丁曉靜,劉文葉,王 萍
(1.北京市疾病預防控制中心 食物中毒診斷溯源技術(shù)北京市重點實驗室,北京 100013;2.北京市預防醫(yī)學研究中心,北京 100013;3.首都醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院,北京 100069)
羅丹明B是一種堿性熒光染料,經(jīng)常用作熒光標記物用于臨床和食品檢測[1-2],因其易于大量合成,具有成本低廉、色澤鮮艷且著色能力強、性質(zhì)穩(wěn)定不易脫色的特點,也曾經(jīng)用作食品添加劑,但后來實驗研究證明羅丹明B對人體有害[3],不允許在食品中添加。我國出入境檢驗檢疫行業(yè)標準中制定了進出口食品中羅丹明B的高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)檢測以及HPLC-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-tandem mass spectrometry,HPLC-MS/MS)檢測和確證方法[4],檢出限均為5 μg/kg。我國農(nóng)業(yè)標準中制定了飼料中羅丹明B的HPLC法,檢出限為1 μg/kg[5]。建立簡單、快速而高靈敏度的測定食品中羅丹明B的分析方法,對監(jiān)管食品安全具有重要意義。
目前羅丹明B的檢測方法有HPLC[6-10]、超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜(ultra-high performance liquid chromatography-high resolution mass spectrometry,UPLC-HRMS)法[11]、UPLC-MS/MS法[12-15]、毛細管電泳(capillary electrophoresis,CE)法[16-21]、CE-MS法[22]、分光光度法[23-24]和表面增強拉曼光譜(surface-enhanced Raman scattering,SERS)法[25-26]。HPLC及UPLC-MS/MS法因具有廣泛的適用性而成為痕量分析的主流檢測技術(shù),但其復雜耗時的前處理、大量的有機試劑消耗而導致其檢測成本高;分光光度法因無法避免樣品基質(zhì)的干擾而易導致定性及定量準確性欠佳;SERS法盡管快速且涵蓋的樣品種類多,但該法更適合于篩查或?qū)嶒炇翌A檢。
CE除分離效率高、檢測成本低之外,其樣品前處理過程也比HPLC更為簡單、有效和快捷,可滿足基體復雜的不同食品分析要求,已用于工業(yè)染料的檢測[17,20]。而用激光誘導熒光(l a s e r-i n d u c e d fluorescence,LIF)進行檢測,可獲得更高的檢測靈敏度[19],非常利于較少添加量即可達到著色效果的樣品檢測,然而番茄醬、番茄沙司和辣椒粉中羅丹明B的CE-LIF分析方法鮮見文獻報道。本研究建立羅丹明B的膠束電動毛細管色譜(micellar electrokinetic capillary chromatography,MEKC)-LIF分析方法,優(yōu)化與分離緩沖溶液相匹配的樣品前處理方法,成功實現(xiàn)了番茄醬、番茄沙司和辣椒粉樣品的分析。其中實驗室自制的3 個番茄醬和3 個番茄沙司的質(zhì)控參考樣的檢測結(jié)果與本實驗室建立的UPLC-FLR法[27]相比較,取得了較為理想的結(jié)果。
辣椒粉 市購;番茄醬和番茄沙司質(zhì)控陽性參考樣的制備:市購并經(jīng)本實驗室用UPLC-MS/MS檢測確認為空白樣品,將此空白樣品加標并充分混勻制得。
未涂層熔融石英毛細管(內(nèi)徑75 μm) 河北邯鄲永年光纖色譜有限責任公司。
十水合四硼酸鈉(Na2B4O7·10H2O,純度≥99.5%) 中國醫(yī)藥公司北京采購供應站;十二烷基硫酸鈉(sodium sodecyl sulfonate,SDS,純度≥99%)美國Sigma-Aldrich公司;脫氧膽酸鈉(sodium deoxycholate,SD,純度≥98%) 北京百靈威科技有限公司;聚乙二醇35000(polyethyleneglycol,PEG 35000) 美國Fluka公司;NaOH(優(yōu)級純) 北京化工廠;羅丹明B(純度≥99.0%) 德國Dr. Ehrenstorfer GmbH公司。
