宋晶 劉愛東 郭家娟 高楠 李鵬飛

(1長春中醫(yī)藥大學，吉林 長春 130117；長春中醫(yī)藥大學 2附屬第三臨床醫(yī)院；3附屬醫(yī)院)

心肌纖維化是很多心血管疾病發(fā)展終末期心臟的病理改變，如冠狀動脈慢性缺血，或血管狹窄、堵塞導致的急性心肌缺血；或是擴張型心肌病、肥厚型心肌??；或者是非血管因素導致高血壓性心肌病及炎癥性心肌病等。心肌發(fā)生纖維化改變時，α-平滑肌肌動蛋白(SMA)、波形蛋白(Vimentin)為肌成纖維細胞骨架中主要標志蛋白，目前認為α-SMA是肌成纖維細胞的主要標志，Vimentin是上皮細胞向肌成纖維轉(zhuǎn)化過程中的產(chǎn)物。目前研究中心肌纖維化有多種信號通路，其中轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β信號通路是最為廣泛、常見的信號通路，而人單絲氨酸蛋白激酶(LIMK)是TGF-β信號通路中下游的相關(guān)因子，且多數(shù)用于研究腫瘤細胞的發(fā)生機制〔1～4〕，近年來發(fā)現(xiàn)LIMK的表達亦參與心肌纖維化過程。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(ACEI)類藥物可有效抑制心肌重構(gòu)，減輕心肌纖維化。研究卡托普利抑制心肌纖維化的機制有助于對其病理生理有更進一步的了解，從而對其臨床治療與新藥開發(fā)有指導意義。

1 材料與方法

1.1實驗動物 健康雄性SPF級SD大鼠30只(長春市億斯實驗動物技術(shù)有限公司)，體重(180±10)g，動物合格編號：SCXK(吉)-2018-0007。

1.2實驗藥物 卡托普利片由杭州民生藥業(yè)有限公司提供(批號：T15H048)，鹽酸異丙腎上腺素由Sigma-adrich公司提供(批號：1351005)。

1.3實驗試劑 RNA提取試劑盒(全式金生物技術(shù)有限公司)，基因引物(吉瑪基因-九牧農(nóng)校)，α-SMA抗體和Vimentin抗體(愛博泰克生物技術(shù)有限公司)。LIMK抗體(ab-clon)、預制膠(碧云天生物技術(shù)公司)。胎牛血清(Cellmax)。

1.4實驗器材 聚合酶鏈反應(PCR)儀器(AnalytikJena)；離心機為長沙湘智離心機儀器有限公司；移液管和培養(yǎng)皿(Corning)。

1.5造模與含藥血清的制備 分為對照組、模型組、卡托普利組各10只。大鼠常規(guī)飼養(yǎng)7 d適應環(huán)境后，此過程無死亡，對照組常規(guī)喂養(yǎng)，模型組、卡托普利組給予異丙腎上腺素注射液5 mg/kg腹腔注射。造模當天，卡托普利組每日按5 mg/kg灌胃卡托普利片懸液；對照組每日給予等體積自來水灌胃，共連續(xù)進行3 d后將各組麻醉取心尖部，放入4%多聚甲醛固定液，眼球摘除收集血清在離心管中，-20℃冰箱保存。

1.6蘇木素-伊紅(HE)染色法觀察大鼠心肌組織變化 心肌組織取中間1/3置于4%甲醛固定液試管中固定，梯度酒精溶液脫水，二甲苯溶液中透明后，進行浸蠟與包埋，最后將蠟塊切片、烘箱內(nèi)烤片。HE染色：將切片脫蠟，水洗，蘇木精染色3～5 min，普通清水水洗，分化液分化，水洗，伊紅染色液中染色，酒精脫水(酒精濃度遞減)，二甲苯溶液脫水透明，封片，顯微鏡下觀察。

1.7羥脯氨酸含量測定 取心肌組織心尖部位，鹽水洗滌后剪碎，沸水水浴水解，按照說明書加入試劑后離心，根據(jù)試劑盒使用說明書測定。

1.8細胞培養(yǎng) 將大鼠來源的心肌成纖維細胞用10%高糖血清培養(yǎng)液，加1%雙抗，37℃、二氧化碳濃度為5%的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，根據(jù)細胞生長狀況，2～3 d換液，待細胞長至80%左右時，胰蛋白酶(濃度為0.25%)消化2～4 min，待細胞變圓后，用移液槍吹打至懸浮狀態(tài)后，移至移液管中，12 000 r/min，5 min離心機離心。加入有血清培養(yǎng)液，反復吹打至細胞均勻，分組依次為對照組、模型組、卡托普利組。24 h后細胞貼壁，換液并加入無血清培養(yǎng)液2 ml(細胞饑餓)，24 h后，棄廢液，每組加入2 ml對應的血清，24 h后收集細胞。

