(1.陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎科，重慶 400038；2.重慶醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院泌尿腎病中心，重慶 401330；3.陸軍軍醫(yī)大學(xué)免疫學(xué)教研室，重慶400038)

腎細(xì)胞癌簡(jiǎn)稱腎癌，主要起源于腎小管上皮細(xì)胞，是泌尿系腫瘤中僅次于膀胱癌的第二大惡性腫瘤[1-2]。流行病學(xué)資料顯示，在全球范圍內(nèi)，其發(fā)病率和病死率近年來(lái)呈快速上升趨勢(shì)，嚴(yán)重危害人類的身心健康[3-4]。腎癌最主要的病理類型為腎透明細(xì)胞癌(clear cell renal cell carcinoma,ccRCC)，占全部腎癌的80%～90%[5]。腎癌對(duì)放化療均不敏感，對(duì)于早期及局部進(jìn)展期腎癌，目前首選治療方法為外科手術(shù)，但術(shù)后復(fù)發(fā)率高，且有30%左右的患者會(huì)出現(xiàn)遠(yuǎn)處臟器轉(zhuǎn)移；對(duì)于晚期腎癌，如今仍缺乏有效的治療手段[6-7]。因此，進(jìn)一步探索關(guān)于腎癌的生物標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)日趨緊迫。

線粒體核糖體由一個(gè)28S小亞基和一個(gè)39S大亞基組成，是線粒體DNA(mtDNA)編碼的mRNA翻譯場(chǎng)所，負(fù)責(zé)線粒體電子傳遞鏈上部分蛋白的翻譯，與細(xì)胞能量代謝密切相關(guān)[8]。近期研究發(fā)現(xiàn)，線粒體核糖體蛋白S5(mitochondrial ribosomal protein S5,MRPS5)作為28S小亞基的成員，在肝癌、甲狀腺癌、膀胱癌腫瘤組織中通過(guò)異常表達(dá)的方式調(diào)控腫瘤細(xì)胞生物學(xué)功能,進(jìn)而影響腫瘤發(fā)生發(fā)展[9-11]。盡管前期研究已經(jīng)證實(shí)MRPS5與上述腫瘤密切相關(guān)，可能是腫瘤調(diào)控的重要分子，但是其在腎癌中的作用國(guó)內(nèi)外均未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究通過(guò)檢測(cè)MRPS5在腎癌最主要的病理類型ccRCC中的表達(dá)，探討其是否與ccRCC發(fā)生發(fā)展相關(guān)，以及是否有望作為判斷預(yù)后的生物標(biāo)志物和腫瘤靶向治療的新靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

收集2007年1月至2012年10月陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理確診為ccRCC的104例患者的石蠟包埋癌組織標(biāo)本。其中男70例，女34例；年齡26～86歲，平均(53.64±13.41)歲；左側(cè)腎癌53例，右側(cè)腎癌51例；參照2010年AJCC腎癌分期標(biāo)準(zhǔn)[12]，TNM臨床分期：Ⅰ～Ⅱ期95例，Ⅲ～Ⅳ期9例；Fuhrman分級(jí):Ⅰ～Ⅱ級(jí)86例，Ⅲ～Ⅳ級(jí)18例。隨訪11～124個(gè)月，平均(81.17±22.07)個(gè)月，失訪4例，隨訪率為96%?？偵嫫?overall survival,OS)為術(shù)后確診至死亡的時(shí)間。無(wú)病生存期(disease free survival,DFS)為術(shù)后確診至死亡、腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的時(shí)間。收集2018年4～8月陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院經(jīng)病理確診為ccRCC的新鮮癌組織和癌旁正常組織(距離腫瘤邊緣2 cm以上)標(biāo)本8對(duì)，將標(biāo)本一分為二，一部分液氮罐保存，另一部分甲醛固定并石蠟包埋。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：①既往無(wú)其他重大疾病或惡性腫瘤病史；②術(shù)前尚未發(fā)現(xiàn)其他臟器轉(zhuǎn)移；③手術(shù)方式為根治性腎切除術(shù)或部分腎切除術(shù)，局部病灶完整切除；④經(jīng)病理證實(shí)均為ccRCC。排除標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)前接受過(guò)其他非手術(shù)治療，如放化療、生物治療、分子靶向治療等；②混合兩種及兩種以上病理類型的腎癌；③腫瘤組織內(nèi)部出現(xiàn)大面積壞死。本研究通過(guò)陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)

