周振 劉志豪 楊曉萌 賴(lài)燕秋 王振亞 周麗平 孟冠南 江洪

心臟自主神經(jīng)系統(tǒng)在心房顫動(dòng)(簡(jiǎn)稱(chēng)房顫)的發(fā)生和發(fā)展中扮演重要角色[1-2]，心臟神經(jīng)節(jié)叢(GP)為內(nèi)源性心臟自主神經(jīng)系統(tǒng)的重要組成部分，由心房表面豐富的脂肪墊所包繞。臨床研究顯示心外膜脂肪體積與房顫的發(fā)生呈正相關(guān)[3]，提示脂肪組織可能在房顫的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。脂肪組織不僅能調(diào)節(jié)能量代謝，還能作為內(nèi)分泌器官分泌多種脂肪因子[4]。近期研究發(fā)現(xiàn)，脂肪組織分泌的脂肪因子瘦素可激活心臟交感神經(jīng)系統(tǒng)[5]。脂聯(lián)素作為另外一種重要的脂肪因子，不僅能調(diào)節(jié)糖脂代謝水平，還可拮抗瘦素所致的交感神經(jīng)激活[6]。已有研究表明，中樞腦室內(nèi)注射脂聯(lián)素能降低外周腎交感神經(jīng)活性[7]，但脂聯(lián)素對(duì)心臟自主神經(jīng)系統(tǒng)的作用尚不明確。筆者擬通過(guò)心臟神經(jīng)節(jié)局部注射脂聯(lián)素探究其對(duì)心臟自主神經(jīng)節(jié)叢功能和活性的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物準(zhǔn)備及實(shí)驗(yàn)流程 本研究由武漢大學(xué)人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審核并批準(zhǔn)，12只成年雄性比格犬(體重8～12 kg)由武漢大學(xué)人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用3%的戊巴比妥鈉靜脈全身麻醉后置于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物手術(shù)臺(tái)，行氣管插管，連接動(dòng)物呼吸機(jī)(型號(hào)MAO01746，哈佛儀器，美國(guó))，麻醉初始劑量為30 mg/kg ，維持劑量為2 mg/kg。連接體表心電圖，行股動(dòng)脈、股靜脈置管并進(jìn)行心電、血壓監(jiān)測(cè)(Lead 7000系統(tǒng)，四川錦江電子科技有限公司)，通過(guò)靜脈途徑以50～100 ml/L速度靜脈滴注生理鹽水以補(bǔ)充體液丟失。實(shí)驗(yàn)臺(tái)使用加熱墊，使比格犬體溫維持在(36.5±1.5)℃。

12只成年雄性比格犬隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組(n=6)和對(duì)照組(n=6)。比格犬全身麻醉狀態(tài)下，取左側(cè)臥位經(jīng)右側(cè)第五肋間開(kāi)胸暴露心臟右前神經(jīng)節(jié)叢(ARGP)，測(cè)定基礎(chǔ)狀態(tài)下ARGP功能和神經(jīng)活性。其中，電壓遞增式高頻電刺激ARGP引起心率下降的程度代表ARGP功能狀態(tài)。使用微電極記錄ARGP神經(jīng)元放電頻率和振幅以反映ARGP神經(jīng)活性。測(cè)定完畢后，實(shí)驗(yàn)組將10μg脂聯(lián)素溶于0.1 mL生理鹽水后注射至ARGP，對(duì)照組注入等體積生理鹽水。20 min后再次測(cè)量ARGP功能和神經(jīng)活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后留取ARGP組織行免疫熒光染色，觀察ARGP神經(jīng)元上脂聯(lián)素受體1和脂聯(lián)素受體2的表達(dá)情況。

1.2脂聯(lián)素微注射 右側(cè)開(kāi)胸后，剪開(kāi)心包，于右上肺靜脈與右心房連接處確定ARGP脂肪墊位置(如圖1所示)。取10 μg脂聯(lián)素(Enzo Life Sciences公司，美國(guó))溶于0.1 mL生理鹽水，使用微量注射器(Hamilton公司，瑞士)將脂聯(lián)素緩慢多點(diǎn)注射至ARGP。注射完成后，保持針頭固定1 min，以避免脂聯(lián)素溢出。既往文獻(xiàn)[7]報(bào)道腦室內(nèi)局部給予脂聯(lián)素(最佳有效濃度為0.1 mg/mL)可降低腎交感神經(jīng)活性，據(jù)此，脂聯(lián)素的濃度選擇為0.1 mg/mL。

