丁曉靜，劉文葉，王 萍

（1.北京市疾病預(yù)防控制中心 食物中毒診斷溯源技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100013；2.北京市預(yù)防醫(yī)學(xué)研究中心，北京 100013；3.首都醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，北京 100069）

羅丹明B是一種堿性熒光染料，經(jīng)常用作熒光標(biāo)記物用于臨床和食品檢測(cè)[1-2]，因其易于大量合成，具有成本低廉、色澤鮮艷且著色能力強(qiáng)、性質(zhì)穩(wěn)定不易脫色的特點(diǎn)，也曾經(jīng)用作食品添加劑，但后來(lái)實(shí)驗(yàn)研究證明羅丹明B對(duì)人體有害[3]，不允許在食品中添加。我國(guó)出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中制定了進(jìn)出口食品中羅丹明B的高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）檢測(cè)以及HPLC-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）檢測(cè)和確證方法[4]，檢出限均為5 μg/kg。我國(guó)農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中制定了飼料中羅丹明B的HPLC法，檢出限為1 μg/kg[5]。建立簡(jiǎn)單、快速而高靈敏度的測(cè)定食品中羅丹明B的分析方法，對(duì)監(jiān)管食品安全具有重要意義。

目前羅丹明B的檢測(cè)方法有HPLC[6-10]、超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜（ultra-high performance liquid chromatography-high resolution mass spectrometry，UPLC-HRMS）法[11]、UPLC-MS/MS法[12-15]、毛細(xì)管電泳（capillary electrophoresis，CE）法[16-21]、CE-MS法[22]、分光光度法[23-24]和表面增強(qiáng)拉曼光譜（surface-enhanced Raman scattering，SERS）法[25-26]。HPLC及UPLC-MS/MS法因具有廣泛的適用性而成為痕量分析的主流檢測(cè)技術(shù)，但其復(fù)雜耗時(shí)的前處理、大量的有機(jī)試劑消耗而導(dǎo)致其檢測(cè)成本高；分光光度法因無(wú)法避免樣品基質(zhì)的干擾而易導(dǎo)致定性及定量準(zhǔn)確性欠佳；SERS法盡管快速且涵蓋的樣品種類多，但該法更適合于篩查或?qū)嶒?yàn)室預(yù)檢。

CE除分離效率高、檢測(cè)成本低之外，其樣品前處理過(guò)程也比HPLC更為簡(jiǎn)單、有效和快捷，可滿足基體復(fù)雜的不同食品分析要求，已用于工業(yè)染料的檢測(cè)[17,20]。而用激光誘導(dǎo)熒光（l a s e r-i n d u c e d fluorescence，LIF）進(jìn)行檢測(cè)，可獲得更高的檢測(cè)靈敏度[19]，非常利于較少添加量即可達(dá)到著色效果的樣品檢測(cè)，然而番茄醬、番茄沙司和辣椒粉中羅丹明B的CE-LIF分析方法鮮見文獻(xiàn)報(bào)道。本研究建立羅丹明B的膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜（micellar electrokinetic capillary chromatography，MEKC）-LIF分析方法，優(yōu)化與分離緩沖溶液相匹配的樣品前處理方法，成功實(shí)現(xiàn)了番茄醬、番茄沙司和辣椒粉樣品的分析。其中實(shí)驗(yàn)室自制的3 個(gè)番茄醬和3 個(gè)番茄沙司的質(zhì)控參考樣的檢測(cè)結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)室建立的UPLC-FLR法[27]相比較，取得了較為理想的結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

辣椒粉 市購(gòu)；番茄醬和番茄沙司質(zhì)控陽(yáng)性參考樣的制備：市購(gòu)并經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室用UPLC-MS/MS檢測(cè)確認(rèn)為空白樣品，將此空白樣品加標(biāo)并充分混勻制得。

未涂層熔融石英毛細(xì)管（內(nèi)徑75 μm） 河北邯鄲永年光纖色譜有限責(zé)任公司。

十水合四硼酸鈉（Na2B4O7·10H2O，純度≥99.5%） 中國(guó)醫(yī)藥公司北京采購(gòu)供應(yīng)站；十二烷基硫酸鈉（sodium sodecyl sulfonate，SDS，純度≥99%）美國(guó)Sigma-Aldrich公司；脫氧膽酸鈉（sodium deoxycholate，SD，純度≥98%） 北京百靈威科技有限公司；聚乙二醇35000（polyethyleneglycol，PEG 35000） 美國(guó)Fluka公司；NaOH（優(yōu)級(jí)純） 北京化工廠；羅丹明B（純度≥99.0%） 德國(guó)Dr. Ehrenstorfer GmbH公司。