先對(duì)8對(duì)新鮮癌組織和癌旁正常組織進(jìn)行切片，再對(duì)104例石蠟包埋癌組織標(biāo)本進(jìn)行切片，均制備4 μm石蠟切片，經(jīng)過(guò)二甲苯脫蠟，乙醇水化，EDTA緩沖液微波修復(fù)，3% H2O2滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，5%BSA室溫下封閉1 h，滴加兔抗人MRPS5單克隆抗體(美國(guó)origene,1∶200)并4 ℃孵育過(guò)夜，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗(北京中杉金橋，1∶800)室溫孵育1 h，DAB顯色，蘇木紫染核，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)脂封片。

1.3 免疫印跡實(shí)驗(yàn)

8對(duì)新鮮癌組織及癌旁正常組織,每塊組織取30 mg，加入300 μL蛋白裂解液，研缽中研磨至勻漿，12 000 r/min 4 ℃離心15 min后取上清，檢測(cè)蛋白濃度，后加入5×Loading buffer，沸水煮15 min，加入等量蛋白至聚丙烯胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜，5%BSA封閉1 h，兔抗人MRPS5單克隆抗體(美國(guó)origene,1∶1 000)孵育過(guò)夜，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗孵育，顯色、曝光后進(jìn)行圖像分析。

1.4 免疫組織化學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

請(qǐng)兩位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)生獨(dú)立進(jìn)行雙盲評(píng)分，取雙方評(píng)分的均值。每張切片在200倍的高倍鏡下隨機(jī)選擇10個(gè)視野。陽(yáng)性著色強(qiáng)度：無(wú)染色記為0分，淡黃色記為1分，棕黃色記為2分，棕褐色記為3分。陽(yáng)性細(xì)胞百分比：陽(yáng)性細(xì)胞率≤5%記為0分，6%～25%記為1分，26%～50%記為2分，51%～75%記為3分，≥76%記為4分。陽(yáng)性著色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞百分比計(jì)分的乘積即為總評(píng)分，6分及以上為相對(duì)高表達(dá)，4分及以下為相對(duì)低表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。χ2檢驗(yàn)分析MRPS5表達(dá)水平與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系。Kaplan-Meier法描繪生存曲線，Log-rank檢驗(yàn)MRPS5表達(dá)水平與患者生存狀況的關(guān)系。采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析影響預(yù)后的臨床因素。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MRPS5在ccRCC癌和癌旁正常組織中的表達(dá)

利用新鮮癌組織及癌旁正常組織標(biāo)本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：MRPS5主要表達(dá)于腎小管及集合管上皮細(xì)胞，呈棕黃色或棕褐色顆粒狀。MRPS5在癌旁正常組織中可見(jiàn)廣泛大量的表達(dá)，而在癌組織中，其表達(dá)量較低(圖1a)。免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果與免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)一致：與癌旁正常組織相比，MRPS5在癌組織中的表達(dá)水平明顯降低(圖1b)。

2.2 MRPS5表達(dá)水平與ccRCC患者臨床病理參數(shù)的相關(guān)性分析

為了進(jìn)一步探索MRPS5在ccRCC中的臨床應(yīng)用價(jià)值，本研究對(duì)104例石蠟包埋ccRCC癌組織切片進(jìn)行了免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)并按照評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了評(píng)分,結(jié)果發(fā)現(xiàn)：高表達(dá)組64例(61.5%)，低表達(dá)組40例(38.5%)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，MRPS5相對(duì)表達(dá)水平與患者性別、年齡、腫瘤位置、大小、N分期、TNM臨床分期及Fuhrman分級(jí)等臨床病理參數(shù)無(wú)明顯相關(guān)性(P>0.05)，而與T分期及腫瘤壞死顯著相關(guān)(P<0.05)，見(jiàn)表1。

a:免疫組織化學(xué)檢測(cè);b:免疫印跡檢測(cè) T:癌組織;N:癌旁正常組織

表1 MRPS5表達(dá)水平與ccRCC患者臨床病理參數(shù)的相關(guān)性分析[例(%)]

