甯 媛，段 琛，常瓊瓊，侯曉暉

(遵義醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院，貴州遵義 563000)

吸血蠓(Blood-sucking midges)是一類可刺吸動物血液的蠓科昆蟲，其中部分種類還可傳播蟲媒病原體帶來極大的危害。全世界蠓科昆蟲中僅有4屬蠓類屬吸血蠓，即庫蠓屬Culicoides、蠛蠓屬Lasiohelea、細蠓屬Leptoconops和澳蠓屬Austroconops，共1 671種(Borkent，2016)，中國僅分布3屬(澳蠓屬除外)共443種(常瓊瓊等，2017)。庫蠓屬Culicoides是蠓科Ceratopogonidae中最大的一個屬，其中很多種類可吸食人畜血液并傳播人畜疾病，是一類重要的媒介昆蟲(Kaliontzopoulouetal., 2007; Hoffmannetal., 2009; 王飛鵬等，2010；張海林等，2012；Carpenteretal., 2013)。迄今為止，由媒介蠓蟲傳播的藍舌病多次在歐洲等地爆發(fā)流行，帶來巨大的經(jīng)濟損失，媒介蠓蟲也因此成為近年來國內(nèi)外研究的熱點。由于庫蠓體型微小、種類繁多，傳統(tǒng)分類方法在實際工作中存在諸多困難，故需要開發(fā)更多的新技術、新方法實現(xiàn)蠓蟲快速、準確的分類鑒定。

幾何形態(tài)學是基于笛卡爾坐標對形狀特征進行定量描述和分析的統(tǒng)計分析方法，能準確直觀地解釋不同生物體種內(nèi)與種間微小的形狀差異(Kaliontzopoulouetal., 2007)。有學者發(fā)現(xiàn)昆蟲的翅不僅容易測量，而且不易發(fā)生形變，認為其特別適合進行生物測量學研究(Dujardinetal., 2003)。因此，幾何形態(tài)學已被應用于包括蠓科昆蟲在內(nèi)的諸多昆蟲類群的分類研究(Gurgel-Gon?alvesetal., 2011; Muoz-Muozetal., 2011, 2014, 2016; Deblauweetal., 2012; Fernández-Montravetaetal., 2017)。本研究以庫蠓亞屬中 6個近似種(漸灰?guī)祗稢ulicoidesgrisescens、光胸庫蠓Culicoidesimpunctatus、日本庫蠓Culicoidesnipponensis、灰黑庫蠓Culicoidespulicaris、刺螫庫蠓Culicoidespunctatus、天祥庫蠓Culicoidestienhsiangensis)為研究對象，運用地標點法定量對庫蠓翅的形態(tài)變化規(guī)律進行分析，以期對庫蠓近似種進行準確的分類鑒定和親緣關系分析。

1 材料與方法

1.1 材料

研究選取翅面完整無褶皺的6種庫蠓標本共24張，將所有樣本進行編號，相關信息見表1。

表1 本研究所用標本信息

1.2 圖片采集及標準化處理

首先，將玻片置于裝有Canon DS 126371照相機的Leica DM2500顯微鏡上，采集翅圖像，并保存圖片為JPG格式。然后，使用TPSdig 2軟件對每種庫蠓的翅選擇翅脈穩(wěn)定的交叉點或轉(zhuǎn)折點進行數(shù)字化標點(Landmark)，共標記12個點(圖1)，所得數(shù)據(jù)輸出為TPS文件。再使用tpsSmall軟件對形態(tài)原始數(shù)據(jù)集內(nèi)部相關性進行檢驗，并使用廣義普氏分析法(Generalized procrustes analysis, GPA)將地標點輪廓疊加，并使地標點離差最小化，在同一坐標體系中剔除形態(tài)信息分析中非形態(tài)因素的影響。

圖1 翅的12個地標點及翅脈(以漸灰?guī)祗稢ulicoides grisescens為例)Fig.1 Distribution of twelve landmarks and veins on wing of Culicoides grisescens注：Arc, 弓脈; M, 中脈; R, 徑脈; R-M, 徑中橫脈; Cu, 肘脈; r1,徑1室; r2,徑2室。Note: Arc, Arculus; M, Medial; R, Radial; R-M, Radial-median crossvein; Cu, Cubital; r1, First radia; r2, Second radia.