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)品羅丹明B 10.0 mg于預(yù)先裝有5 mL超純水的10 mL棕色容量瓶中，待溶解、稀釋后，再加入超純水定容至刻度，渦旋混勻后，得到質(zhì)量濃度為1.0 g/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于4 ℃冰箱避光保存。

1.2 儀器與設(shè)備

Beckman PA 800 plus型CE儀（配LIF檢測(cè)器）美國(guó)Beckman公司；KQ-100E醫(yī)用超聲波清洗器 江蘇昆山市超聲儀器有限公司；Milli-Elix/RiOs超純水儀美國(guó)Millipore公司；F-50A酸度計(jì) 北京屹源電子儀器科技公司；Universal 32高速離心機(jī) 德國(guó)Hettich公司；Vortex-Genie 2渦旋混合器 美國(guó)Scientific Industries公司；分析用研磨機(jī) 德國(guó)IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 CE測(cè)定條件

未涂層熔融石英毛細(xì)管：75 μmh30 cm（有效長(zhǎng)度20 cm），分離緩沖溶液：30 mmol/L Na2B4O7+20 mmol/L SDS+20 mmol/L SD+0.2 g/L PEG 35000；樣品提取液：10 mmol/L SDS。樣品室溫度15 ℃，操作溫度25 ℃，分離電壓8 kV，工作電流65 μA左右，進(jìn)樣壓力3.448 kPa，進(jìn)樣時(shí)間5 s；激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)520 nm。

1.3.2 毛細(xì)管的預(yù)處理

新裝毛細(xì)管在使用前分別用1 mol/L NaOH溶液沖洗20 min；超純水和分離緩沖液均沖洗5 min。每次進(jìn)樣前依次用1 mol/L NaOH溶液、超純水和分離緩沖液均沖洗2 min，從而保證結(jié)果的可靠性。

1.3.3 樣品前處理

辣椒粉：稱取0.3 g，置于15 mL離心管中，加入樣品提取溶液10 mmol/L SDS至10 mL刻度，渦旋2 min后離心5 min，取出上清液，至另一50 mL離心管中，再根據(jù)上述過(guò)程重復(fù)提取一次，合并2 次提取液，加入樣品提取溶液至20 mL刻度，根據(jù)樣品中羅丹明B的響應(yīng)值，用樣品提取液將其稀釋適當(dāng)倍數(shù)直接進(jìn)樣。

番茄醬和番茄沙司：稱取0.3 g，置于15 mL離心管中，加入樣品提取液10 mmol/L SDS至10 mL刻度，渦旋混勻后離心5 min，取上清液直接進(jìn)樣即可。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，CE圖均由32 Karat 8.0軟件直接輸出，表格用WPS 2019辦公軟件繪制而成。

2 結(jié)果與分析

2.1 實(shí)驗(yàn)條件的選擇

2.1.1 分離緩沖體系的選擇

當(dāng)pH值低于3時(shí)，羅丹明B完全以陽(yáng)離子形式存在，而當(dāng)pH≥8時(shí)，以中性分子形式存在[21,28-29]。有研究用硼砂緩沖體系作為分離緩沖溶液，可獲得很好的分離效果[19,27]。也有用磷酸鹽體系作為分離緩沖溶液的報(bào)道[18]，但磷酸鹽因電導(dǎo)值較高，濃度過(guò)高會(huì)產(chǎn)生較多的焦耳熱，造成峰展寬，分離效率下降；濃度太低則使得待測(cè)物與樣品基質(zhì)不能很好分離。故本研究選用硼砂緩沖體系。