標準儲備液:準確稱取標準品羅丹明B 10.0 mg于預先裝有5 mL超純水的10 mL棕色容量瓶中,待溶解、稀釋后,再加入超純水定容至刻度,渦旋混勻后,得到質(zhì)量濃度為1.0 g/L的標準儲備液,于4 ℃冰箱避光保存。
Beckman PA 800 plus型CE儀(配LIF檢測器)美國Beckman公司;KQ-100E醫(yī)用超聲波清洗器 江蘇昆山市超聲儀器有限公司;Milli-Elix/RiOs超純水儀美國Millipore公司;F-50A酸度計 北京屹源電子儀器科技公司;Universal 32高速離心機 德國Hettich公司;Vortex-Genie 2渦旋混合器 美國Scientific Industries公司;分析用研磨機 德國IKA公司。
1.3.1 CE測定條件
未涂層熔融石英毛細管:75 μmh30 cm(有效長度20 cm),分離緩沖溶液:30 mmol/L Na2B4O7+20 mmol/L SDS+20 mmol/L SD+0.2 g/L PEG 35000;樣品提取液:10 mmol/L SDS。樣品室溫度15 ℃,操作溫度25 ℃,分離電壓8 kV,工作電流65 μA左右,進樣壓力3.448 kPa,進樣時間5 s;激發(fā)波長488 nm,發(fā)射波長520 nm。
1.3.2 毛細管的預處理
新裝毛細管在使用前分別用1 mol/L NaOH溶液沖洗20 min;超純水和分離緩沖液均沖洗5 min。每次進樣前依次用1 mol/L NaOH溶液、超純水和分離緩沖液均沖洗2 min,從而保證結(jié)果的可靠性。
1.3.3 樣品前處理
辣椒粉:稱取0.3 g,置于15 mL離心管中,加入樣品提取溶液10 mmol/L SDS至10 mL刻度,渦旋2 min后離心5 min,取出上清液,至另一50 mL離心管中,再根據(jù)上述過程重復提取一次,合并2 次提取液,加入樣品提取溶液至20 mL刻度,根據(jù)樣品中羅丹明B的響應值,用樣品提取液將其稀釋適當倍數(shù)直接進樣。
番茄醬和番茄沙司:稱取0.3 g,置于15 mL離心管中,加入樣品提取液10 mmol/L SDS至10 mL刻度,渦旋混勻后離心5 min,取上清液直接進樣即可。
使用SPSS 19.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計,CE圖均由32 Karat 8.0軟件直接輸出,表格用WPS 2019辦公軟件繪制而成。
2.1.1 分離緩沖體系的選擇
當pH值低于3時,羅丹明B完全以陽離子形式存在,而當pH≥8時,以中性分子形式存在[21,28-29]。有研究用硼砂緩沖體系作為分離緩沖溶液,可獲得很好的分離效果[19,27]。也有用磷酸鹽體系作為分離緩沖溶液的報道[18],但磷酸鹽因電導值較高,濃度過高會產(chǎn)生較多的焦耳熱,造成峰展寬,分離效率下降;濃度太低則使得待測物與樣品基質(zhì)不能很好分離。故本研究選用硼砂緩沖體系。
2.1.2 分離緩沖溶液中鹽濃度的優(yōu)化
通過增加分離緩沖溶液中的鹽濃度,以增加離子強度而減少羅丹明B在毛細管內(nèi)壁的吸附。保持分離緩沖溶液中20 mmol/L SD、20 mmol/L SDS和0.2 g/L PEG 35000不變,考察不同濃度(20、30、40 mmol/L)硼砂對羅丹明B標準溶液出峰的影響,結(jié)果見圖1。硼砂濃度對羅丹明B的檢測靈敏度沒有明顯影響,然而隨著硼砂濃度的增加,將引起峰的稍微展寬,導致遷移時間相應增加。為保證與樣品基質(zhì)能得到充分分離,選擇30 mmol/L硼砂為最佳。
圖1 分離緩沖溶液中硼砂濃度對羅丹明B峰形及遷移時間的影響Fig. 1 Effects of Na2B4O7 concentration on the migration time and peak shape of rhodamine B
2.1.3 分離緩沖溶液pH值的選擇
分離緩沖溶液的pH值不僅可以影響毛細管壁的質(zhì)子化程度以及羅丹明B的存在形式,也控制電滲流(electroosmosis flow,EOF)的大小,影響分析物的遷移時間和分離效率。分離緩沖溶液的pH值越接近硼酸的解離常數(shù)(pKa9.24),其緩沖能力也越大,可獲得良好的定性及定量重現(xiàn)性。無論用NaOH還是CsOH調(diào)節(jié)pH值,都將增加鹽濃度,導致分離時間延長,羅丹明B的峰形變差。而不加入任何調(diào)節(jié)劑時,30 mmol/L Na2B4O7的pH值為9.21,接近硼酸的解離常數(shù)(pKa9.24),能夠獲得較好的分離效率。故本研究選用30 mmol/L Na2B4O7即可,無需調(diào)節(jié)pH值。
