李 楊 李明達(dá) 王中江 鄭 麗 滕 飛

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院， 哈爾濱 150030)

0 引言

維生素B12又被稱為鈷胺素，是唯一含有金屬元素的水溶性維生素，也是B族中最晚發(fā)現(xiàn)的一種。作為一種重要的營養(yǎng)因子，維生素B12參與葉酸轉(zhuǎn)化、蛋氨酸合成等生化反應(yīng)，維生素B12缺乏會導(dǎo)致惡性貧血和神經(jīng)疾病等[1]。維生素B12的穩(wěn)定性主要受到光、熱、溶液pH值的影響，在食品加工過程中常轉(zhuǎn)變?yōu)楦鞣N類似物[2]。根據(jù)《中國居民膳食營養(yǎng)素參考攝入量》[3]，成人維生素B12推薦攝取量為2.4 μg/d，該營養(yǎng)素人體自身不能合成，必須從食物中攝取，動物性產(chǎn)品(如魚或貝類、雞蛋、動物肝臟等)是其主要攝取源[4]。由于維生素B12易損失、不穩(wěn)定，構(gòu)建天然保護(hù)機(jī)制是防止其被破壞的最直接手段，也是高效利用維生素B12、開發(fā)強(qiáng)化食品、防止維生素B12缺乏癥的關(guān)鍵。

食品級蛋白質(zhì)是生物活性化合物的潛在載體，大豆蛋白是目前唯一含有人體所需8種氨基酸、且含量滿足人體需求的植物蛋白，因其高營養(yǎng)價(jià)值和良好的消化性和功能性能(乳化性、凝膠性、起泡性等)而被廣泛應(yīng)用于食品加工中[5]。同時(shí)，大豆蛋白分子肽鏈中含有豐富的疏水氨基酸殘基和帶電氨基酸殘基，可通過疏水相互作用、靜電作用和氫鍵作用等與水溶性營養(yǎng)成分結(jié)合，不僅能很好地傳遞和運(yùn)載水溶性活性物質(zhì)，還能夠提高營養(yǎng)成分的生物利用率，甚至可以提高蛋白的某些功能特性[6]。文獻(xiàn)[7]研究發(fā)現(xiàn)，熱處理的大豆蛋白與花青素通過疏水作用結(jié)合后，提高了蛋白的消化率。文獻(xiàn)[8]將大豆蛋白與葉酸復(fù)合制備納米凝膠，可使葉酸維持天然結(jié)構(gòu)及生物活性，并在腸道環(huán)境中迅速釋放。文獻(xiàn)[9]研究發(fā)現(xiàn)，季銨鹽改性后的大豆蛋白與抗壞血酸復(fù)合，水溶性維生素表現(xiàn)出較高結(jié)合率，同時(shí)改善大豆蛋白的溶解性。

食品中的維生素B12以蛋白結(jié)合型存在，研究食源蛋白與維生素B12的相互作用對提高維生素B12穩(wěn)定性至關(guān)重要。已有文獻(xiàn)對維生素B12與蛋白質(zhì)的相互作用進(jìn)行了研究。文獻(xiàn)[10]研究了維生素B12和牛血清白蛋白(BSA)復(fù)合物在不同pH值條件下的結(jié)合親和性，結(jié)果表明：維生素B12在酸性和堿性(pH值2.5、3.5、5.0和9.0)條件下與BSA的結(jié)合能力低于模擬生理?xiàng)l件(pH值 7.4)，并且相互作用使BSA的二級和三級結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著的變化。文獻(xiàn)[11]通過熒光光譜法和紫外吸收光譜法研究了生理?xiàng)l件下維生素B12與牛血清白蛋白之間的相互作用，結(jié)果表明，維生素B12對牛血清白蛋白的熒光有猝滅作用，其猝滅過程屬于靜態(tài)猝滅并且二者的結(jié)合位點(diǎn)位于色氨酸附近。文獻(xiàn)[12]將乳清蛋白與維生素B12復(fù)合，維生素B12的光熱穩(wěn)定性提高了10%～30%?？梢姡ㄟ^維生素B12與蛋白結(jié)合可提高維生素B12的穩(wěn)定性，但具有代表性的食源蛋白(大豆分離蛋白)與維生素B12的相互作用研究尚未見相關(guān)報(bào)道。

