丁曉靜，劉文葉，王 萍

（1.北京市疾病預防控制中心 食物中毒診斷溯源技術(shù)北京市重點實驗室，北京 100013；2.北京市預防醫(yī)學研究中心，北京 100013；3.首都醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院，北京 100069）

羅丹明B是一種堿性熒光染料，經(jīng)常用作熒光標記物用于臨床和食品檢測[1-2]，因其易于大量合成，具有成本低廉、色澤鮮艷且著色能力強、性質(zhì)穩(wěn)定不易脫色的特點，也曾經(jīng)用作食品添加劑，但后來實驗研究證明羅丹明B對人體有害[3]，不允許在食品中添加。我國出入境檢驗檢疫行業(yè)標準中制定了進出口食品中羅丹明B的高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）檢測以及HPLC-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）檢測和確證方法[4]，檢出限均為5 μg/kg。我國農(nóng)業(yè)標準中制定了飼料中羅丹明B的HPLC法，檢出限為1 μg/kg[5]。建立簡單、快速而高靈敏度的測定食品中羅丹明B的分析方法，對監(jiān)管食品安全具有重要意義。

目前羅丹明B的檢測方法有HPLC[6-10]、超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜（ultra-high performance liquid chromatography-high resolution mass spectrometry，UPLC-HRMS）法[11]、UPLC-MS/MS法[12-15]、毛細管電泳（capillary electrophoresis，CE）法[16-21]、CE-MS法[22]、分光光度法[23-24]和表面增強拉曼光譜（surface-enhanced Raman scattering，SERS）法[25-26]。HPLC及UPLC-MS/MS法因具有廣泛的適用性而成為痕量分析的主流檢測技術(shù)，但其復雜耗時的前處理、大量的有機試劑消耗而導致其檢測成本高；分光光度法因無法避免樣品基質(zhì)的干擾而易導致定性及定量準確性欠佳；SERS法盡管快速且涵蓋的樣品種類多，但該法更適合于篩查或?qū)嶒炇翌A檢。

CE除分離效率高、檢測成本低之外，其樣品前處理過程也比HPLC更為簡單、有效和快捷，可滿足基體復雜的不同食品分析要求，已用于工業(yè)染料的檢測[17,20]。而用激光誘導熒光（l a s e r-i n d u c e d fluorescence，LIF）進行檢測，可獲得更高的檢測靈敏度[19]，非常利于較少添加量即可達到著色效果的樣品檢測，然而番茄醬、番茄沙司和辣椒粉中羅丹明B的CE-LIF分析方法鮮見文獻報道。本研究建立羅丹明B的膠束電動毛細管色譜（micellar electrokinetic capillary chromatography，MEKC）-LIF分析方法，優(yōu)化與分離緩沖溶液相匹配的樣品前處理方法，成功實現(xiàn)了番茄醬、番茄沙司和辣椒粉樣品的分析。其中實驗室自制的3 個番茄醬和3 個番茄沙司的質(zhì)控參考樣的檢測結(jié)果與本實驗室建立的UPLC-FLR法[27]相比較，取得了較為理想的結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

辣椒粉 市購；番茄醬和番茄沙司質(zhì)控陽性參考樣的制備：市購并經(jīng)本實驗室用UPLC-MS/MS檢測確認為空白樣品，將此空白樣品加標并充分混勻制得。

未涂層熔融石英毛細管（內(nèi)徑75 μm） 河北邯鄲永年光纖色譜有限責任公司。

十水合四硼酸鈉（Na2B4O7·10H2O，純度≥99.5%） 中國醫(yī)藥公司北京采購供應站；十二烷基硫酸鈉（sodium sodecyl sulfonate，SDS，純度≥99%）美國Sigma-Aldrich公司；脫氧膽酸鈉（sodium deoxycholate，SD，純度≥98%） 北京百靈威科技有限公司；聚乙二醇35000（polyethyleneglycol，PEG 35000） 美國Fluka公司；NaOH（優(yōu)級純） 北京化工廠；羅丹明B（純度≥99.0%） 德國Dr. Ehrenstorfer GmbH公司。

標準儲備液：準確稱取標準品羅丹明B 10.0 mg于預先裝有5 mL超純水的10 mL棕色容量瓶中，待溶解、稀釋后，再加入超純水定容至刻度，渦旋混勻后，得到質(zhì)量濃度為1.0 g/L的標準儲備液，于4 ℃冰箱避光保存。

1.2 儀器與設備

Beckman PA 800 plus型CE儀（配LIF檢測器）美國Beckman公司；KQ-100E醫(yī)用超聲波清洗器 江蘇昆山市超聲儀器有限公司；Milli-Elix/RiOs超純水儀美國Millipore公司；F-50A酸度計 北京屹源電子儀器科技公司；Universal 32高速離心機 德國Hettich公司；Vortex-Genie 2渦旋混合器 美國Scientific Industries公司；分析用研磨機 德國IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 CE測定條件