臨床參數(shù)nMRPS5水平低表達(dá)高表達(dá)χ2P性別男7028(40.0)42(60.0)0.2140.644女3412(35.3)22(64.7)年齡≤55歲5620(35.7)36(64.3)0.3870.534>55歲4820(41.7)28(58.3)腫瘤位置左5320(37.7)33(62.3)0.0240.877右5120(39.2)31(60.8)長(zhǎng)徑≤4cm5818(31.0)40(69.0)3.0560.080>4cm4622(47.8)24(52.2)T分期T1～T29734(35.1)63(64.9)5.1010.024T3～T40706(85.7)01(14.3)N分期N09938(38.4)61(61.6)0.0001.000N10502(40.0)03(60.0)TNM臨床分期Ⅰ～Ⅱ9534(35.8)61(64.2)2.1350.144Ⅲ～Ⅳ0906(66.7)03(33.3)Fuhrman分級(jí)Ⅰ～Ⅱ8630(34.9)56(65.1)2.6870.101Ⅲ～Ⅳ1810(55.6)08(44.4)腫瘤壞死無(wú)8127(33.3)54(66.7)4.0700.044有2313(56.5)10(43.5)

2.3 MRPS5表達(dá)水平與ccRCC患者生存狀況的相關(guān)性分析

采用Kaplan-Meier法對(duì)104例ccRCC患者的生存狀況進(jìn)行分析，結(jié)果顯示：MRPS5高表達(dá)組平均OS為114.437個(gè)月，95%CI(109.978,118.897)；低表達(dá)組平均OS為105.518個(gè)月，95%CI(93.946,117.090)；MRPS5高表達(dá)組平均DFS為113.563個(gè)月，95%CI(108.352,118.773)，低表達(dá)組平均DFS為104.609個(gè)月，95%CI(92.393,116.825)。采用Log-rank檢驗(yàn)比較不同患者生存狀況的差異，結(jié)果顯示，MRPS5高表達(dá)組的OS與低表達(dá)組存在顯著差異(P=0.022)；MRPS5高表達(dá)組的DFS與低表達(dá)組亦存在顯著差異(P=0.028)。因此，初步推斷MRPS5高表達(dá)組患者生存狀況優(yōu)于低表達(dá)組(圖2)。

圖2 Kaplan-Meier法描繪不同MRPS5水平患者的OS及DFS曲線

2.4 單因素及多因素Cox回歸分析

單因素Cox回歸分析發(fā)現(xiàn)，ccRCC患者OS和DFS均與腫瘤大小、T分期、N分期、TNM臨床分期、Fuhrman分級(jí)、腫瘤壞死及MRPS5表達(dá)水平等多種因素相關(guān)(P<0.05)，見(jiàn)表2。進(jìn)一步進(jìn)行多因素Cox回歸分析發(fā)現(xiàn)，患者OS和DFS均與N分期、Fuhrman分級(jí)、MRPS5表達(dá)水平因素相關(guān)(P<0.05)，見(jiàn)表3。N分期為N1(即有淋巴結(jié)侵犯)、Fuhrman分級(jí)越高及MRPS5表達(dá)水平越低的患者預(yù)后更差，MRPS5低表達(dá)是影響患者OS及DFS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

表2 單因素Cox回歸分析

表3 多因素Cox回歸分析

3 討論

線粒體核糖體蛋白是線粒體核糖體必不可缺少的組成部分，參與線粒體電子傳遞鏈上部分蛋白的翻譯，其結(jié)構(gòu)或功能異常會(huì)引起線粒體氧化磷酸化效率降低，導(dǎo)致不同程度的能量代謝障礙，有些甚至?xí)咕€粒體不能維持基本的能量代謝而引起致死性疾病[13]。越來(lái)越多的證據(jù)表明線粒體核糖體蛋白在細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、機(jī)體抗衰老和細(xì)胞增殖調(diào)控方面發(fā)揮著重要作用[14-15]。