本文利用光譜技術(shù)(熒光光譜、紫外光譜、紅外光譜、圓二色譜)研究大豆分離蛋白與維生素B12的相互作用對大豆分離蛋白結(jié)構(gòu)的影響，以期為提高維生素B12穩(wěn)定性、開發(fā)維生素B12營養(yǎng)強(qiáng)化食品提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

低溫脫脂豆粕，山東禹王生態(tài)食業(yè)有限公司；維生素B12，美國Sigma試劑公司；氫氧化鈉、鹽酸等為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

FD-1C型冷凍干燥機(jī)，北京德天佑科技發(fā)展有限公司；FJ-200型高速分散均質(zhì)機(jī)，上海標(biāo)本模型廠；LGR20-W型臺式高速冷凍離心機(jī)，北京京立離心機(jī)有限公司；F-4500型熒光分光光度計(jì)，日本HITACHI公司；TU-1800型紫外可見分光光度計(jì)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1大豆分離蛋白制備

參照文獻(xiàn)[13]的方法并稍作修改，將低溫脫脂豆粕與去離子水按照液料比10 mL/g混合后，用2 mol/L NaOH溶液調(diào)pH 值至8.0，室溫(20℃)攪拌2 h后，溶液于9 000g離心30 min，取上清液用2 mol/L HCl溶液調(diào)pH 值至4.5。溶液靜置2 h后于7 500g離心30 min 得到蛋白沉淀，將蛋白沉淀溶于去離子水后洗滌3次，用2 mol/L NaOH調(diào)溶液的pH值至7.0。最后將蛋白溶液倒入平皿中冷凍干燥后得粉末狀大豆分離蛋白，儲藏備用。

1.3.2大豆分離蛋白-維生素B12復(fù)合物制備

參照文獻(xiàn)[12]的方法并稍作修改，取1.2 mg大豆分離蛋白溶于磷酸鹽緩沖溶液中(0.01 mol/L，pH值7.4)，配制質(zhì)量濃度為12 mg/mL的大豆分離蛋白溶液，于4℃下儲存。取16 mg維生素B12溶于磷酸鹽緩沖溶液中(0.01 mol/L，pH值7.4)，配制質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL的維生素B12溶液，于4℃下儲存。將大豆分離蛋白溶液稀釋至300 μg/mL，分別與不同質(zhì)量濃度的維生素B12(0、10、20、28、40、50 μg/mL)混合，室溫下黑暗攪拌1 h，得到大豆分離蛋白-維生素B12復(fù)合物。

1.3.3熒光光譜測定

參照文獻(xiàn)[14]的測定方法并稍作修改，大豆分離蛋白-維生素B12復(fù)合物的內(nèi)源性熒光光譜采用F-4500型熒光分光光度計(jì)進(jìn)行掃描。將復(fù)合物樣品用0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH值7.4)配制成質(zhì)量濃度為0.15 mg/mL的溶液。激發(fā)波長設(shè)定為290 nm，發(fā)散波長掃描范圍為300～500 nm，激發(fā)狹縫寬度為5 nm，發(fā)射狹縫寬度也為5 nm，掃描速度為240 nm/min。同步熒光光譜：室溫下，分別固定Δλ=15 nm和Δλ=60 nm，其中Δλ表示激發(fā)波長和發(fā)射波長彼此間保持固定的波長間隔。

1.3.4熒光猝滅機(jī)理

參照文獻(xiàn)[15]的測定方法并稍作修改，將大豆分離蛋白-維生素B12復(fù)合物樣品等分為3份，分別置于25、33、41℃的恒溫水浴鍋中保溫10 min，利用熒光光譜儀連續(xù)掃描并記錄測定樣品的熒光強(qiáng)度。光譜參數(shù)同上，重復(fù)掃描3次。

1.3.5紫外光譜測定

參照文獻(xiàn)[16]的測定方法并稍作修改，采用紫外分光光度計(jì)掃描大豆分離蛋白-維生素B12復(fù)合物的紫外光譜。用0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH值7.4)將復(fù)合物樣品稀釋為0.15 mg/mL后，于室溫條件下進(jìn)行紫外光譜掃描，掃描范圍250～350 nm，掃描速度為200 nm/min，分辨率為2 nm。

