張凱倫，李忠芹，丁 杰，杜若詩，趙曉雨，夏曉明

(山東農業(yè)大學植物保護學院，泰安 271000)

灰飛虱Laodelphaxstriatellus(Fallén)屬半翅目飛虱科灰飛虱屬，是為害水稻、小麥、玉米和大麥等禾本科作物的重要農業(yè)害蟲，主要分布在亞洲和歐洲的溫帶和亞熱帶地區(qū)，在我國長江流域和黃淮地區(qū)為害嚴重(Xuetal., 2014; 毛旭連等，2016; Weietal., 2017; 徐鹿等，2018)?；绎w虱既可以直接為害作物，還可傳播水稻條紋葉枯病(rice stripe virus, RSV)、黑條矮縮病(rice black streaked dwarf virus, RBSDV)和玉米粗縮病(maize rough dwarf virus, MRDV)等病毒病害(Wuetal.，2001；林凌偉等，2001)，其傳毒為害造成的損失遠遠大于直接刺吸為害(王彥華等，2010)。

灰飛虱的防治一直以化學防治為主，但是，由于化學殺蟲劑的長期不合理使用，導致灰飛虱對生產中常用的殺蟲劑產生了不同程度的抗藥性(焦文娟等，2016)。目前，灰飛虱已對生產中常用的有機磷類、氨基甲酸酯類、菊酯類、新煙堿類以及氟蟲腈、吡蚜酮和噻嗪酮等殺蟲劑都產生了不同程度的抗藥性(王利華等，2008；Xuetal., 2014; 班蘭鳳等，2015；毛旭連等，2016；徐鹿等，2018)?？剐詥栴}已成為導致蟲害爆發(fā)并傳播流行性病毒的重要因素(Wangetal., 2010)。

溴氰蟲酰胺(cyantraniliprole)是杜邦公司繼氯蟲苯甲酰胺后成功開發(fā)的一個新型鄰氨基苯甲酰胺類殺蟲劑(余慧靈，2015)，可通過激活靶標害蟲的魚尼丁受體(ryanodine receptor，RyR)，釋放橫紋肌和平滑肌細胞內的鈣，導致害蟲麻痹死亡(潘飛等，2014；周操等，2016)。相比于氯蟲苯甲酰胺，溴氰蟲酰胺擁有更廣的殺蟲范圍，除了可以直接殺害咀嚼式口器的鱗翅目和鞘翅目害蟲，對于半翅目等類型害蟲也具備一定殺傷作用(胡譯文等，2016)。在我國，溴氰蟲酰胺單劑已登記在黃瓜、大蔥、番茄、棉花、水稻、西瓜、小白菜、豇豆上，用于防治二化螟、薊馬、甜菜夜蛾等多種害蟲。溴氰蟲酰胺與噻蟲嗪復配登記在玉米上，用于防治玉米薊馬、蠐螬和小地老虎；與三氟苯嘧啶復配登記在水稻上，防治水稻稻飛虱、稻縱卷葉螟和二化螟。

研究表明，溴氰蟲酰胺對白背飛虱3齡若蟲和成蟲均具有較好的室內毒力，且對灰飛虱具有較好的速效性(劉磊磊等，2015；郭晨亮等，2016)。但尚未見田間灰飛虱對溴氰蟲酰胺敏感性的相關報道。此外，殺蟲劑施用于田間后，隨著時間的推移和個體接觸藥劑的差異，除了對靶標害蟲有直接的殺傷作用外，還對非靶標害蟲和部分抗藥性靶標害蟲存在著亞致死效應。亞致死劑量的殺蟲劑會給害蟲的解毒酶系提供持續(xù)的選擇壓力誘導抗性的演化，加速昆蟲抗藥性的發(fā)展(Guedesetal., 2014; 陳羿渠等，2017)。當溴氰蟲酰胺被施于田間防治水稻和玉米害蟲時，不可避免地會對灰飛虱產生致死和亞致死效應。

