劉英玉，鄭曉風(fēng)，李睿鵬,鄭曉琴，朱夢含，胥 蘭，朱明月，盧 瑋，姚 剛

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院,烏魯木齊 830052)

0 引 言

【研究意義】沙門氏菌是動物源疾病和食物源疾病中常見的病菌，有廣泛的宿主，幾乎能感染人和所有的溫血動物[1]。沙門氏菌感染能引起敗血癥、腸胃炎、懷孕家畜的流產(chǎn)。沙門氏菌是革蘭氏陰性致病菌，血清型繁多，目前全世界已分離出2 523個血清型。食源性疾病的影響是巨大的[2]，主要傳播途徑涉及運(yùn)輸中的動物和未煮熟的動物食品。沙門氏菌的研究在公共衛(wèi)生方面具有現(xiàn)實(shí)意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】屠宰場中食用動物的屠宰過程被認(rèn)為是沙門氏菌引起內(nèi)臟和胴體污染的重要來源之一[3]。近年來抗菌藥物在臨床上使用越來越普遍，在抗生素的選擇性壓力下，會導(dǎo)致沙門氏菌對抗菌藥物的耐藥問題愈發(fā)嚴(yán)峻，也間接使沙門氏菌血清型以及對抗菌藥物的耐藥種類不斷增多[4]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】耐藥及多重耐藥食源性病原體的出現(xiàn)引起了廣泛關(guān)注。調(diào)查研究牛羊源沙門氏菌在某定點(diǎn)屠宰場和農(nóng)貿(mào)市場的污染分布與耐藥性調(diào)查。【擬解決的關(guān)鍵問題】調(diào)查某定點(diǎn)屠宰場和農(nóng)貿(mào)市場環(huán)節(jié)中牛羊源沙門氏菌的污染情況，采用國家標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行分離鑒定，并用紙片法檢測沙門氏菌的耐藥情況，分析新疆地區(qū)某定點(diǎn)屠宰場和農(nóng)貿(mào)市場中胴體拭子、肉樣、加工用具拭子樣品的牛羊源沙門氏菌的污染程度，分析明確菌株的耐藥性。

1 材料與方法

1.1 材 料

2018年7月在烏魯木齊市某牛羊定點(diǎn)屠宰場采集牛羊胴體拭子、肉樣、加工用具拭子樣品159份，2018年9月在庫爾勒市某牛羊農(nóng)貿(mào)市場采集牛羊胴體拭子、肉樣、加工用具拭子樣品177份，2018年10月在庫爾勒市某牛羊農(nóng)貿(mào)市場采集牛羊胴體拭子、肉樣、加工用具拭子樣品94份，2018年10月在庫爾勒市某牛羊定點(diǎn)屠宰場采集牛羊胴體拭子、肉樣、加工用具拭子樣品155份，2018年11月在烏魯木齊市某牛羊定點(diǎn)屠宰場采集羊胴體拭子、肉樣、加工用具拭子樣品96份，2019年3月前往烏魯木齊市某牛羊定點(diǎn)屠宰場采集牛胴體拭子、肉樣、加工用具拭子樣品160份，共采集樣本841份。采用滅菌棉棒采集胴體拭子、肉樣、加工用具表面拭子，裝于滅菌的離心管中，低溫帶回實(shí)驗(yàn)室盡快操作。

緩沖蛋白胨水、木糖賴氨酸脫氧膽鹽瓊脂、四硫磺酸鈉煌綠增菌液、三糖鐵瓊脂、沙門氏菌生化試劑盒均購自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；革蘭氏陰性桿菌藥敏試紙盒購自杭州天和微生物試劑有限公司。TAE購自北京鼎國昌盛有限公司；TaqMasterMix、DNA Marker購自Takara生物公司。

LDZX-50 KB立式壓力蒸汽高壓鍋購自上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-2FD博迅凈化工作臺購自上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；DHP-9162恒溫培養(yǎng)箱購自上海一恒科學(xué)儀器有限公司；PL203電子天平購自梅勒特-托利多儀器(上海)有限公司；DYCP-31 DN水平電泳槽和 DYCP-31 DN穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀購自北京六一生物科技有限公司；GELDOCXR+凝膠成像系統(tǒng)購自美國BIO-RAD公司。