1.3.6紅外光譜測定

參照文獻(xiàn)[17]的測定方法并稍作修改，稱取大豆分離蛋白-維生素B12復(fù)合物1 mg，加入溴化鉀100 mg，充分混勻壓片后于室溫進(jìn)行紅外光譜掃描。設(shè)定波譜的掃描范圍：400～4 000 cm-1，分辨率：4 cm-1，掃描64次，利用Peakfit 4.2.0軟件處理譜圖并通過積分面積計(jì)算各二級結(jié)構(gòu)的相對含量。

1.3.7圓二色譜測定

將大豆分離蛋白-維生素B12復(fù)合物溶解在磷酸鹽緩沖溶液中，將蛋白質(zhì)量濃度配制為0.5 mg/mL，將樣品溶液在190～250 nm遠(yuǎn)紫外區(qū)進(jìn)行掃描，掃描速度為 60 nm/min，分辨率為0.2 nm，響應(yīng)時(shí)間為0.25 s，狹縫寬度為1 nm。使用CDpro軟件擬合蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的組成與含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

圖表制作采用Origin Pro 8.5軟件，使用SPSS 19.0進(jìn)行ANOVA差異顯著性分析和方差分析(P<0.05為顯著性差異)。每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 熒光光譜分析

大豆蛋白內(nèi)部因含有不同的發(fā)色基團(tuán)如色氨酸(Trp)，酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe)而表現(xiàn)出內(nèi)源熒光特性[18]。在激發(fā)波長為290 nm時(shí)，主要考慮色氨酸和酪氨酸。文獻(xiàn)[19]指出，蛋白的最大發(fā)射波長λmax與色氨酸等殘基所處的微環(huán)境密切相關(guān)，當(dāng)最大發(fā)射波長λmax超過330 nm時(shí)，殘基處于外部極性環(huán)境中，相反，則表示殘基處于內(nèi)部非極性環(huán)境。大豆分離蛋白與維生素B12復(fù)合體系的熒光光譜如圖1所示，當(dāng)?shù)鞍诐舛裙潭〞r(shí)，隨著維生素B12添加量的增大，大豆分離蛋白的熒光強(qiáng)度逐步降低，說明維生素B12對大豆蛋白的內(nèi)源熒光產(chǎn)生了猝滅作用。并且大豆分離蛋白的最大發(fā)射波長λmax由340.6 nm藍(lán)移至334.6 nm，藍(lán)移了6 nm，以上現(xiàn)象說明維生素B12與大豆分離蛋白發(fā)生了結(jié)合，使其構(gòu)象發(fā)生了變化，色氨酸和酪氨酸的內(nèi)部微環(huán)境也趨向改變，表現(xiàn)出一種由極性環(huán)境向非極性環(huán)境轉(zhuǎn)變的趨勢，可能是由于維生素B12與蛋白表面的親水性側(cè)鏈殘基相互作用，降低熒光強(qiáng)度，從而改變了色氨酸殘基的微環(huán)境[20]。文獻(xiàn)[21]在研究維生素B12與牛血清白蛋白(BSA)結(jié)合機(jī)理時(shí)也發(fā)現(xiàn)了最大發(fā)射波長藍(lán)移現(xiàn)象，可能的原因?yàn)榫S生素B12與牛血清白蛋白表面第134位的色氨酸殘基結(jié)合改變了其所處微環(huán)境的極性。而文獻(xiàn)[22]報(bào)道花青素與大豆分離蛋白結(jié)合后，蛋白的最大發(fā)射波長λmax發(fā)生紅移，肽鏈趨于伸展。這可能是由于維生素B12含有一個(gè)咕啉大環(huán)，分子量較大，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，與蛋白的結(jié)合方式不同，從而導(dǎo)致蛋白分子的結(jié)構(gòu)變化差別較大。

圖1 不同維生素B12質(zhì)量濃度下大豆分離蛋白與維生素B12復(fù)合體系的熒光光譜譜圖Fig.1 Fluorescence spectra of soybean protein isolate and vitamin B12 composite system

2.2 熒光猝滅機(jī)理

熒光猝滅機(jī)理一般可以分為靜態(tài)猝滅和動態(tài)猝滅兩種作用形式。靜態(tài)猝滅主要是指猝滅劑與熒光物質(zhì)之間相互作用形成復(fù)合物而導(dǎo)致熒光強(qiáng)度下降，溫度升高后，猝滅常數(shù)(即Stern-Volmer曲線斜率)下降；動態(tài)猝滅則相反，主要是指猝滅劑與熒光物質(zhì)間相互碰撞產(chǎn)生一定程度的電子轉(zhuǎn)移或能量轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度減弱，該過程與擴(kuò)散效應(yīng)相關(guān)，溫度上升促進(jìn)了分子碰撞的劇烈程度，因此隨著溫度上升，動態(tài)猝滅常數(shù)增大[23]。根據(jù)Stern-Volmer方程[24]計(jì)算不同溫度條件下的猝滅常數(shù)，從而可以初步判斷該反應(yīng)的熒光猝滅機(jī)制[25]為