未涂層熔融石英毛細管：75 μmh30 cm（有效長度20 cm），分離緩沖溶液：30 mmol/L Na2B4O7+20 mmol/L SDS+20 mmol/L SD+0.2 g/L PEG 35000；樣品提取液：10 mmol/L SDS。樣品室溫度15 ℃，操作溫度25 ℃，分離電壓8 kV，工作電流65 μA左右，進樣壓力3.448 kPa，進樣時間5 s；激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長520 nm。

1.3.2 毛細管的預處理

新裝毛細管在使用前分別用1 mol/L NaOH溶液沖洗20 min；超純水和分離緩沖液均沖洗5 min。每次進樣前依次用1 mol/L NaOH溶液、超純水和分離緩沖液均沖洗2 min，從而保證結(jié)果的可靠性。

1.3.3 樣品前處理

辣椒粉：稱取0.3 g，置于15 mL離心管中，加入樣品提取溶液10 mmol/L SDS至10 mL刻度，渦旋2 min后離心5 min，取出上清液，至另一50 mL離心管中，再根據(jù)上述過程重復提取一次，合并2 次提取液，加入樣品提取溶液至20 mL刻度，根據(jù)樣品中羅丹明B的響應值，用樣品提取液將其稀釋適當倍數(shù)直接進樣。

番茄醬和番茄沙司：稱取0.3 g，置于15 mL離心管中，加入樣品提取液10 mmol/L SDS至10 mL刻度，渦旋混勻后離心5 min，取上清液直接進樣即可。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

使用SPSS 19.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，CE圖均由32 Karat 8.0軟件直接輸出，表格用WPS 2019辦公軟件繪制而成。

2 結(jié)果與分析

2.1 實驗條件的選擇

2.1.1 分離緩沖體系的選擇

當pH值低于3時，羅丹明B完全以陽離子形式存在，而當pH≥8時，以中性分子形式存在[21,28-29]。有研究用硼砂緩沖體系作為分離緩沖溶液，可獲得很好的分離效果[19,27]。也有用磷酸鹽體系作為分離緩沖溶液的報道[18]，但磷酸鹽因電導值較高，濃度過高會產(chǎn)生較多的焦耳熱，造成峰展寬，分離效率下降；濃度太低則使得待測物與樣品基質(zhì)不能很好分離。故本研究選用硼砂緩沖體系。

2.1.2 分離緩沖溶液中鹽濃度的優(yōu)化

通過增加分離緩沖溶液中的鹽濃度，以增加離子強度而減少羅丹明B在毛細管內(nèi)壁的吸附。保持分離緩沖溶液中20 mmol/L SD、20 mmol/L SDS和0.2 g/L PEG 35000不變，考察不同濃度（20、30、40 mmol/L）硼砂對羅丹明B標準溶液出峰的影響，結(jié)果見圖1。硼砂濃度對羅丹明B的檢測靈敏度沒有明顯影響，然而隨著硼砂濃度的增加，將引起峰的稍微展寬，導致遷移時間相應增加。為保證與樣品基質(zhì)能得到充分分離，選擇30 mmol/L硼砂為最佳。

圖1 分離緩沖溶液中硼砂濃度對羅丹明B峰形及遷移時間的影響Fig. 1 Effects of Na2B4O7 concentration on the migration time and peak shape of rhodamine B

2.1.3 分離緩沖溶液pH值的選擇

分離緩沖溶液的pH值不僅可以影響毛細管壁的質(zhì)子化程度以及羅丹明B的存在形式，也控制電滲流（electroosmosis flow，EOF）的大小，影響分析物的遷移時間和分離效率。分離緩沖溶液的pH值越接近硼酸的解離常數(shù)（pKa9.24），其緩沖能力也越大，可獲得良好的定性及定量重現(xiàn)性。無論用NaOH還是CsOH調(diào)節(jié)pH值，都將增加鹽濃度，導致分離時間延長，羅丹明B的峰形變差。而不加入任何調(diào)節(jié)劑時，30 mmol/L Na2B4O7的pH值為9.21，接近硼酸的解離常數(shù)（pKa9.24），能夠獲得較好的分離效率。故本研究選用30 mmol/L Na2B4O7即可，無需調(diào)節(jié)pH值。

2.1.4 分離緩沖溶液中SDS濃度的優(yōu)化

圖2 分離緩沖溶液中SDS濃度對羅丹明B分離及峰形的影響Fig. 2 Effects of SDS concentration on the migration time and peak shape of rhodamine B

