王 靜，金理輝，張 琪，孫 錕，于 昱

上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院小兒心血管科，心血管發(fā)育與再生醫(yī)學研究所，上海200092

完全性肺靜脈異位引流（total anomalous pulmonary venous connection， TAPVC）是一類罕見的先天性心臟病，占先天性心臟病發(fā)病的1.5%～3%；在活產(chǎn)嬰兒中，其發(fā)病率為1/15 000[1-2]。目前，TAPVC按病理解剖分型分為心上型、心內(nèi)型、心下型及混合型。TAPVC臨床表現(xiàn)較為嚴重，患兒出現(xiàn)紫紺、心臟雜音，常伴呼吸衰竭和心力衰竭等嚴重的癥狀而需要早期手術(shù)治療；如不早期手術(shù)，80%的患兒2歲內(nèi)會死亡[3-4]。心臟超聲往往可以明確診斷及分型。目前，關(guān)于TAPVC的基因?qū)W研究報道較少，主要通過散發(fā)病例進行生物信息學測序分析篩選候選致病基因，且先天性心臟病由多基因?qū)е拢∫驈碗s，其發(fā)病機制尚未闡明。因而，收集大量TAPVC樣本進行生物學分析并研究其發(fā)病機制，對于該病的診斷及預防具有重大的臨床意義。

Nash等[5]通過全基因組測序方法分析2例TAPVC患者，發(fā)現(xiàn)視黃醇結(jié)合蛋白 5（retinol binding protein 5，RBP 5）基因存在突變。另有研究[6]通過全基因組測序方法檢測6例TAPVC 患者及81名對照，發(fā)現(xiàn)激活素受體酶 1（activin receptor like kinase 1，ACVRL1） 及肌三角（sarcoglycan delta，SGCD） 2個基因存在突變，并在另外12 例TAPVC 患者中驗證了這些突變。截止到目前，TAPVC 相關(guān)的高通量測序研究仍然很少，其原因與該病發(fā)病率較低使得樣本收集較為困難，且該病有著較高的致死率使得早期臨床診斷相對困難等有關(guān)。

2014—2019年，我們收集了78 例散發(fā)TAPVC 病例和100 例正常健康兒童血液樣本及完整的臨床資料。血液樣本通過抽提出 DNA 進行全外顯子測序（whole exome sequencing，WES）以檢測其可能的致病基因和突變位點。WES是利用序列捕獲技術(shù)將全基因組外顯子區(qū)域DNA捕捉并富集后進行高通量測序的基因組分析方法，是一種選擇基因組的編碼序列的高效策略，對研究已知基因的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）、Indel等具有較大的優(yōu)勢。為了明確TAPVC的致病基因，我們通過SNP-based 關(guān)聯(lián)分析和 Gene-based 負荷分析等生物信息學手段對 WES 的數(shù)據(jù)進行分析處理，最后初步篩選得到候選基因Rho鳥嘌呤核苷酸交換因子16（ARHGEF16）。ARHGEF16突變位點包括 c.C236＞T（A79V）和 c.G619＞C（G207R）。ARHGEF16編碼的蛋白功能尚不明確，其參與蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)-脂質(zhì)的相互作用；可刺激RHOG相關(guān)GDP與GTP的交換，介導EPHA2激活RAC1而在趨化細胞遷移中發(fā)揮作用，也可以通過病毒蛋白HPV16 E6.1激活CDC42并介導CDC42的激活[7-8]。本研究主要根據(jù)WES進行生物信息學分析[9]，進一步對候選基因ARHGEF16在細胞中的突變功能進行分析，并探討其可能調(diào)控的下游靶基因，以期為闡明TAPVC發(fā)病遺傳分子機制提供理論依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象

收集在上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院及兒童醫(yī)學中心通過心臟彩色超聲、心導管、腹部超聲、CT或手術(shù)記錄確診為TAPVC的患兒血液標本（病例組），同時收集與病例組年齡和性別相匹配的健康兒童血液作為對照組。2014—2019年獲得病例組血漿 210 例，對照組血漿150 例。已完成生物樣本采集和流行病資料收集。研究獲得醫(yī)院倫理委員會審批，倫理審查編號為XHEC-C-2017-KJB-003。