(1)

式中F0——大豆分離蛋白中未加入猝滅劑(維生素B12)時(shí)的熒光強(qiáng)度

F——加入猝滅劑時(shí)的熒光強(qiáng)度

Kq——雙分子猝滅速率常數(shù)，L/(mol·s)

Ksv——猝滅常數(shù)，L/mol

Q——猝滅劑濃度，mol/L

τ0——無猝滅劑時(shí)生物大分子的平均熒光壽命，取10-8s

根據(jù)Stern-Volmer方程，以Q為自變量，以F0/F為因變量擬合一次函數(shù)方程，如圖2所示。曲線斜率代表猝滅常數(shù)Ksv，進(jìn)一步求解可得Kq。

圖2 不同溫度條件下大豆分離蛋白與維生素B12復(fù)合物的Stern-Volmer曲線Fig.2 Stern-Volmer plots of SPI interacting with vitamin B12 at three temperatures

由圖2可知，Stern-Volmer方程的曲線斜率隨著溫度的上升而逐漸降低，可以推斷維生素B12對大豆分離蛋白的熒光猝滅機(jī)理屬于靜態(tài)猝滅，一般來說，各類猝滅劑對生物大分子的最大猝滅速率常數(shù)Kq為2×1010L/(mol·s)，而表1中維生素B12對大豆分離蛋白的熒光猝滅速率常數(shù)均大于2×1010L/(mol·s)，并且隨著溫度上升，Kq逐漸降低，更有力地證明了維生素B12對大豆分離蛋白的猝滅方式是由于維生素B12與大豆分離蛋白相互作用形成了基態(tài)配合物而引發(fā)了靜態(tài)猝滅[26]。

表1 維生素B12與大豆分離蛋白復(fù)合物的熒光猝滅速率常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)、結(jié)合常數(shù)Tab.1 Fluorescence quenching constants, binding sites and apparent binding constants of vitamin B12-SPI complex

注：同列不同字母表示差異顯著，下同。

由圖2和表1已知維生素B12對大豆分離蛋白的猝滅機(jī)制為靜態(tài)猝滅，二者的結(jié)合常數(shù)Ka和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n滿足公式

(2)

圖3 不同溫度下維生素B12猝滅大豆分離蛋白的雙對數(shù)曲線Fig.3 Double logarithmic curves of vitamin B12 quenched soybean protein isolate at different temperatures

以lg((F0-F)/F)對lgQ作圖，不同溫度下維生素B12猝滅大豆分離蛋白的雙對數(shù)曲線如圖3所示。所得的曲線斜率為維生素B12與大豆分離蛋白的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n，將截距換算為結(jié)合常數(shù)Ka。根據(jù)表1數(shù)據(jù)顯示，維生素B12與大豆分離蛋白在298、306、314 K溫度下作用時(shí)，二者間的結(jié)合常數(shù)為4.121×105、1.256×105、1.806×105L/mol，表明二者存在較強(qiáng)的相互作用。并且維生素B12與大豆分離蛋白在3種不同溫度下的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)都接近于1，說明維生素B12與大豆分離蛋白之間存在一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。文獻(xiàn)[21]證明了維生素B12與牛血清白蛋白也存在一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。

小分子物質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的作用力主要為疏水作用力、靜電相互作用、氫鍵以及范德華力。通過Vant Hoff 方程，可計(jì)算出熱力學(xué)參數(shù)值。維生素B12與大豆分離蛋白之間的相互作用符合熱力學(xué)公式

(3)

ΔG=-RTlnKa=ΔH-TΔS

(4)

式中 ΔH——焓變，kJ/mol

ΔS——熵變，kJ/(mol·K)

ΔG——生成自由能變，kJ/mol

R——?dú)怏w常數(shù)，取8.314 J/(mol·K)