本研究采用稻苗浸漬法和點滴法分別測定山東地區(qū)的6個灰飛虱種群對溴氰蟲酰胺的敏感性，并分析比較了兩個亞致死劑量溴氰蟲酰胺對灰飛虱成蟲體內解毒代謝酶活性的影響，旨在明確山東省田間灰飛虱對溴氰蟲酰胺的敏感性現(xiàn)狀，以及灰飛虱體內代謝溴氰蟲酰胺的主要解毒酶，為后期在田間科學、合理使用溴氰蟲酰胺防治灰飛虱提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源及飼養(yǎng)

泰安種群：2016年8月采自泰安玉米田；萊蕪種群：2016年8月采自萊蕪小楊莊玉米田；濟陽種群：2016年10月采自濟陽小麥田；魚臺水稻種群：2016年10月采自魚臺縣水稻田；濟南種群：2017年4月采自山東省濟南郊區(qū)水稻田；魚臺小麥種群：2017年5月采自魚臺縣小麥田。

采集的灰飛虱以未接觸農藥的武育粳3號水稻飼養(yǎng)繁殖，試蟲飼養(yǎng)采用無土水稻育苗法。將水稻種子進行漂洗后以清水浸泡催芽3 d，每天換水2次。將一層吸水紙鋪在飼養(yǎng)盒(35 cm×25 cm×15 cm)中，之后將出芽后的種子均勻撒在吸水紙上。用保鮮膜密封，保鮮膜扎孔，等待水稻出苗。水稻苗長至3 ～5 cm時，將灰飛虱轉移至盒內飼養(yǎng)，并用紗布覆蓋封口。每兩周左右的時間更換水稻苗以保證灰飛虱的營養(yǎng)供給?；绎w虱飼養(yǎng)條件為：溫度25±1℃，相對濕度70%±5%，光照L ∶D=16 h ∶8 h。

1.2 供試藥劑與儀器

94%溴氰蟲酰胺原藥(上海杜邦農化有限公司)、α-乙酸萘酯(α-NA)(上海麥克林生化科技有限公司)、固藍RR鹽(上海麥克林生化科技有限公司)、對硝基苯甲醚(上海麥克林生化科技有限公司)、1-氯-2, 4-二硝基苯(CDNB)(上海麥克林生化科技有限公司)、還原型谷胱甘肽(北京索萊寶科技有限公司)、NADPH(北京索萊寶科技有限公司)、NaH2PO4(天津市凱通化學試劑有限公司)、Na2HPO4(天津市凱通化學試劑有限公司)、NaOH(天津市凱通化學試劑有限公司)、37%鹽酸(天津市凱通化學試劑有限公司)、BCA蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)全自動酶標儀680型(Bio-Rad公司)、Neofuge 13 R高速冷凍離心機(上海力申科學儀器有限公司)、手動微量點滴儀(Hamilton)。

1.3 生物測定

1.3.1稻苗浸漬法

參照王利華等(2008)和班蘭鳳等(2012)報道的稻苗浸漬法，并略作改進。在電子天平上稱取一定量溴氰蟲酰胺原藥，用少量丙酮溶解，然后用0.1%吐溫80依次稀釋成40 mg/L、20 mg/L、10 mg/L、5.0 mg/L、2.5 mg/L一系列濃度。將6日齡武育粳3號稻苗連根一起在系列濃度的藥液中浸10 s，每個濃度重復3次，以不含藥劑的處理做空白對照，取出瀝至無液體滴下，晾干后以濕脫脂棉包住根部放入透明的試管中。用吸蟲器將試蟲移入試管(2 cm×20 cm)中，每管15頭，3個重復，共45頭，然后用紗布封口，以防濕度過大增加死亡率和飛虱逃逸。待試蟲全部爬上稻苗或試管壁后，剔除機械損傷的個體，并補足15頭。接蟲后把試管放入溫度25±1℃,光周期為16 h ∶8 h(光照 ∶黑暗)的培養(yǎng)箱中飼養(yǎng)。處理3天后，檢查死蟲數(shù)。