2.1.2 分離緩沖溶液中鹽濃度的優(yōu)化

通過(guò)增加分離緩沖溶液中的鹽濃度，以增加離子強(qiáng)度而減少羅丹明B在毛細(xì)管內(nèi)壁的吸附。保持分離緩沖溶液中20 mmol/L SD、20 mmol/L SDS和0.2 g/L PEG 35000不變，考察不同濃度（20、30、40 mmol/L）硼砂對(duì)羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)溶液出峰的影響，結(jié)果見圖1。硼砂濃度對(duì)羅丹明B的檢測(cè)靈敏度沒有明顯影響，然而隨著硼砂濃度的增加，將引起峰的稍微展寬，導(dǎo)致遷移時(shí)間相應(yīng)增加。為保證與樣品基質(zhì)能得到充分分離，選擇30 mmol/L硼砂為最佳。

圖1 分離緩沖溶液中硼砂濃度對(duì)羅丹明B峰形及遷移時(shí)間的影響Fig. 1 Effects of Na2B4O7 concentration on the migration time and peak shape of rhodamine B

2.1.3 分離緩沖溶液pH值的選擇

分離緩沖溶液的pH值不僅可以影響毛細(xì)管壁的質(zhì)子化程度以及羅丹明B的存在形式，也控制電滲流（electroosmosis flow，EOF）的大小，影響分析物的遷移時(shí)間和分離效率。分離緩沖溶液的pH值越接近硼酸的解離常數(shù)（pKa9.24），其緩沖能力也越大，可獲得良好的定性及定量重現(xiàn)性。無(wú)論用NaOH還是CsOH調(diào)節(jié)pH值，都將增加鹽濃度，導(dǎo)致分離時(shí)間延長(zhǎng)，羅丹明B的峰形變差。而不加入任何調(diào)節(jié)劑時(shí)，30 mmol/L Na2B4O7的pH值為9.21，接近硼酸的解離常數(shù)（pKa9.24），能夠獲得較好的分離效率。故本研究選用30 mmol/L Na2B4O7即可，無(wú)需調(diào)節(jié)pH值。

2.1.4 分離緩沖溶液中SDS濃度的優(yōu)化

圖2 分離緩沖溶液中SDS濃度對(duì)羅丹明B分離及峰形的影響Fig. 2 Effects of SDS concentration on the migration time and peak shape of rhodamine B

當(dāng)pH≥8時(shí)，羅丹明B以中性分子形式存在，故采用非常適合中性分子分析的MEKC分離模式，即向分離緩沖溶液中加入能夠形成膠束相濃度的SDS，在促進(jìn)羅丹明B溶解的同時(shí)，還能增加分離。在堿性分離緩沖體系中SDS帶負(fù)電，分離時(shí)其運(yùn)動(dòng)方向與EOF方向相反，但由于在堿性條件下，EOF速率大于SDS的遷移速率，包裹中性分子羅丹明B的SDS可以被EOF推至檢測(cè)窗口而被檢測(cè)到。25 ℃的操作溫度下，能形成膠束的SDS濃度是8.1 mmol/L[30]，所以考察了10、20 mmol/L和30 mmol/L SDS對(duì)分離的影響。保持分離緩沖溶液中30 mmol/L Na2B4O7、20 mmol/L SD以及0.2 g/L PEG 35000保持不變，當(dāng)SDS為10 mmol/L時(shí)，羅丹明B與未知峰的分離效果不好，未達(dá)到基線分離；當(dāng)SDS溶液濃度增至30 mmol/L時(shí)，羅丹明B峰變得畸形，而且靈敏度大大降低；而當(dāng)SDS濃度為20 mmol/L時(shí)，羅丹明B靈敏度和分離度最好，且達(dá)基線分離。因此20 mmol/L SDS為最佳，結(jié)果如圖2所示。

2.1.5 分離緩沖溶液中SD濃度的優(yōu)化

SD是常用陰離子表面活性劑，含有疏水甲基和親水羧酸根，具有較強(qiáng)的增溶性和聚合性，使其分離能力優(yōu)于SDS[31]。保持30 mmol/L Na2B4O7、20 mmol/L SDS及0.2 g/L PEG 35000濃度不變，考察SD濃度分別為10、20 mmol/L和30 mmol/L時(shí)，對(duì)羅丹明B的分離及峰形的影響。隨著SD濃度的增加，羅丹明B的靈敏度下降；當(dāng)SD為10 mmol/L時(shí)，羅丹明B的靈敏度最高、峰形也好，但用于實(shí)際樣品分析時(shí)，羅丹明B與樣品基質(zhì)無(wú)法實(shí)現(xiàn)完全分離；當(dāng)SD濃度為20 mmol/L時(shí)，雖然羅丹明B的靈敏度較10 mmol/L時(shí)略有降低，但樣品分離達(dá)到最好，故選擇20 mmol/L SD，如圖3所示。