1.9熒光定量PCR 每孔細胞棄廢液后用冷卻的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次，加入1 ml裂解液，反復吹打，按照RNA提取試劑盒說明書操作提取RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作對cDNA進行合成，將cDNA當做模板，借助熒光定量 PCR 儀實施測定，以GAPDH作內(nèi)參，計算出各組細胞中α-SMA、Vimentin、LIMK的相對表達量。相關(guān)基因引物序列如下：α-SMA-正向-3 TCT TGA CCT GGC TGG ACG,反向-3 TCTC CTT GAT GTC TCG CAC A;Vim-正向-3 CCG CTT CGC CAA CTA CAT,反向-3 GCT GAT CCA CCT GCC G;LIMK-正向-2 TCC CTC CGA GTG GTT TGT C,反向-2 GAA GTT CAG CCG CTT GTC C。

1.10Western印跡法 蛋白裂解液按照放射免疫沉淀(RIPA)：苯甲磺酰氟(PMSF)=100∶1配制，每孔細胞棄廢液后用冷卻的PBS洗3次，每孔加入150～200 μl裂解液，用細胞刮刀將細胞及細胞試劑刮下，收集到離心管中，并標記分組。離心機12 000 r/min、15 min離心，收集上清液即為提取的蛋白。二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白濃度。蛋白變性后上樣。電泳：130 V電壓、50 min。轉(zhuǎn)膜：按照分子量大小，低溫，200 mA轉(zhuǎn)膜15～60 min；封閉：5%脫脂奶粉封閉1 h；加一抗：脫脂奶粉用Tween-20 Tris鹽酸緩沖液(TBST)洗3遍，加入一抗(1∶500)，4℃冰箱過夜。第二天一抗室溫搖床1 h，收集一抗，TBST洗一抗3遍。加二抗：根據(jù)一抗來源屬性加入相應的二抗。洗膜：TBST洗二抗洗3遍。顯影：將電化學增強(ECL)曝光液滴于膜上，由凝膠成像系統(tǒng)進行曝光處理。 借助軟件Image-J來分析各抗體條帶灰度值。

1.11統(tǒng)計學分析 采用SPSS26.0軟件進行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1HE染色 與對照組比較，模型組與卡托普利組細胞排列紊亂，細胞變大，細胞核分布不均勻，出現(xiàn)壞死灶。與模型組比較，卡托普利組心肌細胞壞死面積較小。見圖1。說明異丙腎上腺素注射液5 mg/kg腹腔注射大鼠后，大鼠心肌出現(xiàn)纖維化改變，纖維組織增多?？ㄍ衅绽M與模型組比較，出現(xiàn)心肌纖維化改善，說明卡托普利可以抑制心肌重構(gòu)，改善心肌纖維化。

2.2心肌組織中羥脯氨酸含量 與對照組〔(0.168±0.024)μg/mg〕比較，模型組羥脯氨酸含量〔(0.228±0.011)μg/mg〕明顯增加(P<0.05);與模型組比較，卡托普利組羥脯胺酸含量〔(0.180±0.015)μg/mg〕明顯減少(P<0.05)。

圖1 各組心肌組織(HE染色，×200)

2.3熒光定量PCR檢測α-SMA、Vim、LIMK mRNA相對表達量 與對照組比較，模型組、卡托普利組α-SMA、Vim、LIMK mRNA相對表達量均明顯增加(P<0.05)；與模型組比較，卡托普利組α-SMA、Vim、LIMK mRNA相對表達量均明顯減少(P<0.05)。見表1。

表1 各組成纖維細胞中α-SMA、Vim、LIMK mRNA表達

與對照組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05；表2同

2.4各組成纖維細胞中α-SMA、Vim、LIMK蛋白相對表達量 與對照組比較，模型組卡托普利組α-SMA、Vim蛋白及模型組LIMI蛋白相對表達量均明顯增加(P<0.05);與模型組比較，卡托普利組α-SMA、Vim、LIMK蛋白相對表達量均明顯減少(P<0.05)。見圖2和表2。