當pH≥8時，羅丹明B以中性分子形式存在，故采用非常適合中性分子分析的MEKC分離模式，即向分離緩沖溶液中加入能夠形成膠束相濃度的SDS，在促進羅丹明B溶解的同時，還能增加分離。在堿性分離緩沖體系中SDS帶負電，分離時其運動方向與EOF方向相反，但由于在堿性條件下，EOF速率大于SDS的遷移速率，包裹中性分子羅丹明B的SDS可以被EOF推至檢測窗口而被檢測到。25 ℃的操作溫度下，能形成膠束的SDS濃度是8.1 mmol/L[30]，所以考察了10、20 mmol/L和30 mmol/L SDS對分離的影響。保持分離緩沖溶液中30 mmol/L Na2B4O7、20 mmol/L SD以及0.2 g/L PEG 35000保持不變，當SDS為10 mmol/L時，羅丹明B與未知峰的分離效果不好，未達到基線分離；當SDS溶液濃度增至30 mmol/L時，羅丹明B峰變得畸形，而且靈敏度大大降低；而當SDS濃度為20 mmol/L時，羅丹明B靈敏度和分離度最好，且達基線分離。因此20 mmol/L SDS為最佳，結(jié)果如圖2所示。

2.1.5 分離緩沖溶液中SD濃度的優(yōu)化

SD是常用陰離子表面活性劑，含有疏水甲基和親水羧酸根，具有較強的增溶性和聚合性，使其分離能力優(yōu)于SDS[31]。保持30 mmol/L Na2B4O7、20 mmol/L SDS及0.2 g/L PEG 35000濃度不變，考察SD濃度分別為10、20 mmol/L和30 mmol/L時，對羅丹明B的分離及峰形的影響。隨著SD濃度的增加，羅丹明B的靈敏度下降；當SD為10 mmol/L時，羅丹明B的靈敏度最高、峰形也好，但用于實際樣品分析時，羅丹明B與樣品基質(zhì)無法實現(xiàn)完全分離；當SD濃度為20 mmol/L時，雖然羅丹明B的靈敏度較10 mmol/L時略有降低，但樣品分離達到最好，故選擇20 mmol/L SD，如圖3所示。

圖3 分離緩沖溶液中SD濃度對羅丹明B靈敏度的影響Fig. 3 Effects of SD concentrations on the detection sensitivity of rhodamine B

2.1.6 分離緩沖溶液中添加劑及濃度的選擇

PEG 35000在毛細管中起動態(tài)涂層的作用，可以減少管壁對待測物的吸附，改善峰拖尾。保持30 mmol/L Na2B4O7、20 mmol/L SDS以及20 mmol/L SD不變，未加入添加劑時，在10 min內(nèi)未檢測到羅丹明B的峰，加入0.2 g/L PEG 35000時，羅丹明B的靈敏度高、分離好，且用時短，如圖4所示，當加入0.4 g/L PEG 35000后，羅丹明B的峰形變差，靈敏度降低。因此選用0.2 g/L PEG 35000作為添加劑。

圖4 分離緩沖溶液中PEG 35000質(zhì)量濃度對羅丹明B檢測靈敏度的影響Fig. 4 Effects of PEG 35000 concentration on the detection sensitivity of rhodamine B

2.1.7 分離電壓的選擇

分離電壓的高低直接影響著待測物的遷移時間，電壓越高，遷移速率越快，檢測到待測物的時間越短，與此同時焦耳熱也增加，導致羅丹明B的峰區(qū)帶展寬，但是分離電壓過低導致遷移時間延長，經(jīng)優(yōu)化，本實驗采用8 kV電壓進行分離。

2.1.8 進樣時間的選擇

分別對比了2、5 s和8 s進樣時間對分離效果的影響，隨著進樣時間的延長，達到8 s時，雖然羅丹明B的峰高有明顯增加，但出現(xiàn)峰分叉現(xiàn)象，或是平頭峰；而當進樣時間為2 s時，峰高降低，不利于樣品中低含量羅丹明B的檢測；進樣時間為5 s時，靈敏度和峰形達到最優(yōu)，最終選擇進樣時間為5 s。

2.1.9 樣品提取溶液的選擇

分別用超純水、稀釋10 倍后的分離緩沖液、10 mmol/L SDS提取樣品，當用純水和稀釋10 倍后的分離緩沖液作為樣品提取液時，羅丹明B的峰不僅靈敏度低，峰形還展寬變差，當用10 mmol/L SDS時，羅丹明B的峰變銳變高，有明顯的增敏作用。又考察5 mmol/L和15 mmol/L SDS對樣品的提取效果，發(fā)現(xiàn)兩者靈敏度和分離度都不如10 mmol/L SDS合適，故選擇10 mmol/L SDS作為樣品提取液。

