王宇軒,韓 碩,楊卓妮娜,鄒紫雯,劉 娟,趙志輝,沈冰蕾? (.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 動物科技學(xué)院,黑龍江 大慶6339；.廣東海洋大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,廣東 湛江54088)

miRNA 是一種長度約為22 bp,高度保守的非編碼單鏈RNA,通過與目標(biāo)m RNA 的3′UTR 區(qū)域完全或不完全靶向結(jié)合,便可調(diào)控基因的表達(dá)[1]。不完全結(jié)合可抑制翻譯的進(jìn)行,完全結(jié)合可使mRNA 降解,屬于轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的重要成分。并有新的研究揭示了miRNA 可與其他功能蛋白相結(jié)合和可直接激活TLR 受體蛋白等7種非經(jīng)典分子機(jī)制[2]。但無論何種作用機(jī)制,均證實(shí)單個miRNA 能結(jié)合調(diào)控多個靶mRNA,mRNA 的表達(dá)也受多個miRNA 的綜合調(diào)控。而機(jī)體的免疫系統(tǒng)具有免疫監(jiān)視、防御和調(diào)控等作用,miRNA 不可避免地參與其中。如miR-221[3]、miR-146a[4]、miR-203[5]、miR-125b[6]等在炎癥發(fā)生過程中發(fā)揮突出作用；此外miRNA 在參與乳腺疾病的發(fā)生和發(fā)展,同時對其臨床診斷、治療以及乳腺癌的預(yù)后等有重要意義。

外泌體是一種介于40 ～100 nm 的小囊泡,在細(xì)胞間的信息傳遞中起著重要的作用[7]。人體內(nèi)多種細(xì)胞都可分泌外泌體,包括血小板、內(nèi)皮細(xì)胞、肥大細(xì)胞、樹突細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞等[8],但不同的細(xì)胞分泌的外泌體亞型有區(qū)別。外泌體天然存在于大多數(shù)體液中,包括血液、唾液、尿液、腦脊液和母乳等,其核酸組分有DNA、m RNA、miRNA、lncRNA 等。miRNA 是外泌體內(nèi)最主要的RNA 組分,外泌體可通過轉(zhuǎn)運(yùn)miRNA 參與受體細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控,影響受體細(xì)胞的生物學(xué)功能[9]。外泌體源性miRNA 的種類及數(shù)量變化可能與腫瘤的大小、惡性程度、侵襲轉(zhuǎn)移、分期分級密切相關(guān)。外泌體通過轉(zhuǎn)運(yùn)具有侵襲潛能的miRNA,提高腫瘤的侵襲性。奶牛乳汁外泌體中也存在大量miRNA,且有待被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)。其意義不僅可影響自身乳房健康,還可通過乳汁影響犢?；蚰讨破肥秤谜叩拿庖邫C(jī)能。牛奶等奶制品是維持人體健康的良好營養(yǎng)來源。牛奶還含有大量的生物成分,包括細(xì)胞因子、趨化因子和激素等。牛奶外泌體的miRNA 含量水平可能表明哺乳動物的健康狀況,特定miRNA 的存在與否可以作為早期檢測乳腺炎細(xì)菌感染的生物標(biāo)志物[10]。并有研究表明牛奶中的miRNA 可通過外泌體調(diào)控人類基因的表達(dá)及功能發(fā)揮[11]。

基于此,本研究以健康奶牛及乳房炎奶牛乳腺組織差異表達(dá)的miRNA 為依據(jù),通過生物信息學(xué)分析方法,篩選可能存在于乳汁外泌體中的miRNA,進(jìn)而對篩選獲得差異表達(dá)miRNA 的候選靶基因及其可能參與的與乳房炎抗性相關(guān)的調(diào)控功能進(jìn)行預(yù)測與分析,為奶牛乳房炎抗性相關(guān)調(diào)控因子的分子標(biāo)記輔助選擇奠定基礎(chǔ)。也為乳汁影響犢牛免疫功能及乳汁外泌體中miRNA 跨物種影響機(jī)體健康的分子調(diào)控機(jī)制研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 相關(guān)數(shù)據(jù)庫Targetscan(http：//www.targetscan.org/)、miRDB(http：//www.mirdb.org/)和miRanda(http：//www.microrna.org/)是miRNA 相關(guān)分析的常用數(shù)據(jù)庫,三者通過不同的計(jì)算公式,利用miRNA 種子區(qū)匹配保守性位點(diǎn)預(yù)測候選靶基因,并可對所預(yù)測靶基因進(jìn)行評分估計(jì)。