大腸桿菌質(zhì)控菌ATCC25922購自中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心。

1.2 方 法

1.2.1 病原菌的分離鑒定

按照國家標(biāo)準(zhǔn)方法食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 沙門氏菌檢驗(yàn)(GB 4789.4～2016)[6]，分別取糞拭子至9 mL的緩沖蛋白胨水中，置于37℃恒溫?fù)u床中以180～200 r/min增菌18～24 h。取緩沖蛋白胨水中的菌液分別至四硫磺酸鈉煌綠增菌液中，置于37℃恒溫?fù)u床中以180～200 r/min增菌18～24 h。后將增菌液分別劃線接種至木糖賴氨酸脫氧膽鹽瓊脂瓊脂上，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h。挑取木糖賴氨酸脫氧膽鹽瓊脂上帶黑心的菌落穿刺至三糖鐵瓊脂中，再接種至生化試劑賴氨酸脫羧酶肉湯、氰化鉀、尿素酶、蛋白胨水中，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h，必要時延長至48 h。結(jié)果的判斷按照生化試劑盒中的顏色進(jìn)行判斷。

應(yīng)用國家標(biāo)準(zhǔn)方法GB 4789.4～2016對2018年7月到2019年3月在定點(diǎn)屠宰場和農(nóng)貿(mào)市場環(huán)節(jié)采集的841份牛羊源樣品進(jìn)行選擇性增菌和培養(yǎng)鑒定，挑取粉紅色菌落中間帶有黑色的典型菌落的進(jìn)行生化鑒定，按照國家標(biāo)準(zhǔn)方法GB 4789.4-2016的判斷依據(jù)。

1.2.2 藥物敏感性

按照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)的手冊[7]的Kirby-Bauer紙片擴(kuò)散法對分離的菌株進(jìn)行6大類17種藥物進(jìn)行耐藥性檢測。青霉素類(氨芐西林，哌拉西林)；頭孢菌素類(頭孢呋辛、頭孢西叮、頭孢噻吩、頭孢唑啉、頭孢哌酮、頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢吡肟、頭孢噻肟)；β-內(nèi)酰胺類(氨曲南)；氨基糖苷類(鏈霉素、妥布霉素、卡那霉素)；喹諾酮類(氧氟沙星)；大環(huán)內(nèi)酯類(麥迪霉素)。用大腸桿菌ATCC 25922作質(zhì)控菌株，判定標(biāo)準(zhǔn)按美國NCCLS操作標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Office Excel 2013軟件進(jìn)行統(tǒng)計和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛羊源沙門氏菌的分離鑒定

研究表明,A1.沙門氏菌屬有21株，A2.沙門氏菌屬有1株，甲型副傷寒有8株，沙門氏菌個別變體有17株。共分離出47株沙門氏菌屬，沙門氏菌分離率為5.59%。表1。

表1 樣品采樣信息和沙門氏菌分離鑒定

Table 1 Sample information and results ofSalmonellaisolation and identification

日期Date地點(diǎn)Area采樣點(diǎn)Samplinglocations2018.92018.102018.72018.112019.3庫爾勒市Korla烏魯木齊市Urumqi市場Market屠宰場Slaughterhouse屠宰場Slaughterhouse動物種類Animalspecies羊Sheep牛Cattle羊Sheep牛Cattle羊Sheep牛Cattle羊Sheep牛Cattle羊Sheep牛Cattle胴體拭子Carcassswab67541719564734405885菌株數(shù)Numberofstrains3411032315分離率Separationrate(%)4.487.415.885.2606.385.887.51.725.88肉樣meat23271310191818142235菌株數(shù)Numberofstrains3100100319分離率Separationrate(%)13.043.7005.260021.434.5525.71加工用具拭子Processingtoolswab6351530231640菌株數(shù)Numberofstrains1101210分離率Separationrate(%)16.672.8603.338.76.250樣品合計Totalsample968165299065827796160

牛羊源沙門氏菌在胴體拭子、肉樣、加工用具拭子的分離率分別為4.82%、9.05%、3.64%，在屠宰場中共采集牛羊胴體拭子320份，分離鑒定出14株沙門氏菌，分離率為4.38%；采集肉樣126份，分離鑒定出14株沙門氏菌，分離率為11.11%；采集加工用具拭子124份，分離鑒定出4株沙門氏菌，分離率為3.23%。在屠宰場中沙門氏菌污染程度依次為：加工用具拭子<胴體拭子<肉樣。在農(nóng)貿(mào)市場中共采集牛羊胴體拭子157份，分離鑒定出9株沙門氏菌，分離率為5.73%；采集肉樣73份，分離鑒定出4株沙門氏菌，分離率為5.48%；采集加工用具拭子41份，分離鑒定出2株沙門氏菌，分離率為4.88%。在農(nóng)貿(mào)市場中沙門氏菌污染程度依次為：加工用具拭子<肉樣<胴體拭子。圖1