MRPS5是線粒體核糖體28S小亞基的結(jié)構(gòu)蛋白，參與線粒體能量代謝功能的調(diào)節(jié)，與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。早期研究發(fā)現(xiàn)，其通過(guò)線粒體能量代謝障礙的途徑調(diào)控線蟲(chóng)和小鼠壽命的同時(shí)可以調(diào)控腫瘤的生長(zhǎng)，是一種長(zhǎng)壽相關(guān)蛋白[16]。隨后也證實(shí)了其他長(zhǎng)壽調(diào)控基因如Sir2、lin2、dct2、nnt-1等與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[17-19]。Wei等[9]的研究發(fā)現(xiàn)，MRPS5在肝癌中可以通過(guò)代謝重編程的方式來(lái)調(diào)控腫瘤干細(xì)胞的生長(zhǎng)，其過(guò)表達(dá)可引起腫瘤細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致預(yù)后不良。劉啟梁等[11]的研究發(fā)現(xiàn)，MRPS5也可以調(diào)節(jié)膀胱癌細(xì)胞增殖能力，影響其干細(xì)胞干性特征，其過(guò)表達(dá)同樣提示預(yù)后不良。但Lee等[10]發(fā)現(xiàn)，在甲狀腺乳頭狀癌中，MRPS5在癌組織中呈低表達(dá)，在癌旁組織中呈高表達(dá)，低表達(dá)組的頸部淋巴結(jié)侵犯的風(fēng)險(xiǎn)明顯高于高表達(dá)組，可以作為淋巴結(jié)侵犯的預(yù)測(cè)因子。與Lee等[10]的研究結(jié)果類似的是，本研究發(fā)現(xiàn)ccRCC癌組織MRPS5表達(dá)明顯低于癌旁正常組織，其在癌組織中表達(dá)水平與腫瘤T分期和腫瘤壞死這兩種臨床病理參數(shù)具有明顯相關(guān)性，且不同表達(dá)水平所對(duì)應(yīng)的臨床預(yù)后明顯不同，從生存曲線可以看出低表達(dá)組的OS和DFS均明顯短于高表達(dá)組。

此外，單因素回歸分析表明腫瘤大小、T分期、N分期、TNM臨床分期、Fuhrman分級(jí)、腫瘤壞死及MRPS5表達(dá)水平等是影響患者生存狀況的因素；多因素回歸分析顯示，除了MRPS5低表達(dá)外，N分期和高Fuhrman分級(jí)也是影響患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。張乾等[20]報(bào)道指出，發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腎癌患者即使行外科手術(shù)治療，術(shù)后復(fù)發(fā)率也會(huì)顯著增高。眾所周知，F(xiàn)uhrman分級(jí)是腎癌最常用的組織學(xué)分級(jí)，低級(jí)別(即Ⅰ～Ⅱ級(jí))的患者往往預(yù)后更好，行保留腎單位的手術(shù)安全性更佳。Chen等[21]的研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)uhrman Ⅲ～Ⅳ級(jí)是腎癌患者5年復(fù)發(fā)的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素。Mir等[22]的回顧性研究認(rèn)為，臨床醫(yī)生在決定早期腎癌是否行保留腎單位的部分切除術(shù)時(shí)，F(xiàn)uhrman分級(jí)是一個(gè)重要的參考因素，對(duì)最終的決策具有指導(dǎo)意義。所以，發(fā)生淋巴結(jié)侵犯、Fuhrman分級(jí)越高或MRPS5表達(dá)水平越低往往提示患者預(yù)后不良。

綜上所述，MRPS5在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要意義。本研究初步證實(shí)了在ccRCC中MRPS5的表達(dá)水平與多種臨床病理參數(shù)相關(guān)，不同表達(dá)組間的預(yù)后差異顯著，低表達(dá)的患者預(yù)后明顯不良，MRPS5低表達(dá)是影響患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，有望成為判斷ccRCC預(yù)后的生物標(biāo)志及研發(fā)治療藥物的新靶點(diǎn)。然而目前其在ccRCC中發(fā)揮作用的分子機(jī)制尚不清楚，這需要后續(xù)進(jìn)一步研究探討。