圖2 各組成纖維細胞中α-SMA、Vim、LIMK蛋白表達

表2 各組成纖維細胞中α-SMA、Vim、LIMK蛋白相對表達

3 討 論

心肌纖維化過程是復雜而多樣的，各種原因均可導致纖維化，如炎癥反應、血管內(nèi)皮功能障礙、氧化應激、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)、TGF的激活等。研究〔5，6〕表明通過調(diào)控TGF相關(guān)蛋白表達可以降低心肌纖維化的發(fā)生。在纖維化分子生物學中，上皮細胞向間充質(zhì)細胞的轉(zhuǎn)分化(EMT)發(fā)揮重要作用，而發(fā)生間質(zhì)纖維化的間質(zhì)細胞表達肌成纖維細胞標志性蛋白為α-SMA和Vim〔7，8〕。α-SMA存在于人類小鼠(小家鼠)和其他哺乳動物的橫紋肌中，包括骨骼和心臟及平滑肌中〔9〕。當某些因素如損傷、TGF作用下，使成纖維細胞激活，進而表達α-SMA，形成Vim細胞骨架，使其向肌成纖維細胞分化。同時細胞外基質(zhì)成分的合成分泌及細胞增殖能力均顯著增強，參與組織損傷修復〔10，11〕、纖維化疾病過程〔12〕。Vim蛋白是EMT過程中間充質(zhì)細胞的標志物，通過使上皮細胞失去極性、減弱黏附力、增加運動能力等，從而破壞細胞的緊密連接結(jié)構(gòu)，改變細胞骨架的結(jié)構(gòu)，促進細胞纖維化〔13〕。卡托普利可能通過下調(diào)α-SMA及Vim蛋白的相對表達量，抑制EMT，從而達到抑制心肌纖維化的目的。肌成纖維細胞是從TGF-β中的內(nèi)皮細胞中衍生而來的〔14〕，LIMK是TGF信號通路下游的一個相關(guān)蛋白，Mardilovich 等〔15〕研究發(fā)現(xiàn)，LIMK 抑制劑可以降低細胞中磷酸化絲切蛋白(Cofilin)蛋白表達水平，同時也可以促進腫瘤細胞的凋亡。TGF-β/LIMK信號通路雖然被證實與纖維化有關(guān)，但目前關(guān)于心肌纖維化的研究較少。LIMK1是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，磷酸化并滅活Cofilin〔16〕，Cofilin與細胞內(nèi)肌動蛋白骨架重組關(guān)系密切〔17〕，卡托普利在干預大鼠心肌成纖維細胞時，通過下調(diào)TGF-β信號通路中的LIMK蛋白，并且可能進一步磷酸化并滅活Cofilin而抑制細胞內(nèi)肌動蛋白骨架重組，進一步達到抑制心肌纖維化作用。當心肌發(fā)生纖維化改變時，由于Ⅰ型及Ⅲ型膠原蛋白大量沉積，且兩種蛋白具有一定黏附性，一般的酸性或堿性環(huán)境均很難測定出其含量，而羥脯氨酸是膠原蛋白含量最高的氨基酸，由于通過羥脯氨酸含量檢測可以大致計算出膠原蛋白含量，反映膠原蛋白沉積程度，所以將其用于心肌纖維化的衡量標準。當用鹽酸異丙腎上腺素制備大鼠心肌纖維化模型時，羥脯胺酸含量增高，說明膠原蛋白沉積加重，心肌纖維化形成。說明卡托普利抑制了膠原蛋白的形成。本實驗中卡托普利是ACEI類藥物，可以抑制血管緊張素Ⅰ向血管緊張素Ⅱ轉(zhuǎn)化，當體內(nèi)血管緊張素Ⅱ濃度升高時，則可引起氧化應激反應〔18〕，過度的氧化應激反應可以導致炎癥發(fā)生，促進細胞凋亡，引起組織不同程度損傷，甚至壞死〔19〕。氧化應激水平的升高可以產(chǎn)生膠原纖維、促纖維化細胞因子、生長因子等，進而促進纖維化的發(fā)生〔20〕。而用鹽酸異丙腎上腺素制備大鼠心肌纖維化模型時，同樣使大鼠發(fā)生氧化應激反應，卡托普利在降低血管緊張素Ⅱ濃度、抑制氧化應激反應的同時，LIMK及α-SMA、Vim蛋白含量下降，而LIMK、α-SMA是 TGF-β信號通路上的重要相關(guān)蛋白，說明TGF-β/LIMK信號通路參與改善心肌纖維化作用，并且當LIMK、α-SMA蛋白下調(diào)時，可以抑制或逆轉(zhuǎn)心肌纖維化，這為以后治療心肌纖維化找到新靶點，提供新思路。心肌纖維化發(fā)病機制有多種，TGF-β信號通路是心肌纖維化機制中的一個重要通路，在這條信號通路上游，還有絲氨酸/蘇氨酸激酶(ROCK)/小G蛋白超家族的亞家族成員之一(ROHA)等相關(guān)因子，在下游仍有膠原蛋白及Cofilin相關(guān)蛋白，可以進行進一步相關(guān)研究。本研究可明確卡托普利抑制心肌纖維化的機制為下調(diào)LIMK及α-SMA、Vim因子，同時證實了TGF-β/LIMK信號通路參與了心肌纖維化的抑制作用。