圖3 分離緩沖溶液中SD濃度對(duì)羅丹明B靈敏度的影響Fig. 3 Effects of SD concentrations on the detection sensitivity of rhodamine B

2.1.6 分離緩沖溶液中添加劑及濃度的選擇

PEG 35000在毛細(xì)管中起動(dòng)態(tài)涂層的作用，可以減少管壁對(duì)待測(cè)物的吸附，改善峰拖尾。保持30 mmol/L Na2B4O7、20 mmol/L SDS以及20 mmol/L SD不變，未加入添加劑時(shí)，在10 min內(nèi)未檢測(cè)到羅丹明B的峰，加入0.2 g/L PEG 35000時(shí)，羅丹明B的靈敏度高、分離好，且用時(shí)短，如圖4所示，當(dāng)加入0.4 g/L PEG 35000后，羅丹明B的峰形變差，靈敏度降低。因此選用0.2 g/L PEG 35000作為添加劑。

圖4 分離緩沖溶液中PEG 35000質(zhì)量濃度對(duì)羅丹明B檢測(cè)靈敏度的影響Fig. 4 Effects of PEG 35000 concentration on the detection sensitivity of rhodamine B

2.1.7 分離電壓的選擇

分離電壓的高低直接影響著待測(cè)物的遷移時(shí)間，電壓越高，遷移速率越快，檢測(cè)到待測(cè)物的時(shí)間越短，與此同時(shí)焦耳熱也增加，導(dǎo)致羅丹明B的峰區(qū)帶展寬，但是分離電壓過(guò)低導(dǎo)致遷移時(shí)間延長(zhǎng)，經(jīng)優(yōu)化，本實(shí)驗(yàn)采用8 kV電壓進(jìn)行分離。

2.1.8 進(jìn)樣時(shí)間的選擇

分別對(duì)比了2、5 s和8 s進(jìn)樣時(shí)間對(duì)分離效果的影響，隨著進(jìn)樣時(shí)間的延長(zhǎng)，達(dá)到8 s時(shí)，雖然羅丹明B的峰高有明顯增加，但出現(xiàn)峰分叉現(xiàn)象，或是平頭峰；而當(dāng)進(jìn)樣時(shí)間為2 s時(shí)，峰高降低，不利于樣品中低含量羅丹明B的檢測(cè)；進(jìn)樣時(shí)間為5 s時(shí)，靈敏度和峰形達(dá)到最優(yōu)，最終選擇進(jìn)樣時(shí)間為5 s。

2.1.9 樣品提取溶液的選擇

分別用超純水、稀釋10 倍后的分離緩沖液、10 mmol/L SDS提取樣品，當(dāng)用純水和稀釋10 倍后的分離緩沖液作為樣品提取液時(shí)，羅丹明B的峰不僅靈敏度低，峰形還展寬變差，當(dāng)用10 mmol/L SDS時(shí)，羅丹明B的峰變銳變高，有明顯的增敏作用。又考察5 mmol/L和15 mmol/L SDS對(duì)樣品的提取效果，發(fā)現(xiàn)兩者靈敏度和分離度都不如10 mmol/L SDS合適，故選擇10 mmol/L SDS作為樣品提取液。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限

將1 g/L羅丹明B儲(chǔ)備液用樣品稀釋液稀釋，配制成質(zhì)量濃度分別為0.02、0.04、0.08、0.16、0.32、0.64、1.28 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)系列，在建立的最佳條件下，由低質(zhì)量濃度到高質(zhì)量濃度依次進(jìn)樣檢測(cè)，用校正峰面積（峰面積除以遷移時(shí)間）外標(biāo)法定量，以CE峰的校正峰面積（A）為縱坐標(biāo)，與其對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度ρ（mg/L）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。其線性回歸方程為A=2 489.41ρ+11.72，線性范圍為0.02～1.28 mg/L，相關(guān)系數(shù)為0.999 9，檢出限及定量限分別為5 μg/L和15 μg/L。

