h。孕鼠分娩出仔鼠當(dāng)天記為出生后第1天(PND1)。

P4注射：試驗分對照組和試驗組,每組各3只,試驗組在PND2～PND6和PND2～PND10每天皮下注射P4(Sigma,按體質(zhì)量50 ng/g),對照組皮下注射等體積的芝麻油。于PND7和PND15取材仔鼠子宮,取材時將仔鼠斷頭處死,取出子宮后剔除系膜以備后續(xù)試驗檢測。

P4、Tgfβ受體抑制劑注射：試驗分為對照組和試驗組,對照組4只小鼠,試驗組5只小鼠。對照組在PND2～PND10每天頸部皮下注射P4(按體質(zhì)量50 ng/g)和腹部皮下注射5%DMSO(生理鹽水配制),試驗組在PND2～PND10每天皮下注射P4(按體質(zhì)量50 ng/g)和腹部皮下注射能夠抑制Ⅰ型和Ⅱ型Tgfβ受體的抑制劑(Selleck,LY364947,按體質(zhì)量1μg/g),于PND15取材并包埋切片。

1.2 子宮內(nèi)膜上皮細的消化和分離消化體系配制如表1,將清洗干凈的子宮加入消化體系內(nèi),4℃消化1.5～2.0 h,每隔0.5 h將離心管上下顛倒5～10次。消化完成后,將子宮轉(zhuǎn)移至10% FBS中終止消化,然后用1×PBS清洗3次。

表1 消化體系配方

在解剖鏡下,用鑷子輕輕固定住子宮一端,在毛細管中吸入一定體積的液體；將毛細管尖端緩慢插入鑷子固定好的子宮一端內(nèi)大概3 mm,將子宮內(nèi)膜腔上皮較為完整的沖出來；在1×PBS中洗干凈后,于倒置顯微鏡下觀察、拍照。

1.3 免疫熒光觀察將分離出來的子宮上皮細胞在培養(yǎng)液中輕輕吹散,接種于放置了蓋玻片的24孔板內(nèi),放入37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；待形成貼壁的單層細胞后,去除培養(yǎng)液,用4%多聚甲醛室溫固定20 min；用1×PBS 洗3 遍,每遍5 min；用0.1% Tween-20室溫處理20 min；1×PBS洗3遍,每遍5 min；用5%驢血清37℃封閉1 h；孵育一抗,4℃過夜(Vimentin,1∶100；Cytokeratin18,1∶100)；去除一抗,1×PBS洗3遍,每遍5 min；二抗37℃孵育30 min；1×PBS洗3遍,用含有DAPI的封片劑封片,使用激光共聚焦熒光顯微鏡(Leica TCS SP8)觀察并拍照。

1.4 HE 染色與免疫組織化學(xué)檢測于PND15取材小鼠子宮,用4%多聚甲醛固定過夜,包埋后進行石蠟切片(5μm),脫蠟后進行HE 染色。10%馬血清封閉后與Foxa2 抗體(Abcam,1∶100)孵育過夜,然后進行酶標二抗孵育和DAB 染色,拍照并統(tǒng)計每個切片上的Foxa2陽性表達的腺體數(shù)量,每只小鼠子宮統(tǒng)計10～20片切片。

1.5 總RNA提取、反轉(zhuǎn)錄和Real-time PCR將分離的上皮轉(zhuǎn)移入無RNA 酶離心管中,使用TRIzol法提取總RNA,用NanoDrop(NanoDrop 2000c)測量RNA 濃度。使用PrimeScriot RT Master Mix反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄：50℃15 min,85℃5 s,得到cDNA。

使用Ta KaRa SYBR Premix Ex Taq kit試劑盒,采用BIORAD-CFX96TMReal-time System 進行。PCR 反應(yīng)條件：95℃10 s；95℃5 s,60℃34 s,重復(fù)40個循環(huán)。使用Rpl19作為內(nèi)參,檢測目的基因m RNA 水平的表達。所有引物由上海生工生物科技有限公司合成,引物如表2所示。

表2 Real-time PCR 引物序列

1.6 數(shù)據(jù)分析根據(jù)Real-time PCR 系統(tǒng)軟件導(dǎo)出的相應(yīng)基因的Ct值,按照ΔΔCt法計算：ΔΔCt＝(試驗組目的基因Ct值－試驗組內(nèi)參基因Ct值)/(對照組目的基因Ct值－對照組內(nèi)參基因Ct值),試驗處理組與對照組中靶基因相對表達的差異倍數(shù)計算公式：N(處理組/對照組)＝2－ΔΔCt。

根據(jù)Foxa2染色結(jié)果,統(tǒng)計每張切片上的腺體數(shù)量,計算每只小鼠每片組織切片上的平均腺體數(shù)量。試驗結(jié)果使用GraphPad Prism6 軟件進行ttest統(tǒng)計分析,取P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 子宮上皮分離及純度檢測試驗首先分離PND10子宮腔上皮,結(jié)果得到一條結(jié)構(gòu)基本完整的子宮上皮。其中對照組的子宮上皮存在很多小的突起,為子宮腺芽(圖1a),而P4處理組的小鼠子宮腔上皮表面很光滑,沒有腺芽的存在(圖1b),說明P4處理確實可以導(dǎo)致子宮腺體發(fā)生障礙。

