路廣計(jì) 王曉芳 馬宏偉 張 濤 范京慧 劉天駒 軒秋燕范葶莉 邵麗瑋 程麗華 邊青巖

1.河北省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，石家莊050000；2.河北省畜牧獸醫(yī)研究所，河北保定071000；3.河北省石家莊市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，石家莊050000；4.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，河北保定071000；5.滄州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河北滄州061000；6.河北省饒陽(yáng)縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，河北饒陽(yáng)053900

牛結(jié)核病主要是由牛型結(jié)核分支桿菌引起的一種人畜共患、慢性、消耗性傳染病，病原菌可通過空氣、接觸或牛奶感染人畜，嚴(yán)重威脅著動(dòng)物和人類健康[1]。牛結(jié)核病的監(jiān)測(cè)和凈化在活畜上需要依賴快速、敏感、特異性強(qiáng)的診斷方法。目前廣泛應(yīng)用的診斷方法主要包括結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)（TST）、歐盟皮內(nèi)比較變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)（SICTT）和牛γ干擾素酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（IFN-γ-ELISA）。TST 作為OIE 指定法定檢疫方法，優(yōu)點(diǎn)是敏感性高，但操作費(fèi)時(shí)費(fèi)力，特異性差，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性或早期感染易漏檢[2-3]。SICTT 是TST 方法的改進(jìn)，可排除檢疫中禽結(jié)核干擾導(dǎo)致的非特異性變態(tài)反應(yīng)的影響，以避免不必要的淘汰和損失，目前歐盟等國(guó)普遍作為活畜檢疫確認(rèn)試驗(yàn)[4]。IFN-γ-ELISA 檢測(cè)試劑盒是外周血γ- 干擾素體外釋放檢測(cè)法在實(shí)際中的應(yīng)用，操作簡(jiǎn)單、敏感性和特異性高，目前已經(jīng)得到全世界的廣泛認(rèn)可[5]。本研究同時(shí)采用以上3 種方法對(duì)河北省石家莊市欒城縣某奶牛場(chǎng)進(jìn)行平行檢測(cè)，比較不同檢疫方法對(duì)奶牛結(jié)核病陽(yáng)性率的影響，為今后檢疫和奶牛結(jié)核病的凈化提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材 料

1）試驗(yàn)?zāi)膛?。中?guó)荷斯坦奶牛300 頭，試驗(yàn)?zāi)膛Ｍ庥^健康，無任何結(jié)核病臨床癥狀，統(tǒng)一TMR 飼喂，自由飲水。

2）主要試劑。牛型提純結(jié)核菌素（牛PPD，青島瑞爾生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：P201906-001）；禽型結(jié)核菌素（禽PPD，青島瑞爾生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：P201906-001）；牛結(jié)核分枝桿菌IFN-γ 檢測(cè)試劑盒（青島瑞爾生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：P201906-001）。

3）器材。剃毛刀、注射器、游標(biāo)卡尺、酶標(biāo)儀，CO2培養(yǎng)箱、細(xì)胞培養(yǎng)板、肝素鈉采血管、移液器、槍頭等。

1.2 方 法

3 種方法同時(shí)進(jìn)行，在頸部右側(cè)進(jìn)行SICTT試驗(yàn)，同時(shí)尾根靜脈采血進(jìn)行IFN-γ-ELISA 試驗(yàn)。

1）SICTT。參照《動(dòng)物結(jié)核病診斷技術(shù)》（GB/T18645-2002） 操作，采用牛型PPD、禽型PPD，統(tǒng)一在牛頸部右側(cè)分點(diǎn)皮內(nèi)注射，2 個(gè)注射點(diǎn)間隔12～15 cm。注射量分別為牛PPD 0.1 mL/頭（2 000 IU），禽型PPD 0.1 mL/頭（2 500 IU）。注射前剃毛、測(cè)量初始皮皺厚，注射后72 h 測(cè)量反應(yīng)皮皺厚。注射前和試驗(yàn)測(cè)量由專人完成。

2）IFN-γ-ELISA。尾根采血于肝素鈉抗凝管中，8 h 內(nèi)送實(shí)驗(yàn)室，嚴(yán)格按照IFN-γ-ELISA 試劑盒說明書操作并測(cè)定和記錄OD 值。