1.3 翅形變化分析

使用Morpho J軟件，利用主成分分析(Principal component analysis, PCA)和典型變量分析(Canonical variate analysis, CVA)方法，對蠓蟲翅的幾何形態(tài)學數(shù)據(jù)進行分析。在PCA的基礎上，進行了CVA，相關結(jié)果以馬氏距離(Mahalanobis distance)來展現(xiàn)，并運用tps-Super 32軟件計算種內(nèi)平均形態(tài)，tps-Small 1.20軟件計算樣本間普氏距離，通過NTsys 2.10e軟件運用非加權(quán)組平均法(unweighted pair-group method with arithmetic means, UPGMA)分析普氏距離矩陣，創(chuàng)建表型樹對庫蠓亞屬6種庫蠓的數(shù)據(jù)進行聚類分析，進而探討種間親緣關系。

2 結(jié)果與分析

2.1 翅的形態(tài)變異

使用Morpho J對6種庫蠓進行CVA分析，獲得種間翅形變化情況。由CVA散點圖(圖2)可知，同一種庫蠓很好的聚在一起，不同庫蠓之間距離相隔甚遠并無交叉。同時，通過種間馬氏距離及其P值比較表(表2)可知，6種庫蠓的翅有顯著差異，具有統(tǒng)計學意義(P﹤0.05)，其中天祥庫蠓和日本庫蠓的馬氏距離最大(49.7521)，表明6種庫蠓中兩者的翅形變化最大，而光胸庫蠓和漸灰?guī)祗返鸟R氏距離最小(8.7819)，表明6種庫蠓中兩者的翅形變化最小。

圖2 6種庫蠓翅形狀典型變量分析散點圖Fig.2 Scatter plots of Canonical variate analysis of six Culicoides

2.2 聚類分析

利用獲得的6種庫蠓翅形態(tài)變化平均數(shù)據(jù)計算種間翅形的普氏距離，然后根據(jù)普氏距離矩陣進行聚類分析建立近似種間表型樹，比較6種庫蠓間的親緣關系。由圖3可知，該表型樹中日本庫蠓首先與其余5種庫蠓分開，之后刺螫庫蠓、天祥庫蠓以及灰黑庫蠓先后從5種庫蠓的大支中分出，而光胸庫蠓和漸灰?guī)祗穭t聚為1支。因此，在上述6種間日本庫蠓與其余5種的親緣關系最遠，而光胸庫蠓和漸灰?guī)祗返挠H緣關系最近。

表2 6種庫蠓翅間馬氏距離及其顯著性比較表(基于10 000次重復)

圖3 基于普氏距離對6種庫蠓的聚類分析Fig.3 Phenetic tree of the studied populations of six Culicoides wing based on the Procrustes distance

3 討論與結(jié)論

吸血蠓作為一類具有重要經(jīng)濟意義的媒介昆蟲，由于其體型微小、形態(tài)相似，較難區(qū)分，并且實際工作中尚存在標本殘缺或者數(shù)量不足的情況，甚至還可能受鑒定者的經(jīng)驗、主觀因素等影響，導致應用傳統(tǒng)分類方法在實際鑒定過程中有一定難度，這些都給疾病防控和檢驗檢疫工作帶來了極大的困難。幾何形態(tài)學克服了傳統(tǒng)形態(tài)差異描述中的單一變量比較的缺陷，通過計算不同標點間的距離，借助一系列統(tǒng)計方法將形態(tài)上的變異客觀、準確地呈現(xiàn)出來，而且還可以通過比較樣本間的普氏距離展示出種間親緣關系，在一定程度上彌補了傳統(tǒng)分類鑒定的不足。

由于翅的大小并不能作為種屬區(qū)分的依據(jù)(Birdsalletal., 2010; 段琛等，2018)，故本研究利用幾何形學方法對庫蠓亞屬6種庫蠓進行了翅的形態(tài)比較及聚類分析，發(fā)現(xiàn)上述種類在翅形和翅脈上的微小變化，進一步將不同種類的庫蠓準確區(qū)分，這與國外學者利用幾何形態(tài)學在庫蠓以及按蚊、實蠅等方面獲得的研究成果一致(Suetal., 2015; Giordanietal., 2017; Gómezetal., 2017; 李玲等，2017)。此外，聚類分析可初步用于種間親緣關系判定，如本研究6種庫蠓中日本庫蠓與其余5種庫蠓的親緣關系最遠，光胸庫蠓和漸灰?guī)祗返挠H緣關系最近。因此，翅的幾何形態(tài)學能夠初步用于探討種間親緣關系，但由于自然界中存在普遍的協(xié)同進化現(xiàn)象，其揭示的可能只是不同研究對象表型上的近似或差異，其結(jié)果能否準確地反應物種之間的系統(tǒng)發(fā)育關系還需結(jié)合生物學、生態(tài)學、分子等多種數(shù)據(jù)進行綜合分析。

幾何形態(tài)學具有成本低、速度快、可重復性強、輸出結(jié)果直觀等優(yōu)點，對于無法使用分子手段進行檢測的老標本或者蠓類這種制成玻片保存的標本，該方法尤為適用。但是，任何方法都有其局限性，幾何形態(tài)學亦是如此，其可能存在人為誤差、選取特征片面、殘缺標本無法檢測等。因此，在以后的研究中需要進一步的探究以及開發(fā)更為合理有效的計算機運行技術，使得該門技術更加科學、有效、直觀，在昆蟲學乃至其他學科的研究中發(fā)揮更大的應用價值。