1.2 方法

1.2.1 TAPVC 可能致病基因的生物信息學分析 對78例

TAPVC患兒和100名正常對照兒童WES數(shù)據(jù)進行基于致病基因和致病SNP的關(guān)聯(lián)分析，獲得TAPVC的可能致病的候選基因ARHGEF16。在新增的100 例患兒中作更高深度的目標區(qū)域靶向捕獲測序以進行驗證[9]（數(shù)據(jù)未顯示）。

通過人群基因組數(shù)據(jù)庫，參考常見數(shù)據(jù)庫包括1000G、Kaviar、ExAC、 ESP6500等篩選出最小等位基因頻率（minor allele frequency，MAF）小于0.01的罕見突變，參考SIFT、PolyPhen-2、Mutation Taster 等數(shù)據(jù)庫篩選出致病可能性高的ARHGEF16的突變位點C236T和G619C。隨后，評估變異在核苷酸或氨基酸水平造成的影響，包括其引起的轉(zhuǎn)錄的變化以及對蛋白質(zhì)功能的影響。

1.2.2ARHGEF16突變位點的Sanger驗證 設計人類基因ARHGEF16（NM_014448.4）特異性引物（表1），以入選病例及對照樣本DNA為模板，PCR擴增特異性片段，Sanger測序法驗證變異位點。

表1 引物序列Tab 1 Primers sequence

1.2.3 質(zhì)粒構(gòu)建 GV358-ARHGEF16質(zhì)粒購于吉凱基因生物公司。以野生型質(zhì)粒為模板，設計構(gòu)建突變質(zhì)粒的引物（表1）。用KOD-Plus-Neo（TOYOBO）酶對模板進行定點突變，得到突變質(zhì)粒C236T、G619C。突變質(zhì)粒送華大生物公司進行Sanger測序，測序結(jié)果用NCBI BLAST網(wǎng)站與GenBank中ARHGEF16比較，分析突變位置是否正確。

1.2.4 細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 人腎上皮細胞系（293T）購于中國科學院細胞庫，在含有10%胎牛血清（MP Biomedicals）和1%青霉素-鏈霉素混合液（Gibco）的高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)（Hyclone）。培養(yǎng)條件設置為37 ℃，5% CO2。對數(shù)生長期時用FuGene轉(zhuǎn)染試劑（Promega）轉(zhuǎn)染空載（GV358）、ARHGEF16野生型質(zhì)粒（WT）、ARHGEF16突變質(zhì)粒（C236T、G619C）。轉(zhuǎn)染48 h后用RT-qPCR檢測轉(zhuǎn)染效率和mRNA表達量變化。

1.2.5 RT-qPCR 將293T細胞以4×105個/mL的密度接種于6孔板，待細胞融合度達到60%～70%時轉(zhuǎn)染GV358、WT、C236T和 G619C。48 h后用 TRIzol裂解細胞提取RNA。將1 μg RNA用PrimeScript? RT Master Mix （Takara）反轉(zhuǎn)錄為cDNA，RT-qPCR采用15 μL體系，包括cDNA為2 μL，正、反引物各0.3 μL（引物序列見表1），2×SYBR （Takara） 7.5 μL，50×ROX DyeⅡ0.3 μL 及 dd H2O 4.6 μL， 在 AIpplied Biosystems 7500 上進行反應，按照預變性95 ℃ 30 s，PCR反應95 ℃ 5 s、64 ℃ 34 s（40個循環(huán)）的條件進行擴增。GAPDH作為內(nèi)參。使用2-△△CT法對ARHGEF16 mRNA表達量進行相對定量。

1.2.6 蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting） 293T細胞接種于12孔板并分別轉(zhuǎn)染空載、WT-ARHGEF16、C236T和G619C。轉(zhuǎn)染48 h后用RIPA和PMSF裂解細胞，并收集蛋白。用BCA試劑盒（碧云天）測濃度后加蛋白緩沖液100 ℃變性10 min。取30 μg上述變性蛋白樣本進行15%SDS-PAGE電泳，電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上（Millipore）。脫脂牛奶室溫封閉2 h，ARHGEF16的一抗（Proteintech）和anti-GAPDH 4 ℃孵育過夜。分別用山羊抗兔和抗鼠二抗室溫孵育2 h，ECL發(fā)光試劑盒（Millipore）顯影蛋白。

1.2.7 生物信息學方法 利用STRING軟件（https://string-db.org/）進行蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡分析，通過輸入ARHGEF16和已知血管生成、TAPVC等的相關(guān)基因，預測ARHGEF16與其他基因編碼的蛋白相互作用。用 Cytoscape軟件制作網(wǎng)絡相互作用圖（https://cytoscape.org/），從文獻中挑選100個與血管發(fā)育、TAPVC等相關(guān)的基因編碼的蛋白與ARHGEF16進行相互作用分析。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 入選病例信息