T——溫度，K

當(dāng)溫度變化不大時(shí)，反應(yīng)的ΔH可看作常數(shù)。

根據(jù)文獻(xiàn)[27]總結(jié)的小分子與生物大分子反應(yīng)的熱力學(xué)參數(shù)變化判斷二者間主要作用力的類型規(guī)律：當(dāng)ΔH>0且ΔS>0時(shí)，為疏水作用力；ΔH<0且ΔS<0時(shí)，為范德華力和氫鍵作用；ΔH<0且ΔS>0時(shí)，為靜電相互作用。

由表2可知，維生素B12與大豆分離蛋白的自由能變小于0，說明這是一個(gè)自由能降低的自發(fā)過程，ΔH<0且ΔS<0，表明維生素B12與大豆分離蛋白之間的主要作用力是范德華力和氫鍵。文獻(xiàn)[28]在研究花青素與小麥蛋白的相互作用機(jī)理發(fā)現(xiàn)，中性條件下黑豆皮中的花青素(矢車菊素-3-O-葡萄糖苷，C3G)與麥谷蛋白主要通過范德華力和氫鍵作用結(jié)合。

表2 維生素B12與大豆分離蛋白復(fù)合物的熱力學(xué)參數(shù)值Tab.2 Thermodynamic parameters of complex of vitamin B12 and soybean protein isolate

2.3 同步熒光光譜分析

同步熒光光譜通常應(yīng)用于小分子和生物大分子相互作用的研究中，通過測量發(fā)射波長偏移研究對應(yīng)氨基酸附近環(huán)境的極性情況從而反映小分子對生物大分子物質(zhì)構(gòu)象變化的影響[29]。通過將激發(fā)波長和發(fā)射波長之差Δλ固定在15 nm或60 nm，分別對大豆分離蛋白中的酪氨酸和色氨酸殘基周圍的極性變化進(jìn)行分析[30]。

圖4 不同維生素B12質(zhì)量濃度下大豆分離蛋白與維生素B12復(fù)合體系的同步熒光光譜Fig.4 Synchronous fluorescence spectra of soybean protein isolate and vitamin B12 complex system

維生素B12與大豆分離蛋白相互作用的同步熒光光譜如圖4所示，隨著維生素B12質(zhì)量濃度的增加，酪氨酸殘基和色氨酸殘基的熒光強(qiáng)度逐漸降低，在Δλ=60 nm的情況下，同步熒光峰有輕微的藍(lán)移，從282 nm藍(lán)移至279 nm，而在Δλ=15 nm時(shí)，同步熒光峰無明顯移動，可判斷維生素B12對酪氨酸殘基的微環(huán)境無明顯改變，而色氨酸殘基所處的微環(huán)境疏水性增加，極性降低，表明維生素B12與大豆分離蛋白結(jié)合位點(diǎn)更接近于色氨酸殘基，推測可能的原因?yàn)榫S生素B12與大豆分離蛋白的相互作用可能誘導(dǎo)色氨酸附近的多肽鏈形成折疊，從而微環(huán)境疏水性進(jìn)一步增加[21]。文獻(xiàn)[11]在研究維生素B12與牛血清白蛋白的相互作用時(shí)也得出了相似的結(jié)論。

2.4 紫外光譜分析

根據(jù)蛋白質(zhì)的色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸殘基的紫外吸收峰不同，可以通過紫外光譜儀分析蛋白三級結(jié)構(gòu)的變化[18]。由圖5可知，大豆分離蛋白在280 nm附近存在紫外吸收峰，而維生素B12在361、520、550 nm處存在紫外吸收峰，隨著維生素B12質(zhì)量濃度的增大，大豆分離蛋白和維生素B12復(fù)合體系的紫外最大吸收峰由288 nm藍(lán)移到284 nm，說明維生素B12對大豆分離蛋白的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了影響，色氨酸所處的微環(huán)境疏水性增強(qiáng)，這與熒光光譜分析中蛋白結(jié)構(gòu)變化結(jié)果一致。并且大豆分離蛋白和維生素B12均為芳香族化合物，這種結(jié)構(gòu)變化可能會促使其參與非共價(jià)的π-π堆積作用，文獻(xiàn)[31]也報(bào)道了大豆分離蛋白構(gòu)象的變化與分子中色氨酸殘基和酪氨酸殘基芳香雜環(huán)的π-π*躍遷有關(guān)。

圖5 大豆分離蛋白與維生素B12復(fù)合體系的紫外光譜圖Fig.5 UV spectra of soybean protein isolate and vitamin B12 composite system