DAVID(http：//www.david.abcc.ncifcrf.gov/)數(shù)據(jù)庫通過生物學(xué)分析,全面計(jì)算基因在疾病與代謝中的相關(guān)通路、蛋白質(zhì)的互作關(guān)系等。

Vesiclepedia(http：//microvesicles.org/index.html)為收集不同囊泡分子的集合數(shù)據(jù)庫,其中包含了獨(dú)立研究的349 988 個蛋白、27 646 個m RNA、10 520個miRNA、639個脂質(zhì)條目、41個不同物種?？赏ㄟ^根據(jù)物種、囊泡、分子和樣品類型瀏覽和檢索目的蛋白或核酸。

1.2 健康奶牛及乳房炎奶牛乳腺組織差異表達(dá)miRNA的鑒定研究前期,通過在相同飼養(yǎng)管理?xiàng)l件下,利用體細(xì)胞鑒定、細(xì)菌學(xué)鑒定及奶樣PCR 鑒定3種方法,獲得健康奶牛及金葡菌乳房炎奶牛各3頭,屠宰獲取乳腺組織后,提取組織總RNA,利用Solexa第2代高通量測序技術(shù),構(gòu)建健康奶牛及乳房炎奶牛的乳腺組織miRNA 表達(dá)譜,并通過差異分析,以獲得2個文庫差異表達(dá)的已知miRNA。

1.3 奶牛乳汁外泌體中miRNA的獲取主要采用以下3種方法收集。首先通過Vesiclepedia數(shù)據(jù)庫檢索奶牛乳汁外泌體中存在的miRNA,然后參考IZUMI等[12]利用超速離心和微陣列分析方法鑒定獲得的奶牛乳汁外泌體miRNA；同時參考SUN等[10]從對照組和感染金葡菌奶牛中純化乳汁外泌體中提取并鑒定獲得的miRNA。3個篩選結(jié)果求并集。

1.4 乳汁外泌體中與乳房炎抗性相關(guān)miRNA 篩選及靶基因分析

1.4.1 乳汁外泌體中乳房炎抗性相關(guān)miRNA 以前期健康奶牛及金葡菌乳房炎奶牛乳腺組織差異表達(dá)miRNA 為背景,與數(shù)據(jù)庫及文獻(xiàn)檢索出奶牛乳汁外泌體中的miRNA 求交集,篩選牛奶乳汁外泌體中與可能參與乳房炎抗性的相關(guān)miRNA。

1.4.2 乳汁外泌體中與乳房炎抗性相關(guān)miRNA 序列保守性分析 獲取各物種miRNA 的成熟序列,對其在牛、人類、豬、鼠、馬、犬、黑猩猩、大猩猩、恒河猴等哺乳動物中的保守性進(jìn)行序列對比分析。

1.4.3 奶牛乳汁外泌體中乳房炎抗性相關(guān)miRNA候選靶基因預(yù)測及功能分析 對鑒定得到的miRNA 進(jìn)行靶基因預(yù)測,獲得miRNA 與候選靶基因間的靶向?qū)?yīng)關(guān)系。主要通過Targetscan、miRDB和miRandasan 3個生物信息學(xué)系統(tǒng),根據(jù)miRNA 5′端的2～8位核苷酸幾乎無一例外地與靶m RNA序列的3′-UTR(3′-非翻譯區(qū))完全互補(bǔ)的特性,同時結(jié)合miRNA 與靶基因形成二聚體的熱力學(xué)穩(wěn)定性和二級結(jié)構(gòu)等限制條件進(jìn)行靶基因預(yù)測。繼而,利用DAVID 基因注釋工具對分析得到的差異表達(dá)miRNA 的候選靶基因進(jìn)行Gene Ontology與Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes分析,重點(diǎn)關(guān)注可參與炎癥發(fā)生相關(guān)的免疫調(diào)控通路。