入選的2例患兒經(jīng)超聲檢查分別確診為心上型和心內(nèi)型的TAPVC。入院時已經(jīng)出現(xiàn)發(fā)紺、喂養(yǎng)困難及呼吸衰竭等癥狀?；純焊改阜裾J有家族性先天性心臟病的病史。Mutation Taster網(wǎng)站預測這2個突變位點均具有致病性，MAF均小于0.05，SIFT評分分別為0.12和0.38（數(shù)值越小，引起蛋白質(zhì)功能改變的可能性越大）。2例患兒具體病例信息如表2所示。

表2 入選TAPVC患兒的臨床信息和ARHGEF16突變位點的特征Tab 2 Clinical information and variant characteristics of ARHGEF16 in TAPVC patients

2.2 Sanger測序結(jié)果和突變保守性分析

Sanger測序結(jié)果顯示入選的2例患兒第2、3外顯子區(qū)c.C236T、c.G619C的改變導致第79位氨基酸從丙氨酸（GCG）變成纈氨酸（GGT），第207位氨基酸從甘氨酸變成精氨酸，且這2個雜合突變位點在正常對照組中未發(fā)現(xiàn)（圖 1）。

圖1 病例組及對照組兒童的ARHGEF16測序峰圖Fig 1 Sequence chromatograms of ARHGEF16 missense variants in patients and controls

另外，我們發(fā)現(xiàn)這2個突變位點在人類、豚尾猴、褐家鼠等脊椎動物中具有共同的保守序列，表明這2個位點具有重要的作用，其突變可能導致ARHGEF16功能的改變（圖2）。

圖2 ARHGEF16在不同物種之間的編碼蛋白質(zhì)序列Fig 2 Conservation of ARHGEF16 variants among different species

2.3 ARHGEF16 mRNA和蛋白表達量分析

通過RT-qPCR分析WT、突變型C236T和G619C組ARHGEF16 mRNA表達量差異。結(jié)果如圖3A所示，較WT組相比，C236T和G619C組ARHGEF16 mRNA表達量顯著上調(diào)（P=0.001）。Western blotting結(jié)果顯示，與WT組相比，C236T和G619C組ARHGEF16蛋白表達量上調(diào)顯著（P=0.002，P=0.001），其相對表達量分別為WT組的1.9和2.2倍，表明這2個位點的錯義突變對蛋白表達量產(chǎn)生影響（圖3B）。

圖3 ARHGEF16 mRNA和蛋白表達分析（n=3）Fig 3 Analysis of mRNA and protein expression of ARHGEF16 (n=3)

2.4 ARHGEF16與編碼血管發(fā)育相關(guān)基因的蛋白相互作用分析

ARHGEF16位于1號染色體，由15個外顯子和14個內(nèi)含子組成，可以促進人腦膠質(zhì)瘤細胞的遷移[10-11]。Cytoscape結(jié)果顯示ARHGEF16與RAC1存在直接關(guān)聯(lián)（圖4），可能通過RAC1與其他血管發(fā)育類基因相互作用，其中VAV2和KDR是已知的TAPVC可能致病候選基因[9]，從而最終在TAPVC的發(fā)育形成過程中發(fā)揮重要作用。

圖 4 ARHGEF16和其他血管類相關(guān)基因之間的蛋白相互作用網(wǎng)絡圖Fig 4 Protein-protein interaction network between ARHGEF16 and other genes with angiogenetic functions

2.5 ARHGEF16過表達對RAC1 mRNA表達量影響

蛋白相互作用分析結(jié)果顯示，ARHGEF16與RAC1存在直接相互作用。用ARHGEF16質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細胞，收集細胞RNA，通過RT-qPCR分析ARHGEF16 對RAC1 mRNA表達調(diào)控。結(jié)果如圖5所示，ARHGEF16過表達時RAC1的表達量上調(diào)（P=0.006）。

圖5 ARHGEF16過表達對RAC1表達的影響Fig 5 Analysis of RAC1 mRNA expression in HEK293 cells with ARHGEF16 overexpression