圖1 牛羊源沙門氏菌在胴體拭子、肉樣、加工用具拭子的污染分布

Fig.1 Pollution distribution ofSalmonellafrom cattle and sheep in carcass swabs, meat samples and processing equipment swabs

2.2 沙門氏菌的耐藥性

研究表明,對17種抗菌藥物均存在不同程度的耐藥，耐藥率為2.13%～59.57%：氨芐西林(AMP)的耐藥率為36.17%、哌拉西林(PIP)的耐藥率為17.02%、頭孢呋辛(FRX)的耐藥率為25.53%、頭孢噻吩(CEP)的耐藥率為34.04%、頭孢哌酮(CFP)的耐藥率為10.64%、頭孢他啶(CAZ)的耐藥率為8.51%、頭孢曲松(CTRX)的耐藥率為8.51%、頭孢西叮(FOX)的耐藥率為10.64%、頭孢唑啉(CZO)的耐藥率為25.53%、頭孢吡肟(FEP)的耐藥率為6.38%、頭孢噻肟(CTX)的耐藥率為10.64%、氨曲南(AZT)的耐藥率為2.13%、鏈霉素(STR)的耐藥率為12.77%、妥布霉素(TOB)的耐藥率為14.89%、卡那霉素(KAN)的耐藥率為19.15%、氧氟沙星(OFLX)的耐藥率為23.40%、麥迪霉素(MID)的耐藥率為59.57%。圖2

注：耐藥(R)、中介(I)、敏感(S)

Note: Resistance(R); Intermediate(I); Sensitivity(S)

圖2 牛羊源沙門氏菌的耐藥性

Fig.2 Drug resistance of sheep and bovineSalmonella

表2 牛羊源沙門氏菌的多重耐藥譜

Table 2 Multidrug resistance spectra ofSalmonellafrom Bovine and Sheep

多重耐藥Multipledrugresistance耐藥譜Drug-resistantspectrum1麥迪霉素(4);氧氟沙星(4);氨芐西林(1)2麥迪霉素+頭孢噻吩(2);麥迪霉素+氨芐西林(2);麥迪霉素+卡那霉素(1);麥迪霉素+頭孢他啶(1);頭孢呋辛+頭孢噻吩(1)3麥迪霉素+卡那霉素+氨芐西林(1);麥迪霉素+氧氟沙星+頭孢噻吩(1);麥迪霉素+頭孢噻肟+頭孢噻吩(1);氧氟沙星+頭孢噻肟+哌拉西林(1);麥迪霉素+妥布霉素+頭孢噻吩(1);麥迪霉素+頭孢西叮+氨芐西林(1);氧氟沙星+氨曲南+頭孢哌酮(1)4鏈霉素+頭孢唑林+頭孢呋辛+氨芐西林(1);麥迪霉素+頭孢唑林+頭孢噻吩+頭孢呋辛(1);鏈霉素+頭孢哌酮+頭孢噻吩+頭孢呋辛(1);麥迪霉素+頭孢他啶+哌拉西林+氨芐西林(1);麥迪霉素+頭孢吡肟+頭孢呋辛+哌拉西林(1);麥迪霉素+鏈霉素+頭孢唑林+氨芐西林(1)506麥迪霉素+卡那霉素+頭孢唑林+頭孢噻吩+頭孢呋辛+氨芐西林(2);麥迪霉素+卡那霉素+妥布霉素+鏈霉素+哌拉西林+氨芐西林(1)7氧氟沙星+妥布霉素+頭孢噻肟+頭孢吡肟+頭孢西叮+頭孢噻吩+頭孢呋辛(1);麥迪霉素+氧氟沙星+頭孢噻肟+頭孢唑林+頭孢西叮+頭孢曲松+哌拉西林(1)8麥迪霉素+氧氟沙星+卡那霉素+妥布霉素+鏈霉素+頭孢唑林+頭孢噻吩+氨芐西林(1);麥迪霉素+卡那霉素+頭孢唑林+頭孢哌酮+頭孢噻吩+頭孢呋辛+哌拉西林+氨芐西林(1)9麥迪霉素+卡那霉素+妥布霉素+鏈霉素+頭孢唑林+頭孢他啶+頭孢噻吩+頭孢呋辛+氨芐西林(1);麥迪霉素+頭孢噻肟+頭孢吡肟+頭孢唑林+頭孢曲松+頭孢他啶+頭孢噻吩+頭孢呋辛+氨芐西林(1);妥布霉素+頭孢唑林+頭孢西叮+頭孢曲松+頭孢哌酮+頭孢噻吩+頭孢呋辛+哌拉西林+氨芐西林(1)10011012麥迪霉素+卡那霉素+妥布霉素+鏈霉素+頭孢唑林+頭孢西叮+頭孢曲松+頭孢哌酮+頭孢噻吩+頭孢呋辛+哌拉西林+氨芐西林(1)