2.2 標準曲線及檢出限

將1 g/L羅丹明B儲備液用樣品稀釋液稀釋，配制成質(zhì)量濃度分別為0.02、0.04、0.08、0.16、0.32、0.64、1.28 mg/L的標準系列，在建立的最佳條件下，由低質(zhì)量濃度到高質(zhì)量濃度依次進樣檢測，用校正峰面積（峰面積除以遷移時間）外標法定量，以CE峰的校正峰面積（A）為縱坐標，與其對應的質(zhì)量濃度ρ（mg/L）為橫坐標，繪制標準曲線。其線性回歸方程為A=2 489.41ρ+11.72，線性范圍為0.02～1.28 mg/L，相關(guān)系數(shù)為0.999 9，檢出限及定量限分別為5 μg/L和15 μg/L。

2.3 儀器精密度

分別在0.04、0.16 mg/L及0.64 mg/L三個不同質(zhì)量濃度水平測定儀器精密度。遷移時間的精密度分別為0.25%、0.28%和0.10%（n=7）；相應校正峰面積的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）分別為3.6%、1.5%和3.0%。

2.4 方法精密度

根據(jù)1.3.3節(jié)樣品前處理方法處理番茄沙司和辣椒粉樣品，分別平行處理7 份，在最佳MEKC條件下進行測定，計算樣品含量的RSD，得到方法日內(nèi)精密度分別為2.0%和1.4%。將番茄沙司和辣椒粉樣品平行處理3 份并測得平均值，連續(xù)7 d，計算7 d樣品平均值的RSD，得到方法日間精密度分別為1.6%和1.8%。

2.5 加標回收率

加標回收實驗的本底選擇某品牌番茄醬樣品，選取標曲范圍內(nèi)的0.04、0.16 mg/L和0.64 mg/L三個質(zhì)量濃度水平進行加標。平行處理每個質(zhì)量濃度的樣品5 份，加入標準溶液后室溫放置過夜，使加標溶液與樣品基質(zhì)充分混合，第2天再行提取。樣品中質(zhì)量濃度加標CE結(jié)果如圖5所示，加標回收率分別為100.9%、101.9%和105.8%，相應RSD分別為2.0%、1.4%和3.2%。

圖5 樣品加標回收CE圖Fig. 5 Capillary electrophoregrams for spiked recovery at moderate mass concentration

2.6 樣品分析結(jié)果

表1 番茄醬和番茄沙司實際樣品分析結(jié)果（n=5）Table 1 Results of determination of rhodamine B in tomato sauce,ketchup and chili powder samples (n= 5)

按照1.3.3節(jié)的前處理方法，對3 個番茄醬、3 個番茄沙司和22 個辣椒粉共計28 個樣品進行前處理，每個樣品平行處理5 份進行測定，分別計算其RSD。1#～6#樣品還均用UPLC-FLR的方法[27]進行了測定，測定結(jié)果見表1，經(jīng)統(tǒng)計學檢驗t為0.016，小于0.05，表明兩種方法的測定結(jié)果有顯著性差異，可能的原因是：兩種方法的檢測時間相差半年，再加之樣品在室溫放置，故導致羅丹明B的含量有所下降，提示在今后羅丹明B的標準物質(zhì)研制中，不宜將樣品放置在室溫，而應放置在4 ℃或-20 ℃保存。其中樣品1#～3#均為番茄醬、樣品4#～6#均為番茄沙司。22 個辣椒粉樣品中僅有2 個未檢出羅丹明B，其余20 個均檢出，含量范圍為13.1～798.6 mg/kg。番茄醬、番茄沙司和辣椒粉的CE圖分別見圖6。

圖6 1#番茄醬（A）、4#番茄沙司（B）、8#辣椒粉（C）CE圖Fig. 6 Capillary electrophoregrams of tomato sauce 1# (A), tomato sauce 4# (B), and paprika 8# (C)

3 結(jié) 論

采用MEKC法，結(jié)合LIF檢測器，顯著提高檢測靈敏度；選用硼砂鹽分離緩沖體系及無需有機溶劑的簡單的樣品前處理，既可以提高靈敏度，又可減少前處理時間，還降低了檢測成本。檢出限為5 μg/L，能夠滿足低含量樣品的檢測。28 個樣品中，除1#～6#樣品均為本實驗室制備的質(zhì)控陽性參考樣外，22 個辣椒粉樣品中有20 個樣品中均檢出了羅丹明B，說明辣椒粉中非法添加的現(xiàn)象依然存在。盡管工業(yè)染料性質(zhì)穩(wěn)定，但羅丹明B的食品基體標準物質(zhì)研制中，不宜將樣品放置在室溫，而應放置在4 ℃或-20 ℃保存。