2.5 紅外光譜分析

紅外光譜是一種分析蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的光譜技術(shù)[32]。通過紅外光譜可以進(jìn)一步考察蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化。加入不同質(zhì)量濃度維生素B12的大豆分離蛋白紅外光譜如圖6所示。酰胺Ⅰ帶紅外吸收峰的變化主要反映了蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的變化。根據(jù)已有的研究表明：蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)與各子峰間的對應(yīng)關(guān)系為：波數(shù)1 646～1 664 cm-1處對應(yīng)的結(jié)構(gòu)為α-螺旋；波數(shù)1 615～1 637 cm-1和1 682～1 700 cm-1處對應(yīng)的結(jié)構(gòu)為β-折疊；波數(shù)1 664～1 681 cm-1處對應(yīng)的結(jié)構(gòu)為β-轉(zhuǎn)角；波數(shù)1 637～1 645 cm-1處對應(yīng)的結(jié)構(gòu)為無規(guī)則卷曲[33]。由圖6可知，維生素B12加入后，大豆分離蛋白的酰胺I帶發(fā)生輕微紅移(由1 633.3 cm-1紅移到1 635.8 cm-1)而酰胺Ⅱ帶基本沒有移動，可能是因?yàn)榫S生素B12與大豆蛋白發(fā)生了相互作用，通過氫鍵結(jié)合形成復(fù)合物，導(dǎo)致大豆分離蛋白肽鏈重排，最終導(dǎo)致二級結(jié)構(gòu)的變化[34]。此外，大豆蛋白酰胺Ⅰ帶的強(qiáng)度有所減弱，說明α-螺旋的含量在加入維生素B12后明顯增加。文獻(xiàn)[31]研究大豆分離蛋白與花青素的相互作用發(fā)現(xiàn)，蛋白的酰胺I帶發(fā)生了紅移引起二級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。

圖6 不同維生素B12質(zhì)量濃度下大豆分離蛋白-維生素B12復(fù)合物中大豆分離蛋白的紅外光譜圖Fig.6 Infrared spectra of SPI in soybean protein isolate and vitamin B12 complex

2.6 圓二色譜分析

圓二色譜是一種通過檢測水溶性蛋白進(jìn)而計(jì)算各種蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)含量的技術(shù)。加入維生素B12前后，大豆蛋白的二級結(jié)構(gòu)含量如表3所示。隨著維生素B12質(zhì)量濃度的增大，大豆蛋白二級結(jié)構(gòu)含量均發(fā)生了明顯的變化。α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角相對含量逐漸升高，β-折疊和無規(guī)則卷曲相對含量逐漸降低，這表明β-折疊和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)逐漸向α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變，可能是由于維生素B12與大豆蛋白表面的親水性側(cè)鏈結(jié)合，改變了蛋白的構(gòu)象，一定程度上提高了蛋白質(zhì)聚合程度[35]。圓二色譜的結(jié)果證明了維生素B12的結(jié)合改變了大豆蛋白的構(gòu)象，改變了熒光基團(tuán)周圍的局部微環(huán)境，形成了更有組織的構(gòu)象，與紅外光譜得出的結(jié)果相一致。

表3 大豆分離蛋白-維生素B12復(fù)合物中大豆分離蛋白二級結(jié)構(gòu)相對含量Tab.3 Relative content of SPI secondary structure in soybean protein isolate and vitamin B12 complex

3 結(jié)論

(1)熒光光譜分析表明，維生素B12對大豆分離蛋白具有熒光猝滅作用，猝滅機(jī)制為靜態(tài)猝滅，二者主要通過范德華力和氫鍵作用結(jié)合，結(jié)合位點(diǎn)數(shù)為1。

(2)同步熒光光譜分析表明，維生素B12與大豆分離蛋白的結(jié)合位點(diǎn)更接近色氨酸殘基；紫外吸收

光譜分析表明，維生素B12使得大豆蛋白中色氨酸殘基所處微環(huán)境發(fā)生變化，疏水性增強(qiáng)，改變了大豆蛋白的構(gòu)象。

(3)紅外光譜和圓二光譜分析表明，維生素B12的加入改變了大豆分離蛋白的二級結(jié)構(gòu)，具體表現(xiàn)為β-折疊和無規(guī)則卷曲相對含量減少、α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角相對含量增加。