ARGP=右前神經(jīng)節(jié)叢；RA=右房；RV=右室；SVC=上腔靜脈；IVC=下腔靜脈

圖1比格犬心臟右前神經(jīng)節(jié)叢(ARGP)解剖學(xué)位置

1.3ARGP功能測(cè)定 ARGP功能定義為遞增式電壓高頻電刺激(HFS，20 Hz，脈寬0.1 ms)ARGP時(shí)引起竇性心率(SR)下降的程度[8]。經(jīng)右側(cè)第五肋間開(kāi)胸暴露ARGP后，將直徑0.1 mm的銀絲電極插入ARGP脂肪墊，連接Grass刺激儀(AstroMed， West Warwick，美國(guó))給予高頻電刺激，刺激電壓依次分別為2 V、3 V、4 V，通過(guò)電刺激確定ARGP最敏感部位，記錄相同部位下不同電壓刺激前后SR數(shù)值，并計(jì)算不同電壓下ARGP刺激引起SR下降的百分比，繪制SR-電壓反應(yīng)曲線以反映ARGP功能。

1.4ARGP活性記錄與測(cè)定 將2根直徑0.1 mm的鎢絲微電極用微型固定器并列固定，尖端插入ARGP脂肪墊以記錄ARGP神經(jīng)元放電。電極連接PowerLab神經(jīng)活性記錄儀(AD Instruments，澳大利亞)，調(diào)整參數(shù)后記錄穩(wěn)定的神經(jīng)元放電信號(hào)。神經(jīng)活性信號(hào)定義為高于噪音振幅3倍及以上的神經(jīng)元放電信號(hào)。在基礎(chǔ)狀態(tài)和注射生理鹽水或脂聯(lián)素20 min后，記錄1 min神經(jīng)元放電信號(hào)，并用LabChart軟件分析神經(jīng)元放電頻率和振幅。

1.5免疫熒光染色 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，留取各組的ARGP組織標(biāo)本，4%多聚甲醛固定，行石蠟包埋、切片并染色。采用蘇木精-伊紅染色(HE染色)法觀察GP組織的顯微結(jié)構(gòu)，并對(duì)GP神經(jīng)元進(jìn)一步行免疫熒光染色以明確脂聯(lián)素受體的表達(dá)情況。其中，抗脂聯(lián)素受體 1和抗脂聯(lián)素受體2(Abcam公司，劍橋，英國(guó))分別用于單染脂聯(lián)素受體1和脂聯(lián)素受體2。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，運(yùn)用GraphPad Prism 7.0軟件進(jìn)行分析與作圖，先對(duì)所有計(jì)量數(shù)據(jù)進(jìn)行Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)以明確是否符合正態(tài)分布。同組自身前后比較用配對(duì)t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中12只比格犬生命體征穩(wěn)定，指標(biāo)測(cè)定順利。

2.1脂聯(lián)素受體在ARGP神經(jīng)元上的表達(dá)情況 免疫熒光染色可見(jiàn)脂聯(lián)素受體1和脂聯(lián)素受體2在ARGP神經(jīng)元上均有表達(dá)，見(jiàn)圖2。

2.2脂聯(lián)素對(duì)ARGP功能的影響 與基礎(chǔ)狀態(tài)相比，實(shí)驗(yàn)組給予脂聯(lián)素后各電壓下HFS刺激ARGP誘導(dǎo)的SR減慢作用降低，見(jiàn)表1，根據(jù)刺激前后SR變化繪制SR-電壓反應(yīng)曲線。實(shí)驗(yàn)組給予脂聯(lián)素可抑制曲線中各電壓刺激下的SR降低程度。以電壓強(qiáng)度為3V為例，基礎(chǔ)狀態(tài)下SR降低(43.3±5.1)%，給予脂聯(lián)素后SR降低(30.9±5.1)%(與基礎(chǔ)狀態(tài)相比,P=0.02)。對(duì)照組給予生理鹽水后對(duì)SR-電壓反應(yīng)曲線無(wú)明顯影響，見(jiàn)圖3。

A:脂聯(lián)素受體1表達(dá)在GP神經(jīng)元；B:脂聯(lián)素受體2表達(dá)在ARGP神經(jīng)元

表1 兩組干預(yù)前后心率變化/(次/分)

A:對(duì)照組ARGP的SR-電壓反應(yīng)曲線；B:實(shí)驗(yàn)組ARGP的SR-電壓反應(yīng)曲線。與基礎(chǔ)狀態(tài)相比，*P<0.05

