(1.陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎科，重慶 400038；2.重慶醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院泌尿腎病中心，重慶 401330；3.陸軍軍醫(yī)大學(xué)免疫學(xué)教研室，重慶400038)

腎細(xì)胞癌簡稱腎癌，主要起源于腎小管上皮細(xì)胞，是泌尿系腫瘤中僅次于膀胱癌的第二大惡性腫瘤[1-2]。流行病學(xué)資料顯示，在全球范圍內(nèi)，其發(fā)病率和病死率近年來呈快速上升趨勢，嚴(yán)重危害人類的身心健康[3-4]。腎癌最主要的病理類型為腎透明細(xì)胞癌(clear cell renal cell carcinoma,ccRCC)，占全部腎癌的80%～90%[5]。腎癌對放化療均不敏感，對于早期及局部進展期腎癌，目前首選治療方法為外科手術(shù)，但術(shù)后復(fù)發(fā)率高，且有30%左右的患者會出現(xiàn)遠(yuǎn)處臟器轉(zhuǎn)移；對于晚期腎癌，如今仍缺乏有效的治療手段[6-7]。因此，進一步探索關(guān)于腎癌的生物標(biāo)志物及治療靶點日趨緊迫。

線粒體核糖體由一個28S小亞基和一個39S大亞基組成，是線粒體DNA(mtDNA)編碼的mRNA翻譯場所，負(fù)責(zé)線粒體電子傳遞鏈上部分蛋白的翻譯，與細(xì)胞能量代謝密切相關(guān)[8]。近期研究發(fā)現(xiàn)，線粒體核糖體蛋白S5(mitochondrial ribosomal protein S5,MRPS5)作為28S小亞基的成員，在肝癌、甲狀腺癌、膀胱癌腫瘤組織中通過異常表達的方式調(diào)控腫瘤細(xì)胞生物學(xué)功能,進而影響腫瘤發(fā)生發(fā)展[9-11]。盡管前期研究已經(jīng)證實MRPS5與上述腫瘤密切相關(guān)，可能是腫瘤調(diào)控的重要分子，但是其在腎癌中的作用國內(nèi)外均未見報道。因此，本研究通過檢測MRPS5在腎癌最主要的病理類型ccRCC中的表達，探討其是否與ccRCC發(fā)生發(fā)展相關(guān)，以及是否有望作為判斷預(yù)后的生物標(biāo)志物和腫瘤靶向治療的新靶點。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

收集2007年1月至2012年10月陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理確診為ccRCC的104例患者的石蠟包埋癌組織標(biāo)本。其中男70例，女34例；年齡26～86歲，平均(53.64±13.41)歲；左側(cè)腎癌53例，右側(cè)腎癌51例；參照2010年AJCC腎癌分期標(biāo)準(zhǔn)[12]，TNM臨床分期：Ⅰ～Ⅱ期95例，Ⅲ～Ⅳ期9例；Fuhrman分級:Ⅰ～Ⅱ級86例，Ⅲ～Ⅳ級18例。隨訪11～124個月，平均(81.17±22.07)個月，失訪4例，隨訪率為96%。總生存期(overall survival,OS)為術(shù)后確診至死亡的時間。無病生存期(disease free survival,DFS)為術(shù)后確診至死亡、腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的時間。收集2018年4～8月陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院經(jīng)病理確診為ccRCC的新鮮癌組織和癌旁正常組織(距離腫瘤邊緣2 cm以上)標(biāo)本8對，將標(biāo)本一分為二，一部分液氮罐保存，另一部分甲醛固定并石蠟包埋。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：①既往無其他重大疾病或惡性腫瘤病史；②術(shù)前尚未發(fā)現(xiàn)其他臟器轉(zhuǎn)移；③手術(shù)方式為根治性腎切除術(shù)或部分腎切除術(shù)，局部病灶完整切除；④經(jīng)病理證實均為ccRCC。排除標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)前接受過其他非手術(shù)治療，如放化療、生物治療、分子靶向治療等；②混合兩種及兩種以上病理類型的腎癌；③腫瘤組織內(nèi)部出現(xiàn)大面積壞死。本研究通過陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 免疫組織化學(xué)實驗

先對8對新鮮癌組織和癌旁正常組織進行切片，再對104例石蠟包埋癌組織標(biāo)本進行切片，均制備4 μm石蠟切片，經(jīng)過二甲苯脫蠟，乙醇水化，EDTA緩沖液微波修復(fù)，3% H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶，5%BSA室溫下封閉1 h，滴加兔抗人MRPS5單克隆抗體(美國origene,1∶200)并4 ℃孵育過夜，辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗(北京中杉金橋，1∶800)室溫孵育1 h，DAB顯色，蘇木紫染核，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。

1.3 免疫印跡實驗

8對新鮮癌組織及癌旁正常組織,每塊組織取30 mg，加入300 μL蛋白裂解液，研缽中研磨至勻漿，12 000 r/min 4 ℃離心15 min后取上清，檢測蛋白濃度，后加入5×Loading buffer，沸水煮15 min，加入等量蛋白至聚丙烯胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜，5%BSA封閉1 h，兔抗人MRPS5單克隆抗體(美國origene,1∶1 000)孵育過夜，辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗孵育，顯色、曝光后進行圖像分析。