1.3 結(jié)果判定

1）TST判定。陽(yáng)性：局部有明顯的炎性反應(yīng)，皮厚差≥4.0 mm為陽(yáng)性；可疑：2.0 mm≤皮厚差＜4.0 mm；陰性：皮厚差＜2.0 mm。

2）SICTT 結(jié)果判定。先按照TST 標(biāo)準(zhǔn)判定。陽(yáng)性：牛型PPD 反應(yīng)陽(yáng)性，牛型PPD 皮厚差－禽型PPD 皮厚差≥4 mm；可疑：牛型PPD 反應(yīng)陽(yáng)性，1.0 mm＜牛型PPD 皮厚差－禽型PPD 皮厚差＜4.0 mm；陰性：牛型PPD 反應(yīng)是陽(yáng)性或陰性，牛型PPD 皮厚差≤禽型PPD。

3）IFN-γ-ELISA。牛結(jié)核陽(yáng)性：牛型OD 值－禽型OD 值≥0.1，且牛型OD 值－PBSOD 值≥0.1。牛結(jié)核陰性：牛型OD 值－禽型OD 值＜0.1 或牛型OD 值－PB 的SOD 值＜0.1。禽結(jié)核陽(yáng)性：禽型OD值≥牛型OD 值，且禽型OD 值－PBSOD 值≥0.1。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛TST、SICIT、IFN-γ-ELISA 試驗(yàn)結(jié)果

由表1 可知，牛TST 檢測(cè)陽(yáng)性103 頭，陽(yáng)性率為34.3%；SICTT 檢測(cè)陽(yáng)性牛93 頭，陽(yáng)性率為31%；IFN-γ-ELISA 檢測(cè)陽(yáng)性牛153 頭，陽(yáng)性率為51%。

2.2 3 種不同檢測(cè)方法陽(yáng)性檢出率的對(duì)比分析

從表2- 表4 的檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)可以看出，TST 和SICTT 檢測(cè)相比，均為陽(yáng)性的有93 頭，陽(yáng)性符合率為94.89%；均為陰性的有197 頭，陰性符合率為97.52%。TST 與IFN-γ-ELISA 對(duì)比，均為陽(yáng)性的有45 頭，陽(yáng)性符合率為31.16%；均為陰性的有89 頭，陰性符合率為51.74%。SICTT 與IFN-γ-ELISA 對(duì)比，均為陽(yáng)性的有40 頭，陽(yáng)性率為38.83%；均為陰性的有94 頭，陰性符合率為53.10%。

表1 不同試驗(yàn)方法檢測(cè)結(jié)果 頭

表2 TST 與SICTT 對(duì)比 頭

表3 TST 與IFN-γ-ELISA 對(duì)比 頭

表4 IFN-γ-ELISA 與SICTT 對(duì)比 頭

2.3 綜合對(duì)比分析

1）TST 判定為陽(yáng)性牛的分析。如表5 所示，TST判定為陽(yáng)性的牛共計(jì)103 頭，其中40 頭牛SICTT和IFN-γ-ELISA 均判定為牛型陽(yáng)性，確定為陽(yáng)性；34 頭SICTT 判定為陽(yáng)性，IFN-γ-ELISA 判定為陰性，確定為陽(yáng)性；19 頭牛SICTT 判定為陽(yáng)性，SICTT判定禽陽(yáng)性，確定為陽(yáng)性（雙陽(yáng)性）；1 頭牛SICTT 判定為可疑，IFN-γ-ELISA 判定為禽陽(yáng)性，確定為陽(yáng)性（雙陽(yáng)性）；1 頭牛SICTT 判定為可疑，IFN-γ-ELISA 判定均為陰性，判定為陽(yáng)性；2 頭牛SICTT 判定為陰性，IFN-γ-ELISA 判定均為陰性，確定為陰性；5 頭牛 SICTT 判定為陰性，IFN-γ-ELISA 判定為牛陽(yáng)性，確定為陽(yáng)性；1 頭牛SICTT 判定為陰性，IFN-γ-ELISA 判定為禽陽(yáng)性，確定為陰性（禽陽(yáng)性）。綜合判定，確定牛型結(jié)核陽(yáng)性牛100 頭，陰性3 頭（禽型1 頭）。