為了證明分離出來的子宮上皮細胞不含有間充質(zhì)細胞,利用免疫熒光法檢測對照組上皮中相關(guān)特異性標志蛋白的表達。如圖1c所示,在分離的上皮細胞中沒有檢測到間充質(zhì)細胞特異性表達的Vimentin,而幾乎所有的細胞都表達上皮特異性表達的標志分子Cytokeratin18(圖1d)。以上結(jié)果表明,本研究中分離出的子宮內(nèi)膜上皮細胞純度極高,沒有間充質(zhì)細胞的污染。

圖1 子宮內(nèi)膜上皮純度檢測 a.注油組子宮腔上皮(×5)；b.注P4組子宮腔上皮(×5)；c.Vimentin染色；d.Cytokeratin18染色(Bar＝100μm)

2.2 P4處理上調(diào)子宮上皮中Tgfbrs及靶基因mRNA的表達PND7是小鼠子宮腺體發(fā)育出芽的關(guān)鍵時期,因此檢測這一時期子宮上皮中Tgfβ的3種受體基因Tgfbr1、Tgfbr2和Tgfbr3的表達是否受到P4的調(diào)節(jié)。如圖2所示,與注油的對照相比,注射P4的子宮上皮細胞中Tgfbr1 m RNA 表達水平?jīng)]有明顯變化,而Tgfbr2和Tgfbr3 m RNA 表達水平在P4的作用下有所上調(diào)。

為了檢測上調(diào)的Tgfβ 受體表達是否導(dǎo)致了Tgfβ信號通路的激活,還檢測了Tgfβ信號通路的下游靶基因Serpine1、Ctgf和Mmp9的表達。結(jié)果顯示,P4處理后3個靶基因的表達都有上調(diào),其中Ctgf和Mmp9的上調(diào)表達具有統(tǒng)計學(xué)差異(圖2。這些結(jié)果表明,在P4導(dǎo)致的新生小鼠子宮腺體缺失過程中,Tgfβ信號通路被激活,可能在這一過程中介導(dǎo)了P4的作用。

圖2 PND7子宮上皮細胞中Tgfbrs以及下游靶基因mRNA 表達水平 ?表示P＜0.05

2.3 抑制Tgfβ受體能夠挽救P4處理導(dǎo)致的腺體缺失為了進一步確定Tgfβrs在P4處理導(dǎo)致子宮腺體缺失的過程中所發(fā)揮的作用,使用小分子抑制劑LY364947對Tgfβ進行抑制。Y364947 可以同時對Tgfβr1 和Tgfβr2 的功能進行抑制。利用P4和LY364947同時處理仔鼠,并在PND15 檢測抑制Tgfβ信號通路是否能夠挽救P4處理導(dǎo)致的子宮腺體缺失。結(jié)果如圖3所示：在PND15,注油組子宮中有數(shù)量較多的腺體(圖3a),而注P4組子宮中沒有發(fā)現(xiàn)腺體的存在(圖3b)；注射P4和DMSO 組仔鼠子宮中基本沒有腺體的存在(圖3c),而注射P4和Tgfβ受體抑制劑組仔鼠子宮中出現(xiàn)了部分腺體(圖3d)。

為了進一步精確計數(shù)子宮腺體的數(shù)量,利用免疫組化技術(shù)檢測腺體的標志性分子Foxa2的表達。結(jié)果如圖4所示：在注射P4和DMSO 的對照組中只有25%小鼠的子宮中出現(xiàn)Foxa2陽性染色,而注射P4和抑制劑組的試驗組中有80%小鼠的子宮中發(fā)現(xiàn)了腺體的存在(圖4a～c)。進一步的統(tǒng)計發(fā)現(xiàn),試驗組每張切片上的腺體數(shù)量明顯高于對照組每張切片上的腺體數(shù)量(圖4d)。這些結(jié)果表明通過抑制Tgfβ信號通路能夠在一定程度上挽救P4介導(dǎo)的子宮腺體缺失。

圖3 子宮上皮HE染色 a.注油組小鼠PND15子宮；b.注P4組小鼠PND15子宮；c.注P4和DMSO 組PND15子宮；d.注P4和抑制劑組PND15子宮。Bar＝100μm

圖4 Foxa2免疫組化以及腺體數(shù)量統(tǒng)計 a.注P4和DMSO 組PND15子宮；b.注P4和抑制劑組PND15子宮；c.試驗組和對照組各自含有腺體的小鼠數(shù)量所占小鼠總數(shù)的百分比；d.試驗組和對照組每張切片上的腺體數(shù)量比較(Bar＝100μm；?表示P＜0.05)