3 討論

TAPVC患兒出生后往往出現(xiàn)青紫、呼吸急促、喂養(yǎng)困難、日益加重的心力衰竭，如不給予治療，多在3個月左右死亡。然而，TAPVC的發(fā)病機制尚不明確，Neill等[12]1960年首次在彎刀綜合征中描述了 TAPVC。隨后，遺傳學研究表明，TAPVC 為常染色體顯性遺傳，具有不完全外顯率及可變表達特性。有研究[13-14]表明，編碼血管內(nèi)皮生長因子受體2的基因（KDR）和編碼血小板衍生生長因子受體α（PDGFRA）的基因參與TAPVC的發(fā)生。PDGFRA基因在小鼠心系膜中被敲除后，出現(xiàn) TAPVC的表型，表明基因PDGFRA確實與TAPVC的發(fā)生有關(guān)[15-16]。此外，從TAPVC 患者分離出的外周血淋巴細胞中發(fā)現(xiàn)基因錨鏈重復域1（ANKRD1）表達量明顯增加，提示ANKRD1的過表達也與TAPVC的發(fā)生相關(guān)。Degenhardt等[17]發(fā)現(xiàn)，軸突向?qū)б蜃?d （Semaphorin 3d，SEMA3D）基因突變小鼠具有TAPVC的表型。

迄今為止，關(guān)于TAPVC的基因?qū)W研究甚少。我們收集較大樣本量——78 例散發(fā)TAPVC病例和100例健康兒童，通過抽提全血DNA 進行WES以檢測其可能的致病基因和致病突變。通過 SNP-based 關(guān)聯(lián)分析和 Gene-based 負荷分析等生物信息學方法對 WES 的數(shù)據(jù)進行分析處理，篩選出基因ARHGEF16，其具有2個突變位點（c.C236T:p.A79V和c.G619C:p.G207R）。通過Mutation Taster在線預測發(fā)現(xiàn)這2個突變位點均為“致病性”位點；采用Clustalx 軟件分析基因序列保守性，結(jié)果顯示，這2個突變位點的基因序列在人、豚尾猴和褐家鼠等脊椎動物上高度保守，提示這2個突變位點可能具有重要的功能意義。

RT-qPCR和 Western blotting實驗結(jié)果表明，ARHGEF16（c.C236T和c.G619C）mRNA和蛋白的表達量較野生型均有上調(diào)，說明這2個位點的突變影響了ARHGEF16 mRNA及蛋白表達。另外，本研究通過Cytoscape在線分析，發(fā)現(xiàn)ARHGEF16與RAC1存在直接關(guān)聯(lián)。

ARHGEF16編碼的蛋白質(zhì)功能尚不明確，研究人員認為它與蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)-脂質(zhì)相互作用有關(guān)[7]。有研究[18]表明其參與人神經(jīng)瘤膠質(zhì)細胞的增殖和遷移、斑馬魚視神經(jīng)的再生。RAC1基因編碼的蛋白是一種GTP酶，屬于小GTP結(jié)合蛋白的Ras超家族。這個超家族的成員調(diào)節(jié)細胞內(nèi)重要生物學功能，包括細胞生長、細胞骨架重組和蛋白激酶的激活[19]。有研究[20]提出，RAC1作為血管新生的重要因子，在腫瘤的血管生成、心腦血管的穩(wěn)態(tài)等方面發(fā)揮重要的作用。Lee等[7]提出，RAC1作為ARHGEF16下游靶基因在促進凋亡細胞的清除方面發(fā)揮重要作用。在吞噬細胞中過表達ARHGEF16促進了吞噬細胞吞噬凋亡細胞，而在這個過程中，ARHGEF16可通過RhoG-Elmo-Dock4途徑激活RAC1。

ARHGEF16是否可以通過RAC1影響TAPVC等先天性心血管疾病的發(fā)生呢？RT-qPCR結(jié)果顯示在293T細胞中，ARHGEF16過表達會上調(diào)RAC1的表達量。然而在心血管發(fā)育方面，ARHGEF16對RAC1的具體調(diào)控作用需要更多功能實驗進行驗證。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)錯義突變c.C236＞T（p.A79V）、c.G619＞C（p.G207R）影響ARHGEF16 mRNA和蛋白的表達量；并且ARHGEF16對RAC1表達量的調(diào)節(jié)，可能會影響心血管發(fā)育的異常，進而影響TAPVC的發(fā)生。其具體的機制有待進一步研究。本研究可為TAPVC的診斷、治療與提前干預提供理論指導。