1.3.2點滴法

參照Endo等(2000)方法，并略作改進。在電子天平上稱取一定量溴氰蟲酰胺原藥，用丙酮溶解，配制成一定濃度的母液，然后用丙酮將其稀釋成一系列濃度20 mg/L、10 mg/L、5.0 mg/L、2.5 mg/L、1.25 mg/L。CO2輕度麻醉(50 ～60 s)試蟲后，用手動微量點滴儀(0.2 μL)將藥液點滴于飛虱胸部背板，每濃度15頭試蟲，重復3次，每處理共45頭，以丙酮為對照。處理后的試蟲轉入裝有新鮮無毒稻苗的試管(2 cm×20 cm)內，飼養(yǎng)條件為溫度25±1℃，光周期16 h ∶8 h(光照 ∶黑暗)，處理24 h后檢查結果。

1.4 亞致死劑量溴氰蟲酰胺對灰飛虱解毒酶活性的影響

1.4.1試蟲處理

選擇魚臺小麥種群作為供試試蟲。根據(jù)前面點滴法測定結果，溴氰蟲酰胺對魚臺小麥種群成蟲的LD10和LD30分別為0.2431 μg/頭和0.5891 μg/頭。參照1.3.2部分描述的點滴法，用這兩個濃度的溴氰蟲酰胺分別處理魚臺小麥灰飛虱種群成蟲，每個濃度處理300頭，重復3次，以丙酮處理為對照。分別在處理6 h、12 h、24 h和48 h后，從不同處理的灰飛虱成蟲中取生長發(fā)育一致的存活成蟲，用液氮速凍后放入-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2酶液制備

取不同處理中的試蟲各20頭，用1 mL磷酸緩沖液(0.1 mol/L，pH7.6)勻漿，然后在10 000 r/min、4℃離心15 min，取上清液作酶液備用。

1.4.3酯酶(esterases, ESTs)活力測定

參照Han等(1998)的方法。在10 mL 0.2 M pH 6.0磷酸緩沖液中加入20 mg固藍RR鹽和0.2 mL 100 mM α-乙酸萘酯乙醇溶液，振蕩混勻后過濾得黃色澄清的底物和顯色劑混合液(需現(xiàn)用現(xiàn)配)。在96孔酶標板中每孔加入20 μL稀釋酶液(事先用0.1 M pH 7.6的磷酸緩沖液稀釋10倍)和205 μL上述底物和顯色劑混液。用酶標儀在波長450 nm下記錄光密度值，酶促反應在27℃下進行，每隔30 s記錄一次，反應15 min。

1.4.4谷胱甘肽-S-轉移酶(glutathione-S-transferases, GSTs)活力測定

參照Kao等(1989)的方法。在酶標板中加入0.6 mmol/L 1-氯-2,4-二硝基苯(CDNB)50 μL 和6 mmol/L還原型谷胱甘肽(GSH)100 μL，再加入100 μL酶液。利用酶標儀測定D340值，記錄10 min內D340變化值，隔20 s記錄一次，共記錄31次。酶促反應溫度為27℃。

1.4.5多功能氧化酶(mixed-function oxidase, MFO)活力測定

參考Shang等(1984)的方法。在酶標板中加入1.0 mmol/L對硝基苯甲醚50 μL和1.0 mmol/L還原型輔酶Ⅱ(NADPH)50 μL，再加入100 μL酶液。利用酶標儀測定D405值，記錄15 min內D405變化值，隔20 s記錄一次，共記錄46次。酶促反應溫度為27℃。

1.4.6蛋白質含量的測定

使用BCA蛋白濃度測定試劑盒，制作標準曲線，根據(jù)標準曲線和使用的樣品體積計算出樣品的蛋白濃度。

1.5 統(tǒng)計分析方法

采用DPS統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，計算出溴氰蟲酰胺對每個地區(qū)灰飛虱的毒力回歸方程式、LC50(LD50)值及其 95%置信限、b值及其標準誤，并采用Duncan氏新復極差法分析解毒酶活性的差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 山東省不同地區(qū)灰飛虱對溴氰蟲酰胺的敏感性