1.4 免疫組織化學(xué)評分標(biāo)準(zhǔn)

請兩位經(jīng)驗豐富的病理科醫(yī)生獨立進行雙盲評分，取雙方評分的均值。每張切片在200倍的高倍鏡下隨機選擇10個視野。陽性著色強度：無染色記為0分，淡黃色記為1分，棕黃色記為2分，棕褐色記為3分。陽性細(xì)胞百分比：陽性細(xì)胞率≤5%記為0分，6%～25%記為1分，26%～50%記為2分，51%～75%記為3分，≥76%記為4分。陽性著色強度和陽性細(xì)胞百分比計分的乘積即為總評分，6分及以上為相對高表達，4分及以下為相對低表達。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。χ2檢驗分析MRPS5表達水平與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系。Kaplan-Meier法描繪生存曲線，Log-rank檢驗MRPS5表達水平與患者生存狀況的關(guān)系。采用Cox比例風(fēng)險回歸模型分析影響預(yù)后的臨床因素。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MRPS5在ccRCC癌和癌旁正常組織中的表達

利用新鮮癌組織及癌旁正常組織標(biāo)本進行實驗，免疫組織化學(xué)實驗結(jié)果顯示：MRPS5主要表達于腎小管及集合管上皮細(xì)胞，呈棕黃色或棕褐色顆粒狀。MRPS5在癌旁正常組織中可見廣泛大量的表達，而在癌組織中，其表達量較低(圖1a)。免疫印跡實驗結(jié)果與免疫組織化學(xué)實驗一致：與癌旁正常組織相比，MRPS5在癌組織中的表達水平明顯降低(圖1b)。

2.2 MRPS5表達水平與ccRCC患者臨床病理參數(shù)的相關(guān)性分析

為了進一步探索MRPS5在ccRCC中的臨床應(yīng)用價值，本研究對104例石蠟包埋ccRCC癌組織切片進行了免疫組織化學(xué)實驗并按照評分標(biāo)準(zhǔn)進行了評分,結(jié)果發(fā)現(xiàn)：高表達組64例(61.5%)，低表達組40例(38.5%)。統(tǒng)計學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，MRPS5相對表達水平與患者性別、年齡、腫瘤位置、大小、N分期、TNM臨床分期及Fuhrman分級等臨床病理參數(shù)無明顯相關(guān)性(P>0.05)，而與T分期及腫瘤壞死顯著相關(guān)(P<0.05)，見表1。

a:免疫組織化學(xué)檢測;b:免疫印跡檢測 T:癌組織;N:癌旁正常組織

表1 MRPS5表達水平與ccRCC患者臨床病理參數(shù)的相關(guān)性分析[例(%)]

臨床參數(shù)nMRPS5水平低表達高表達χ2P性別男7028(40.0)42(60.0)0.2140.644女3412(35.3)22(64.7)年齡≤55歲5620(35.7)36(64.3)0.3870.534>55歲4820(41.7)28(58.3)腫瘤位置左5320(37.7)33(62.3)0.0240.877右5120(39.2)31(60.8)長徑≤4cm5818(31.0)40(69.0)3.0560.080>4cm4622(47.8)24(52.2)T分期T1～T29734(35.1)63(64.9)5.1010.024T3～T40706(85.7)01(14.3)N分期N09938(38.4)61(61.6)0.0001.000N10502(40.0)03(60.0)TNM臨床分期Ⅰ～Ⅱ9534(35.8)61(64.2)2.1350.144Ⅲ～Ⅳ0906(66.7)03(33.3)Fuhrman分級Ⅰ～Ⅱ8630(34.9)56(65.1)2.6870.101Ⅲ～Ⅳ1810(55.6)08(44.4)腫瘤壞死無8127(33.3)54(66.7)4.0700.044有2313(56.5)10(43.5)

2.3 MRPS5表達水平與ccRCC患者生存狀況的相關(guān)性分析

采用Kaplan-Meier法對104例ccRCC患者的生存狀況進行分析，結(jié)果顯示：MRPS5高表達組平均OS為114.437個月，95%CI(109.978,118.897)；低表達組平均OS為105.518個月，95%CI(93.946,117.090)；MRPS5高表達組平均DFS為113.563個月，95%CI(108.352,118.773)，低表達組平均DFS為104.609個月，95%CI(92.393,116.825)。采用Log-rank檢驗比較不同患者生存狀況的差異，結(jié)果顯示，MRPS5高表達組的OS與低表達組存在顯著差異(P=0.022)；MRPS5高表達組的DFS與低表達組亦存在顯著差異(P=0.028)。因此，初步推斷MRPS5高表達組患者生存狀況優(yōu)于低表達組(圖2)。