表5 TST 判定為陽(yáng)性牛

2）TST 判定為可疑牛的分析。如表6 所示，TST判定為可疑的牛共計(jì)19 頭，其中SICTT 判定可疑、IFN-γ-ELISA 判定牛型陽(yáng)性牛4 頭，確定為陽(yáng)性；SICTT 判定可疑、IFN-γ-ELISA 判定均為陰性牛7頭，確定為陰性；SICTT 判定可疑、IFN-γ-ELISA 判定為禽型陽(yáng)性牛3 頭，確定為陰性（禽型）；SICTT 判定陰性、IFN-γ-ELISA 判定為牛型陽(yáng)性牛2 頭，確定為陽(yáng)性；SICTT 和IFN-γ-ELISA 判定均為陰性牛3 頭，確定為陰性。綜合判定，牛型結(jié)核陽(yáng)性牛6頭，陰性13 頭（其中禽型3 頭）。

表6 TST 判定為可疑牛

3）TST 判定為陰性牛的分析。如表7 所示，TST判定為陰性的牛共計(jì)178 頭。其中，SICTT、IFN-γ-ELISA 判定均為可疑的牛61 頭，確定為陰性；SICTT 陰性、IFN-γ-ELISA 判定為禽陽(yáng)性牛15頭，確定為陰性（禽型）；SICTT 判定陰性、IFN-γ-ELISA 判定為牛型陽(yáng)性牛99 頭，確定為陽(yáng)性；SICTT 判定可疑、IFN-γ-ELISA 判定為牛型陽(yáng)性牛3 頭，確定為陽(yáng)性。綜合判定，牛型結(jié)核陽(yáng)性牛102 頭，陰性76 頭（其中禽型15 頭）。

4）綜合判定結(jié)果。綜上所述，檢測(cè)的300 頭牛共確定牛型結(jié)核陽(yáng)性牛208 頭（其中20 頭雙陽(yáng)），陰性92 頭（其中禽型19 頭）。牛型結(jié)核陽(yáng)性率為69.33%，禽型結(jié)核陽(yáng)性率為6.33%，二者混合感染率為6.66%。

3 討 論

本研究同時(shí)應(yīng)用TST、SICTT 和IFN-γ-ELISA 3 種不同的檢測(cè)方法對(duì)試驗(yàn)牛場(chǎng)進(jìn)行牛結(jié)核篩查，綜合對(duì)比判定結(jié)果表明，試驗(yàn)牛群結(jié)核病感染率達(dá)69.33%（208/300），感染類型既有牛型結(jié)核分枝桿菌感染，又有禽結(jié)核分枝桿菌感染，牛型結(jié)核陽(yáng)性率、禽型結(jié)核陽(yáng)性率、二者混合感染率分別為69.33%、6.33%、6.66%。

3 種方法檢測(cè)均為陽(yáng)性的牛有40 頭，均為陰性的61 頭，總符合率僅為33.67%，說明每種檢測(cè)方法各有優(yōu)缺點(diǎn)。TST 和SICTT 相比，陽(yáng)性符合率為94.89%，符合程度較高，說明在本牛場(chǎng)的檢疫中其敏感性和特異性相差不大。 TST、SICTT 與IFN-γ-ELISA 相比，陽(yáng)性符合率分別為31.16%和51.00%，陽(yáng)性符合率較低。這是由于遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的滯后效應(yīng)和人為誤差造成出現(xiàn)假陰性結(jié)果，致使其敏感性降低[6]。SICTT 雖然在TST 基礎(chǔ)上可有效排除部分因感染禽結(jié)核引起的假陽(yáng)性，相對(duì)提高特異性，但敏感性仍不高。這與近年來國(guó)外多數(shù)研究結(jié)果相一致[7-8]。IFN-γ-ELISA 的敏感性和特異性均較高，操作簡(jiǎn)單、快速，結(jié)果客觀、感染早期牛也可檢出；缺點(diǎn)是試劑成本較高，每份樣品50～100 元。

4 結(jié) 論

綜合分析，對(duì)于牛分枝桿菌感染率較高且有其他病原感染的牛群，可采用成本較低的TST 初篩，然后采用IFN-γ-ELISA 復(fù)檢以排除部分假陽(yáng)性。鑒于IFN-γ-ELISA 可檢出早期感染牛，對(duì)于實(shí)施結(jié)核病凈化的牛場(chǎng)，按上述程序經(jīng)過幾輪普檢后，可直接采用IFN-γ-ELISA 的方法進(jìn)行檢測(cè)。