采用稻苗浸漬法和點滴法分別測定了溴氰蟲酰胺對山東省6個灰飛虱種群的室內毒力。稻苗浸漬法測定結果見表1和表2，溴氰蟲酰胺對6個灰飛虱種群3齡若蟲的毒力(LC50)分別為8.5193 mg/L、9.3058 mg/L、9.5712 mg/L、9.8591 mg/L、10.9706 mg/L、11.0524 mg/L，對6個灰飛虱種群成蟲的毒力(LC50)分別為10.4245 mg/L、10.7849 mg/L、11.3864 mg/L、11.8968 mg/L、12.2561 mg/L、12.4904 mg/L。溴氰蟲酰胺對6個灰飛虱種群3齡若蟲和成蟲的毒力均是魚臺小麥種群最高，對3齡若蟲毒力最低的是濟南種群，對成蟲毒力最低的是魚臺水稻種群；對同一個種群成蟲的毒力略低于對3齡若蟲的毒力。點滴法測定結果見表3和表4，溴氰蟲酰胺對6個灰飛虱種群3齡若蟲的毒力(LD50)分別為0.9239×10-3、0.9272×10-3、0.9526×10-3、0.9832×10-3、1.0859×10-3、1.1318×10-3μg/頭，對6個灰飛虱種群成蟲的毒力(LD50)分別為1.0933×10-3、1.1498×10-3、1.1666×10-3、1.1685×10-3、1.2087×10-3、1.2619×10-3μg/頭。溴氰蟲酰胺對6個灰飛虱種群3齡若蟲和成蟲的毒力也均是魚臺小麥種群最高，魚臺水稻種群最低；對同一個種群成蟲的毒力也略低于對3齡若蟲的毒力。

表1 溴氰蟲酰胺對灰飛虱3齡若蟲的毒力(稻苗浸漬法)

表2 溴氰蟲酰胺對灰飛虱成蟲的毒力(稻苗浸漬法)

表3 溴氰蟲酰胺對灰飛虱3齡若蟲的毒力(點滴法)

表4 溴氰蟲酰胺對灰飛虱成蟲的毒力(點滴法)

檢測結果表明，溴氰蟲酰胺對山東省6個灰飛虱種群的毒力差異不大。若以LC50(或LD50)值的95%置信區(qū)間是否重疊作為判斷不同藥劑之間毒力是否顯著的標準(Zhaoetal., 2006；馬崇勇等，2007)，山東省6個田間灰飛虱種群對溴氰蟲酰胺的敏感性差異不顯著，同一地區(qū)灰飛虱種群的不同蟲態(tài)對溴氰蟲酰胺的敏感性也無明顯差異。

2.2 亞致死劑量溴氰蟲酰胺對灰飛虱體內主要代謝解毒酶活性的影響

采用LD10和LD30濃度的溴氰蟲酰胺分別處理魚臺小麥灰飛虱種群成蟲6 h、12 h、24 h和48 h后，其ESTs比活力分別增加至對照組的1.20倍、1.23倍、1.14倍、1.04倍和1.34倍、1.40倍、1.31倍、1.07倍(圖1)；其GSTs比活力分別增加至對照組的2.37倍、1.89倍、1.17倍、1.21倍和3.81倍、2.10倍、1.31倍、1.36倍(圖2)；其MFO比活力分別增加至對照組的1.50倍、1.74倍、1.46倍、1.38倍和1.75倍、2.05倍、1.57倍、1.48倍(圖3)。

結果表明， 采用亞致死劑量的溴氰蟲酰胺處理后6～48 h，灰飛虱成蟲體內3種解毒酶的比活力變化基本趨于一致，均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢；ESTs和MFO的比活力在處理12 h后達到試驗期間最大值，GSTs的比活力在處理6 h后達到試驗期間最大值，且增長倍數(shù)最高；在相同的處理時間下，LD30處理后的3種解毒酶的比活力始終要高于LD10處理組。