2.3脂聯(lián)素對(duì)ARGP神經(jīng)活性的影響 與基礎(chǔ)狀態(tài)相比，實(shí)驗(yàn)組中給予脂聯(lián)素后GP神經(jīng)元放電頻率和振幅均降低(P均<0.05)，而對(duì)照組干預(yù)前后ARGP神經(jīng)活性無(wú)顯著差異(P均>0.05)?；A(chǔ)狀態(tài)時(shí)，兩組神經(jīng)元放電頻率和振幅無(wú)明顯差異(P均>0.05)，給予脂聯(lián)素干預(yù)后，實(shí)驗(yàn)組神經(jīng)元放電頻率和振幅較對(duì)照組降低(P均<0.05)，見(jiàn)圖4、表2。

圖4 兩組分別給予生理鹽水和脂聯(lián)素干預(yù)后的典型神經(jīng)元放電情況

表2 兩組干預(yù)前后神經(jīng)元放電頻率和振幅變化

注:與同組基礎(chǔ)狀態(tài)比較，*P<0.05；與對(duì)照組生理鹽水狀態(tài)時(shí)比較，#P<0.05

3 討論

Scherer等[9]于1995年首次發(fā)現(xiàn)脂聯(lián)素，并證實(shí)其主要由脂肪細(xì)胞分泌，可參與胰島素調(diào)節(jié)，發(fā)揮代謝調(diào)控作用；亦具有抗動(dòng)脈粥樣硬化、保護(hù)血管內(nèi)皮，抗心肌缺血再灌注損傷、抗心肌纖維化等多種心臟保護(hù)作用[4]。臨床研究顯示血清脂聯(lián)素水平降低與房顫的發(fā)生密切相關(guān)[10]，且心外膜脂肪組織含量與房顫的發(fā)生呈正相關(guān)[3]，提示脂肪組織和脂聯(lián)素可能參與房顫的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程。Hansen等[11]發(fā)現(xiàn)體內(nèi)高脂聯(lián)素水平對(duì)糖尿病患者心率變異性改變有益。本研究中，筆者發(fā)現(xiàn)脂聯(lián)素局部注射至ARGP可降低ARGP功能和神經(jīng)元放電頻率及振幅，表明脂聯(lián)素可在局部發(fā)揮作用，抑制心臟自主神經(jīng)系統(tǒng)。既往研究顯示心臟自主神經(jīng)激活在房顫的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，自主神經(jīng)激活可通過(guò)縮短動(dòng)作電位時(shí)程(APD)和細(xì)胞內(nèi)鈣(Cai)瞬變，引起早后除極(EAD)和觸發(fā)活動(dòng)，增加房顫的誘發(fā)率[1]。而脂聯(lián)素可通過(guò)FoxO1信號(hào)降低小鼠交感神經(jīng)系統(tǒng)活性，拮抗瘦素所致的交感激活，調(diào)節(jié)骨代謝與能量代謝[6]。在細(xì)胞水平，脂聯(lián)素能通過(guò)鉀電流的差異性調(diào)控進(jìn)而調(diào)節(jié)大鼠自主神經(jīng)中樞室旁核神經(jīng)元的興奮性[12]。本研究中，筆者通過(guò)免疫熒光證實(shí)脂聯(lián)素受體在GP神經(jīng)元上存在表達(dá)，因此推測(cè)脂聯(lián)素發(fā)揮作用的機(jī)制可能為脂聯(lián)素通過(guò)其受體及下游信號(hào)通路調(diào)控GP活性，也有可能直接作用于GP神經(jīng)元上的離子通道，對(duì)神經(jīng)元興奮性進(jìn)行直接調(diào)節(jié)，進(jìn)而抑制心臟自主神經(jīng)系統(tǒng)。

本研究顯示了脂聯(lián)素局部干預(yù)可抑制心臟自主神經(jīng)，表明其可能具有抗房顫作用。既往研究顯示口服脂聯(lián)素受體激動(dòng)劑(AdipoRon)可改善糖脂代謝水平，提示補(bǔ)充脂聯(lián)素，如運(yùn)動(dòng)、噻唑烷二酮類(lèi)降糖藥[13]或激活脂聯(lián)素受體可能降低房顫發(fā)生率，改善房顫患者預(yù)后。近年來(lái)Tanabe等[14]已研究出人類(lèi)脂聯(lián)素受體的晶體結(jié)構(gòu)，據(jù)此結(jié)構(gòu)，我們有望研發(fā)出相應(yīng)的藥物，為房顫治療帶來(lái)新選擇。