研究表明,只有7株沙門氏菌不耐藥，菌株來源是屠宰場樣品，有9株沙門氏菌耐1種抗菌藥，單耐藥率為19.15%，菌株來源也是屠宰場樣品；有7株沙門氏菌耐2種抗菌藥，2重耐藥率為14.29%，菌株來源也是屠宰場樣品，以麥迪霉素+頭孢噻吩和麥迪霉素+氨芐西林為主；7株沙門氏菌耐3種抗菌藥，3重耐藥率為14.29%；6株沙門氏菌耐4種抗菌藥，4重耐藥率為12.24%；3株沙門氏菌耐6種抗菌藥，6重耐藥率為6.12%；2株沙門氏菌耐7種抗菌藥，7重耐藥率為4.08%；2株沙門氏菌耐8種抗菌藥，8重耐藥率為4.08%；3株沙門氏菌耐9種抗菌藥，9重耐藥率為6.12%；1株沙門氏菌耐12種抗菌藥，12重耐藥率為2.04%；耐藥譜如表2。市場中沙門氏菌的耐藥現(xiàn)象比屠宰場的耐藥嚴(yán)重。表2

3 討 論

從某定點(diǎn)屠宰場和農(nóng)貿(mào)市場中分離鑒定出47株沙門氏菌，分離率為5.59%，牛羊源沙門氏菌在胴體拭子、肉樣、加工用具拭子的分離率分別為4.82%、8.54%、4.52%。Khan等[7]報道家庭式家禽加工廠和超市采集的雞胴體樣品中沙門氏菌的流行率分別為20.5%和8.3%。Mcevoy等[8]報告在愛爾蘭的商業(yè)屠宰場從糞便、瘤胃和胴體樣品中沙門氏菌的分離率分別為2%、2%、7.6%。2005年美國在牛肉中沙門氏菌中鼠傷寒沙門氏菌排在首位，分離率為24.7%[9]。研究中檢測出8株甲型副傷寒沙門氏菌，分離率為17.02%(8/47)。

某定點(diǎn)屠宰場和農(nóng)貿(mào)市場中分離鑒定的47株沙門氏菌對17種抗菌藥物均存在不同程度的耐藥，耐藥率為2.13%～59.57%，對氨芐西林、頭孢呋辛、頭孢噻吩、頭孢唑啉、卡那霉素、氧氟沙星、麥迪霉素等具有較高的耐藥性。諶南輝等[10]人對分離得到的33株雞白痢沙門氏菌進(jìn)行了耐藥性的研究，得出這些菌株均對新生霉素、麥迪霉素、鏈霉素等具有耐藥性，其中部分對氨芐青霉素、卡那霉素、四環(huán)素具有耐藥性。譚炳乾[11]對16株豬傷寒沙門氏菌進(jìn)行包括四環(huán)素在內(nèi)的12中常見抗菌藥物的耐藥研究，發(fā)現(xiàn)其耐藥率達(dá)31.3%～93.8%。黎旭宇等[12]從獸醫(yī)臨床中分離得到沙門氏菌，并對其進(jìn)行耐藥性進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)對氨芐西林耐藥率達(dá)90%，而對土霉素的耐藥率達(dá)到100%。目前臨床上主要應(yīng)用青霉素類和頭孢菌素類抗生素治療沙門氏菌感染。試驗(yàn)菌株對氨芐青霉素和頭孢噻吩、頭孢唑啉表現(xiàn)出較高的耐藥率，而對頭孢他啶、頭孢曲松等其他幾種頭孢菌素類抗生素耐藥率相對較低。

4 結(jié) 論

從烏魯木齊市某定點(diǎn)屠宰場、庫爾勒市某定點(diǎn)屠宰場和農(nóng)貿(mào)市場采集的841份樣品中分離鑒定出47株沙門氏菌屬，分離率為5.59%。在屠宰場中沙門氏菌污染程度依次為胴體拭子<加工用具拭子<肉樣。而在農(nóng)貿(mào)市場中沙門氏菌污染程度依次為加工用具拭子<肉樣<胴體拭子。對17種抗菌藥物均存在不同程度的耐藥，耐藥率為2.13%～59.57%，多重耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重，其中有1株沙門氏菌耐12種抗菌藥。沙門氏菌在屠宰和市場環(huán)節(jié)均存在污染，且大多數(shù)都是耐藥菌株。