2.3 儀器精密度

分別在0.04、0.16 mg/L及0.64 mg/L三個(gè)不同質(zhì)量濃度水平測(cè)定儀器精密度。遷移時(shí)間的精密度分別為0.25%、0.28%和0.10%（n=7）；相應(yīng)校正峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）分別為3.6%、1.5%和3.0%。

2.4 方法精密度

根據(jù)1.3.3節(jié)樣品前處理方法處理番茄沙司和辣椒粉樣品，分別平行處理7 份，在最佳MEKC條件下進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算樣品含量的RSD，得到方法日內(nèi)精密度分別為2.0%和1.4%。將番茄沙司和辣椒粉樣品平行處理3 份并測(cè)得平均值，連續(xù)7 d，計(jì)算7 d樣品平均值的RSD，得到方法日間精密度分別為1.6%和1.8%。

2.5 加標(biāo)回收率

加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)的本底選擇某品牌番茄醬樣品，選取標(biāo)曲范圍內(nèi)的0.04、0.16 mg/L和0.64 mg/L三個(gè)質(zhì)量濃度水平進(jìn)行加標(biāo)。平行處理每個(gè)質(zhì)量濃度的樣品5 份，加入標(biāo)準(zhǔn)溶液后室溫放置過(guò)夜，使加標(biāo)溶液與樣品基質(zhì)充分混合，第2天再行提取。樣品中質(zhì)量濃度加標(biāo)CE結(jié)果如圖5所示，加標(biāo)回收率分別為100.9%、101.9%和105.8%，相應(yīng)RSD分別為2.0%、1.4%和3.2%。

圖5 樣品加標(biāo)回收CE圖Fig. 5 Capillary electrophoregrams for spiked recovery at moderate mass concentration

2.6 樣品分析結(jié)果

表1 番茄醬和番茄沙司實(shí)際樣品分析結(jié)果（n=5）Table 1 Results of determination of rhodamine B in tomato sauce,ketchup and chili powder samples (n= 5)

按照1.3.3節(jié)的前處理方法，對(duì)3 個(gè)番茄醬、3 個(gè)番茄沙司和22 個(gè)辣椒粉共計(jì)28 個(gè)樣品進(jìn)行前處理，每個(gè)樣品平行處理5 份進(jìn)行測(cè)定，分別計(jì)算其RSD。1#～6#樣品還均用UPLC-FLR的方法[27]進(jìn)行了測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見表1，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)t為0.016，小于0.05，表明兩種方法的測(cè)定結(jié)果有顯著性差異，可能的原因是：兩種方法的檢測(cè)時(shí)間相差半年，再加之樣品在室溫放置，故導(dǎo)致羅丹明B的含量有所下降，提示在今后羅丹明B的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制中，不宜將樣品放置在室溫，而應(yīng)放置在4 ℃或-20 ℃保存。其中樣品1#～3#均為番茄醬、樣品4#～6#均為番茄沙司。22 個(gè)辣椒粉樣品中僅有2 個(gè)未檢出羅丹明B，其余20 個(gè)均檢出，含量范圍為13.1～798.6 mg/kg。番茄醬、番茄沙司和辣椒粉的CE圖分別見圖6。

圖6 1#番茄醬（A）、4#番茄沙司（B）、8#辣椒粉（C）CE圖Fig. 6 Capillary electrophoregrams of tomato sauce 1# (A), tomato sauce 4# (B), and paprika 8# (C)

3 結(jié) 論

采用MEKC法，結(jié)合LIF檢測(cè)器，顯著提高檢測(cè)靈敏度；選用硼砂鹽分離緩沖體系及無(wú)需有機(jī)溶劑的簡(jiǎn)單的樣品前處理，既可以提高靈敏度，又可減少前處理時(shí)間，還降低了檢測(cè)成本。檢出限為5 μg/L，能夠滿足低含量樣品的檢測(cè)。28 個(gè)樣品中，除1#～6#樣品均為本實(shí)驗(yàn)室制備的質(zhì)控陽(yáng)性參考樣外，22 個(gè)辣椒粉樣品中有20 個(gè)樣品中均檢出了羅丹明B，說(shuō)明辣椒粉中非法添加的現(xiàn)象依然存在。盡管工業(yè)染料性質(zhì)穩(wěn)定，但羅丹明B的食品基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制中，不宜將樣品放置在室溫，而應(yīng)放置在4 ℃或-20 ℃保存。