3 討論

雌性哺乳動物的子宮腺體及其分泌物對妊娠的建立和維持十分重要[1],子宮腺體及其功能的異?？捎绊懼睬芭咛グl(fā)育、胚胎著床以及胎兒和胎盤生長發(fā)育并最終影響妊娠結(jié)局[2]。在靈長動物特別是人類女性中,每次月經(jīng)過后子宮內(nèi)膜都會經(jīng)歷一次修復(fù)和重建的過程,該過程需要重建全部的腔上皮和部分的腺上皮,如果重建出現(xiàn)問題可能會影響子宮的接受性,甚至導(dǎo)致不孕[16]。在畜牧生產(chǎn)中,特別是豬等著床方式為表明著床的動物中,胚胎在著床以前在子宮中長時間漂浮而不會與母體子宮建立直接聯(lián)系；而且由于其胎盤類型的限制,即便著床后的胚胎對組織性營養(yǎng)的需求也高于嚙齒類和靈長類,因此深度了解子宮腺的發(fā)育可以提高畜牧生產(chǎn)效率[17]。本研究結(jié)果證明Tgfβ信號通路在注射P4的初生小鼠子宮上皮中被激活,并且部分介導(dǎo)了P4注射導(dǎo)致的子宮腺體缺失,為子宮腺體發(fā)育的分子機制提供了新的證據(jù)。

研究結(jié)果顯示,在PND7這一腺體發(fā)育的關(guān)鍵時期,P4可以調(diào)節(jié)子宮上皮中TgfβⅡ型受體Tgfbr2和Ⅲ型受體Tgfbr3 而不是Ⅰ型受體Tgfbr1 的表達,提示可能是Ⅱ型和Ⅲ型Tgfβ受體而不是Ⅰ型受體介導(dǎo)了新生仔鼠P4注射導(dǎo)致的腺體缺失。其中,Tgfβr3是一種輔助型受體,它的存在可以有效促進Tgfβs與Tgfβr1 以 及Tgfβr2 的 結(jié) 合,因 此 推 測Tgfβr2可能在P4介導(dǎo)的子宮腺體缺失中發(fā)揮主要作用。但Tgfbr3 m RNA 表達的顯著上調(diào)也說明Tgfβr3在P4誘導(dǎo)的Tgfβ信號通路的激活中起到重要作用。目前,僅有持續(xù)激活Ⅰ型受體Tgfbβ1導(dǎo)致子宮腺體發(fā)生障礙的報道[14],而尚未見持續(xù)激活Ⅱ型受體Tgfβr2和Ⅲ型受體Tgfβr3的研究報道。這與我們的研究結(jié)果看似是矛盾的,但是,Tgfβr1 的持續(xù)激活只是一種人為的干預(yù),只有Tgfβr1的表達不受P4的調(diào)節(jié)并不能否定P4通過調(diào)節(jié)Tgfβ信號通路來抑制子宮腺體發(fā)生的可能。并且,據(jù)報道,Tgfβr1只能與結(jié)合在Tgfβr2上的配體結(jié)合[18],上調(diào)的Tgfβr2也可通過輔助Tgfβr1來激活下游信號通路,這與直接過激活Tgfβr1 的結(jié)果可能是一致的。

無論是Ⅰ型還是Ⅱ型Tgfβ受體的激活均能通過磷酸化下游的Smad2/3 激活下游基因的表達[14-15]。在本研究中,受P4的影響,Tgfβ下游靶基因Ctgf和Mmp9也受到了明顯的上調(diào),說明P4誘導(dǎo)的Tgfβ受體表達上調(diào)可以引起該信號通路的激活。小分子抑制劑LY364947可以同時抑制Ⅰ型和Ⅱ型Tgfβ受體的活性,在本研究中發(fā)現(xiàn)該抑制劑可以部分挽救由P4導(dǎo)致的PND15 小鼠子宮腺體缺失,進一步證明Tgfβ信號通路介導(dǎo)P4注射引起的小鼠子宮腺體缺失的可能性。但是,這種挽救的能力是極其有限的,P4和LY364947處理組的小鼠子宮腺體數(shù)量雖然顯著高于P4＋DMSO 組小鼠,但仍遠低于未受P4影響的正常PND15仔鼠子宮中腺體數(shù)量,表明Tgfβ信號通路僅能部分介導(dǎo)P4在子宮腺體缺失過程中的作用,其他信號通路也可能參與了這個復(fù)雜的過程。Wnt信號通路是最早被證明在P4處理的新生小鼠子宮中受到調(diào)節(jié)的信號通路[9],但Wnt信號通路是否直接介導(dǎo)了P4的作用還缺乏直接的證據(jù)。在子宮特異性過激活Tgfβr1的新生小鼠子宮中,Wnt信號通路的表達也受到了影響[14-15]。結(jié)合本研究的結(jié)果,P4、Tgfβ和Wnt信號通路的相互作用可能在這一過程中發(fā)揮了重要的作用。

綜上所述,本研究初步證明了Tgfβ信號通路能夠介導(dǎo)P4導(dǎo)致的子宮腺體缺失,但只是部分介導(dǎo)了P4的作用,這一過程是否有其他信號通路的參與還需要進一步的研究。此外,P4調(diào)節(jié)Tgfbrs表達的詳細機制也需要進一步的研究和探索。