2.1.4 分離緩沖溶液中SDS濃度的優(yōu)化
圖2 分離緩沖溶液中SDS濃度對羅丹明B分離及峰形的影響Fig. 2 Effects of SDS concentration on the migration time and peak shape of rhodamine B
當pH≥8時,羅丹明B以中性分子形式存在,故采用非常適合中性分子分析的MEKC分離模式,即向分離緩沖溶液中加入能夠形成膠束相濃度的SDS,在促進羅丹明B溶解的同時,還能增加分離。在堿性分離緩沖體系中SDS帶負電,分離時其運動方向與EOF方向相反,但由于在堿性條件下,EOF速率大于SDS的遷移速率,包裹中性分子羅丹明B的SDS可以被EOF推至檢測窗口而被檢測到。25 ℃的操作溫度下,能形成膠束的SDS濃度是8.1 mmol/L[30],所以考察了10、20 mmol/L和30 mmol/L SDS對分離的影響。保持分離緩沖溶液中30 mmol/L Na2B4O7、20 mmol/L SD以及0.2 g/L PEG 35000保持不變,當SDS為10 mmol/L時,羅丹明B與未知峰的分離效果不好,未達到基線分離;當SDS溶液濃度增至30 mmol/L時,羅丹明B峰變得畸形,而且靈敏度大大降低;而當SDS濃度為20 mmol/L時,羅丹明B靈敏度和分離度最好,且達基線分離。因此20 mmol/L SDS為最佳,結(jié)果如圖2所示。
2.1.5 分離緩沖溶液中SD濃度的優(yōu)化
SD是常用陰離子表面活性劑,含有疏水甲基和親水羧酸根,具有較強的增溶性和聚合性,使其分離能力優(yōu)于SDS[31]。保持30 mmol/L Na2B4O7、20 mmol/L SDS及0.2 g/L PEG 35000濃度不變,考察SD濃度分別為10、20 mmol/L和30 mmol/L時,對羅丹明B的分離及峰形的影響。隨著SD濃度的增加,羅丹明B的靈敏度下降;當SD為10 mmol/L時,羅丹明B的靈敏度最高、峰形也好,但用于實際樣品分析時,羅丹明B與樣品基質(zhì)無法實現(xiàn)完全分離;當SD濃度為20 mmol/L時,雖然羅丹明B的靈敏度較10 mmol/L時略有降低,但樣品分離達到最好,故選擇20 mmol/L SD,如圖3所示。
圖3 分離緩沖溶液中SD濃度對羅丹明B靈敏度的影響Fig. 3 Effects of SD concentrations on the detection sensitivity of rhodamine B
2.1.6 分離緩沖溶液中添加劑及濃度的選擇
PEG 35000在毛細管中起動態(tài)涂層的作用,可以減少管壁對待測物的吸附,改善峰拖尾。保持30 mmol/L Na2B4O7、20 mmol/L SDS以及20 mmol/L SD不變,未加入添加劑時,在10 min內(nèi)未檢測到羅丹明B的峰,加入0.2 g/L PEG 35000時,羅丹明B的靈敏度高、分離好,且用時短,如圖4所示,當加入0.4 g/L PEG 35000后,羅丹明B的峰形變差,靈敏度降低。因此選用0.2 g/L PEG 35000作為添加劑。
圖4 分離緩沖溶液中PEG 35000質(zhì)量濃度對羅丹明B檢測靈敏度的影響Fig. 4 Effects of PEG 35000 concentration on the detection sensitivity of rhodamine B
2.1.7 分離電壓的選擇
分離電壓的高低直接影響著待測物的遷移時間,電壓越高,遷移速率越快,檢測到待測物的時間越短,與此同時焦耳熱也增加,導致羅丹明B的峰區(qū)帶展寬,但是分離電壓過低導致遷移時間延長,經(jīng)優(yōu)化,本實驗采用8 kV電壓進行分離。
2.1.8 進樣時間的選擇
分別對比了2、5 s和8 s進樣時間對分離效果的影響,隨著進樣時間的延長,達到8 s時,雖然羅丹明B的峰高有明顯增加,但出現(xiàn)峰分叉現(xiàn)象,或是平頭峰;而當進樣時間為2 s時,峰高降低,不利于樣品中低含量羅丹明B的檢測;進樣時間為5 s時,靈敏度和峰形達到最優(yōu),最終選擇進樣時間為5 s。
2.1.9 樣品提取溶液的選擇
分別用超純水、稀釋10 倍后的分離緩沖液、10 mmol/L SDS提取樣品,當用純水和稀釋10 倍后的分離緩沖液作為樣品提取液時,羅丹明B的峰不僅靈敏度低,峰形還展寬變差,當用10 mmol/L SDS時,羅丹明B的峰變銳變高,有明顯的增敏作用。又考察5 mmol/L和15 mmol/L SDS對樣品的提取效果,發(fā)現(xiàn)兩者靈敏度和分離度都不如10 mmol/L SDS合適,故選擇10 mmol/L SDS作為樣品提取液。