2 結(jié)果

2.1 健康奶牛與金葡菌乳房炎奶牛乳腺組織差異表達(dá)miRNA的鑒定經(jīng)過表達(dá)譜差異分析,共篩選獲得29個已知的差異表達(dá)miRNA,其中10個是表達(dá)上調(diào),19個表達(dá)下調(diào),結(jié)果見表1。

2.2 乳汁外泌體中與乳房炎抗性相關(guān)的miRNA

通過Vesiclepedia數(shù)據(jù)庫與文獻(xiàn)查找,共獲得奶牛乳汁外泌體中miRNA 66個,其中篩選出3個在健康奶牛及乳房炎奶牛乳腺組織中差異表達(dá)的miRNA,分別是miR-223、miR-125b和miR-378b。

2.3 乳汁外泌體中與乳房炎相關(guān)miRNA 的序列保守性分析在Targetscan數(shù)據(jù)庫中,通過對哺乳動物的miR-223、miR-125b 和miR-378b 進(jìn)行比對,如：牛、人類、豬、鼠、馬、犬、黑猩猩、大猩猩、恒河猴等,分析物種類間miRNA 的保守性,結(jié)果如表2所示,表明三者在各物種間均高度保守。

2.4 乳汁外泌體中與乳房炎抗性相關(guān)miRNA 候選靶基因的預(yù)測及功能分析通過Targetscan軟件共預(yù)測獲得miR-223候選靶基因366個,miR-125b候選靶基因849 個,miR-378b 候選靶基因2 317個。通過DAVID 數(shù)據(jù)庫分析與miRNA 結(jié)合評分較高的前10 個靶基因的KEGG 通路,結(jié)果顯示miR-223主要參與m TOR 信號通路、黏蛋白型O-聚糖的生物合成、病毒致癌作用等信號通路等(表3)。miR-125b靶基因的KEGG 通路主要為甘油磷脂代謝、病毒致癌作用、甘油磷脂代謝、癌癥通路等(表4)。miR-378b 靶 基 因 的KEGG 通 路 主 要 為MAPK 通路、癌癥通路、內(nèi)吞作用、溶酶體等(表5)。

表1 健康奶牛及乳房炎奶牛乳腺組織差異表達(dá)的已知miRNA

表2 不同物種miR-223、miR-125b和miR-378b的成熟序列比較

表3 mIR-223主要靶基因及KEGG 信號通路

表4 miR-125b主要靶基因及KEGG 信號通路

3 討論

基因組的非蛋白質(zhì)編碼區(qū)實(shí)際上組成了極為復(fù)雜的RNA 基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò),miRNA 是其中備受關(guān)注的一員。miRNA 作為研究熱點(diǎn),被認(rèn)為是高效的基因表達(dá)調(diào)控因子。異常表達(dá)的miRNA 影響細(xì)胞增殖、凋亡、分化、血管生成及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)等一系列生物學(xué)行為。尤其在腫瘤的演變中發(fā)揮著致癌基因或者抑癌基因的作用[13-16],包括肺癌、肝癌在內(nèi)的各大癌癥。而奶牛乳房炎抗性已有近60年的研究歷史,已從mRNA 水平篩選出很多抗性因子,但調(diào)節(jié)基因的關(guān)鍵靶點(diǎn)及作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究挖掘。其中miRNA 不可避免地參與其中,已有研究揭示在HMGB1的3’UTR 存在一個新的SNP位點(diǎn)會改變HMGB1與bta-miR-223 的結(jié)合,從而影響奶牛體細(xì)胞的評分,這個新的基因型以及bta-miR-223 可用于奶牛乳房炎抗病育種的候選標(biāo)記物[17]。包裹在乳腺組織外泌體中的miRNA 可能成為許多乳腺疾病新的分子標(biāo)志物和有效的診斷標(biāo)志物。本研究篩選出的乳汁外泌體中miR-223、miR-125b 和miR-378b在物種間高度保守,其靶基因KEGG 信號通路顯示都與炎癥、癌癥的發(fā)生顯著相關(guān),因此深入探索乳腺組織外泌體miRNA 對乳腺疾病的研究、代謝的了解以及奶牛乳制品調(diào)控都具有重要意義。