圖2 Kaplan-Meier法描繪不同MRPS5水平患者的OS及DFS曲線

2.4 單因素及多因素Cox回歸分析

單因素Cox回歸分析發(fā)現(xiàn)，ccRCC患者OS和DFS均與腫瘤大小、T分期、N分期、TNM臨床分期、Fuhrman分級、腫瘤壞死及MRPS5表達水平等多種因素相關(guān)(P<0.05)，見表2。進一步進行多因素Cox回歸分析發(fā)現(xiàn)，患者OS和DFS均與N分期、Fuhrman分級、MRPS5表達水平因素相關(guān)(P<0.05)，見表3。N分期為N1(即有淋巴結(jié)侵犯)、Fuhrman分級越高及MRPS5表達水平越低的患者預(yù)后更差，MRPS5低表達是影響患者OS及DFS的獨立危險因素。

表2 單因素Cox回歸分析

表3 多因素Cox回歸分析

3 討論

線粒體核糖體蛋白是線粒體核糖體必不可缺少的組成部分，參與線粒體電子傳遞鏈上部分蛋白的翻譯，其結(jié)構(gòu)或功能異常會引起線粒體氧化磷酸化效率降低，導(dǎo)致不同程度的能量代謝障礙，有些甚至?xí)咕€粒體不能維持基本的能量代謝而引起致死性疾病[13]。越來越多的證據(jù)表明線粒體核糖體蛋白在細(xì)胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、機體抗衰老和細(xì)胞增殖調(diào)控方面發(fā)揮著重要作用[14-15]。

MRPS5是線粒體核糖體28S小亞基的結(jié)構(gòu)蛋白，參與線粒體能量代謝功能的調(diào)節(jié)，與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。早期研究發(fā)現(xiàn)，其通過線粒體能量代謝障礙的途徑調(diào)控線蟲和小鼠壽命的同時可以調(diào)控腫瘤的生長，是一種長壽相關(guān)蛋白[16]。隨后也證實了其他長壽調(diào)控基因如Sir2、lin2、dct2、nnt-1等與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[17-19]。Wei等[9]的研究發(fā)現(xiàn)，MRPS5在肝癌中可以通過代謝重編程的方式來調(diào)控腫瘤干細(xì)胞的生長，其過表達可引起腫瘤細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致預(yù)后不良。劉啟梁等[11]的研究發(fā)現(xiàn)，MRPS5也可以調(diào)節(jié)膀胱癌細(xì)胞增殖能力，影響其干細(xì)胞干性特征，其過表達同樣提示預(yù)后不良。但Lee等[10]發(fā)現(xiàn)，在甲狀腺乳頭狀癌中，MRPS5在癌組織中呈低表達，在癌旁組織中呈高表達，低表達組的頸部淋巴結(jié)侵犯的風(fēng)險明顯高于高表達組，可以作為淋巴結(jié)侵犯的預(yù)測因子。與Lee等[10]的研究結(jié)果類似的是，本研究發(fā)現(xiàn)ccRCC癌組織MRPS5表達明顯低于癌旁正常組織，其在癌組織中表達水平與腫瘤T分期和腫瘤壞死這兩種臨床病理參數(shù)具有明顯相關(guān)性，且不同表達水平所對應(yīng)的臨床預(yù)后明顯不同，從生存曲線可以看出低表達組的OS和DFS均明顯短于高表達組。

此外，單因素回歸分析表明腫瘤大小、T分期、N分期、TNM臨床分期、Fuhrman分級、腫瘤壞死及MRPS5表達水平等是影響患者生存狀況的因素；多因素回歸分析顯示，除了MRPS5低表達外，N分期和高Fuhrman分級也是影響患者預(yù)后的獨立危險因素。張乾等[20]報道指出，發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腎癌患者即使行外科手術(shù)治療，術(shù)后復(fù)發(fā)率也會顯著增高。眾所周知，F(xiàn)uhrman分級是腎癌最常用的組織學(xué)分級，低級別(即Ⅰ～Ⅱ級)的患者往往預(yù)后更好，行保留腎單位的手術(shù)安全性更佳。Chen等[21]的研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)uhrman Ⅲ～Ⅳ級是腎癌患者5年復(fù)發(fā)的獨立預(yù)測因素。Mir等[22]的回顧性研究認(rèn)為，臨床醫(yī)生在決定早期腎癌是否行保留腎單位的部分切除術(shù)時，F(xiàn)uhrman分級是一個重要的參考因素，對最終的決策具有指導(dǎo)意義。所以，發(fā)生淋巴結(jié)侵犯、Fuhrman分級越高或MRPS5表達水平越低往往提示患者預(yù)后不良。

綜上所述，MRPS5在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要意義。本研究初步證實了在ccRCC中MRPS5的表達水平與多種臨床病理參數(shù)相關(guān)，不同表達組間的預(yù)后差異顯著，低表達的患者預(yù)后明顯不良，MRPS5低表達是影響患者預(yù)后的獨立危險因素，有望成為判斷ccRCC預(yù)后的生物標(biāo)志及研發(fā)治療藥物的新靶點。然而目前其在ccRCC中發(fā)揮作用的分子機制尚不清楚，這需要后續(xù)進一步研究探討。