將1 g/L羅丹明B儲備液用樣品稀釋液稀釋,配制成質(zhì)量濃度分別為0.02、0.04、0.08、0.16、0.32、0.64、1.28 mg/L的標準系列,在建立的最佳條件下,由低質(zhì)量濃度到高質(zhì)量濃度依次進樣檢測,用校正峰面積(峰面積除以遷移時間)外標法定量,以CE峰的校正峰面積(A)為縱坐標,與其對應的質(zhì)量濃度ρ(mg/L)為橫坐標,繪制標準曲線。其線性回歸方程為A=2 489.41ρ+11.72,線性范圍為0.02~1.28 mg/L,相關(guān)系數(shù)為0.999 9,檢出限及定量限分別為5 μg/L和15 μg/L。
分別在0.04、0.16 mg/L及0.64 mg/L三個不同質(zhì)量濃度水平測定儀器精密度。遷移時間的精密度分別為0.25%、0.28%和0.10%(n=7);相應校正峰面積的相對標準偏差(relative standard deviation,RSD)分別為3.6%、1.5%和3.0%。
根據(jù)1.3.3節(jié)樣品前處理方法處理番茄沙司和辣椒粉樣品,分別平行處理7 份,在最佳MEKC條件下進行測定,計算樣品含量的RSD,得到方法日內(nèi)精密度分別為2.0%和1.4%。將番茄沙司和辣椒粉樣品平行處理3 份并測得平均值,連續(xù)7 d,計算7 d樣品平均值的RSD,得到方法日間精密度分別為1.6%和1.8%。
加標回收實驗的本底選擇某品牌番茄醬樣品,選取標曲范圍內(nèi)的0.04、0.16 mg/L和0.64 mg/L三個質(zhì)量濃度水平進行加標。平行處理每個質(zhì)量濃度的樣品5 份,加入標準溶液后室溫放置過夜,使加標溶液與樣品基質(zhì)充分混合,第2天再行提取。樣品中質(zhì)量濃度加標CE結(jié)果如圖5所示,加標回收率分別為100.9%、101.9%和105.8%,相應RSD分別為2.0%、1.4%和3.2%。
圖5 樣品加標回收CE圖Fig. 5 Capillary electrophoregrams for spiked recovery at moderate mass concentration
表1 番茄醬和番茄沙司實際樣品分析結(jié)果(n=5)Table 1 Results of determination of rhodamine B in tomato sauce,ketchup and chili powder samples (n= 5)
按照1.3.3節(jié)的前處理方法,對3 個番茄醬、3 個番茄沙司和22 個辣椒粉共計28 個樣品進行前處理,每個樣品平行處理5 份進行測定,分別計算其RSD。1#~6#樣品還均用UPLC-FLR的方法[27]進行了測定,測定結(jié)果見表1,經(jīng)統(tǒng)計學檢驗t為0.016,小于0.05,表明兩種方法的測定結(jié)果有顯著性差異,可能的原因是:兩種方法的檢測時間相差半年,再加之樣品在室溫放置,故導致羅丹明B的含量有所下降,提示在今后羅丹明B的標準物質(zhì)研制中,不宜將樣品放置在室溫,而應放置在4 ℃或-20 ℃保存。其中樣品1#~3#均為番茄醬、樣品4#~6#均為番茄沙司。22 個辣椒粉樣品中僅有2 個未檢出羅丹明B,其余20 個均檢出,含量范圍為13.1~798.6 mg/kg。番茄醬、番茄沙司和辣椒粉的CE圖分別見圖6。
圖6 1#番茄醬(A)、4#番茄沙司(B)、8#辣椒粉(C)CE圖Fig. 6 Capillary electrophoregrams of tomato sauce 1# (A), tomato sauce 4# (B), and paprika 8# (C)
采用MEKC法,結(jié)合LIF檢測器,顯著提高檢測靈敏度;選用硼砂鹽分離緩沖體系及無需有機溶劑的簡單的樣品前處理,既可以提高靈敏度,又可減少前處理時間,還降低了檢測成本。檢出限為5 μg/L,能夠滿足低含量樣品的檢測。28 個樣品中,除1#~6#樣品均為本實驗室制備的質(zhì)控陽性參考樣外,22 個辣椒粉樣品中有20 個樣品中均檢出了羅丹明B,說明辣椒粉中非法添加的現(xiàn)象依然存在。盡管工業(yè)染料性質(zhì)穩(wěn)定,但羅丹明B的食品基體標準物質(zhì)研制中,不宜將樣品放置在室溫,而應放置在4 ℃或-20 ℃保存。