表5 miR-378b主要靶基因及KEGG 信號通路

本研究篩選獲得的bta-miR-223已發(fā)現(xiàn)其可參與各大組織的炎癥反應(yīng),靶基因功能分析顯示其參與了體內(nèi)各大通路的調(diào)節(jié)。關(guān)于miR-223 在疾病中的研究已有報道,但定位于奶牛乳汁外泌體中的miR-223 如何參與機(jī)體的調(diào)控還鮮有報道。ZHU[18]等通過qRT-PCR、Westernblot、免疫組織化學(xué)、透射電子顯微鏡、納米顆粒跟蹤分析等方法,證明巨噬細(xì)胞衍生的外泌體將miR-223 遞送至卵巢癌細(xì)胞引發(fā)化療耐藥性。CHEN[19]等得出骨髓干細(xì)胞衍生的外泌體可以在自身免疫性肝炎的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭斜Ｗo(hù)肝損傷,其機(jī)制可能與外源性miR-223調(diào)節(jié)NLRP3和Caspase-1有關(guān)。此外,PU 等[20]在制備鏈球菌感染乳腺模型的基礎(chǔ)上,構(gòu)建模型組與健康組奶牛乳腺組織的miRNA 表達(dá)譜,結(jié)果顯示,與健康組相比,miR-223 在模型組中也顯著上調(diào)。可見miR-223可參與多種疾病包括奶牛乳房炎的發(fā)生及免疫調(diào)控過程。但其具體的分子作用機(jī)制及通過外泌體為載體作用的研究還有待更多的試驗(yàn)驗(yàn)證。

截至目前,miR-125b 相關(guān)研究主要涉及肝癌[21]、卵巢癌[22]等。YAO 等[23]通過生物信息學(xué)分析和熒光素酶報告分析曾表明miR-125b通過靶向BMPR1B調(diào)控牦牛卵巢GC細(xì)胞凋亡。JIA[24]采用LPS模擬小鼠軟骨形成的ATDC5 細(xì)胞系炎性損傷,通過雙熒光素酶活性測定評估m(xù)iR-125b 對MIP-1α3′UTR 的靶向作用,通過Westernwlot評估m(xù)iR-125b對MIP-1α表達(dá)的調(diào)節(jié)作用和對炎性損傷的潛在調(diào)節(jié)機(jī)制,得出miR-125b 可能在軟骨細(xì)胞炎癥損傷中發(fā)揮重要作用,miR-125b通過調(diào)節(jié)MIP-1α的表達(dá)來調(diào)控NF-κB 和JNK 信號通路,影響ATDC5細(xì)胞的炎癥損傷。已有研究表明miR-125b可通過外泌體為載體調(diào)控生理和病理過程。ZHU 等[25]發(fā)現(xiàn)缺氧誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞衍生的外泌體通過miR-125b抑制心肌梗死細(xì)胞死亡促進(jìn)心臟修復(fù)。

而miR-378b,已有研究表明其具有通過作用于靶基因調(diào)節(jié)皮膚的衰老[26]、與細(xì)胞遷移和侵襲密切相關(guān)[27]、對成骨的調(diào)節(jié)[28]、調(diào)控脂肪的形成[29]等作用。WANG 等[30]通過試驗(yàn)證明miR-378b通過抑制NKX3.1 表達(dá)促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞的分化,抑制miR-378b表達(dá)可以拮抗鈣誘導(dǎo)的分化過程。miR-378b可作為表皮分化過程中重要的調(diào)控因子,并參與眾多疾病反應(yīng)。結(jié)合牛奶外泌體對miR-378b進(jìn)行研究,將有助于揭示皮膚損傷、奶牛疾病、人類疾病的標(biāo)記和修復(fù)過程的標(biāo)志跟蹤,推動miRNA 在創(chuàng)傷臨床治療中的進(jìn)一步應(yīng)用。

綜上所述,奶牛乳汁外泌體中的miRNA 及其候選靶基因可參與癌癥以及炎癥的發(fā)展過程和相關(guān)通路。且除miR-223外,另外2種miRNA 在奶牛乳房炎抗性中的相關(guān)研究應(yīng)用仍鮮有報道。因此本研究可為后期外泌體中的miRNA 及其候選靶基因調(diào)控奶牛乳腺疾病以及跨物種間免疫調(diào)控的影響因素及作用機(jī)制研究提供重要參考。