圖1 溴氰蟲酰胺亞致死劑量處理后灰飛虱體內ESTs的比活力Fig.1 The specific activity of ESTs in Laodelphax striatellus treated with sublethal doses of cyantraniliprole

圖2 溴氰蟲酰胺亞致死劑量處理后灰飛虱體內GSTs的比活力Fig.2 The specific activity of GSTs in Laodelphax striatellus treated with sublethal doses of cyantraniliprole

圖3 溴氰蟲酰胺亞致死劑量處理后灰飛虱體內MFO的比活力Fig.3 The specific activity of MFO in Laodelphax striatellus treated with sublethal doses of cyantraniliprole

3 結論與討論

由于化學防治是當前控制灰飛虱的重要手段，而且灰飛虱對多種藥劑產生了不同程度的抗性，可以長期用于防治灰飛虱的高效藥劑越來越少，生產中迫切需要補充新的高效藥劑來防治灰飛虱(班蘭鳳等，2015)。溴氰蟲酰胺除了對鱗翅目害蟲具有很好的活性，對蚜蟲、粉虱和飛虱等半翅目害蟲也具有優(yōu)異的活性(楊桂秋等，2012)。目前，有關溴氰蟲酰胺對灰飛虱的室內活性或田間敏感性檢測尚無報道。本研究測定了溴氰蟲酰胺對山東省6個灰飛虱種群3齡若蟲和成蟲的毒力。結果表明，溴氰蟲酰胺無論是對灰飛虱3齡若蟲還是成蟲都表現(xiàn)較好的室內活性，且若蟲和成蟲的敏感性差異不大。不同田間灰飛虱種群對溴氰蟲酰胺的敏感性差異也不顯著。

殺蟲劑對害蟲的毒力測定和敏感性現(xiàn)狀調查是害蟲綜合防治中殺蟲劑選用的重要依據(jù)(王利華等，2008)。目前，灰飛虱毒力測定方法主要有點滴法(馬崇勇等，2007)、稻莖浸漬法(周操等，2016)和稻苗浸漬法(王利華等，2008)3種。點滴法是害蟲對殺蟲劑抗性檢測的主要方法之一，測得的結果僅表示藥劑的觸殺活性(馬崇勇等，2007)。稻莖浸漬法和稻苗浸漬法可以模擬田間施藥后害蟲取食或活動過程中受藥中毒的情形，主要體現(xiàn)的是藥劑的內吸性能，也可體現(xiàn)出一定的觸殺作用，能夠真實反映藥劑對灰飛虱的殺蟲活性(劉磊磊等，2015)。而稻苗浸漬法更貼近田間實際用藥情況，可以為田間防治提供更準確的信息(王利華等，2008)。本研究表明，無論采用稻苗浸漬法還是點滴法，溴氰蟲酰胺均對灰飛虱表現(xiàn)出較好的室內活性，這進一步說明，溴氰蟲酰胺具有很好的觸殺效果和胃毒效果，并具有很好的內吸活性(楊桂秋等，2012；王榮燕等，2017)。此外，由于溴氰蟲酰胺具有極強的內吸和雙向傳導作用，田間除了噴霧使用外還可以用于灌根或種衣劑處理(王海娜等，2014)。因此，在未來灰飛虱的防治中，溴氰蟲酰胺將會成為一種重要的高效殺蟲劑。

亞致死劑量的殺蟲劑會對昆蟲體內的多種酶系產生誘導或抑制作用(Suetal., 2012)，改變昆蟲對殺蟲劑的代謝，從而影響害蟲防治措施的有效性。酯酶(ESTs)、谷胱甘肽-S-轉移酶(GSTs)及多功能氧化酶(MFO)是昆蟲體內重要的解毒酶系，通過測定其活性變化來研究殺蟲劑的亞致死效應，已經成為毒理學研究的重要內容(Karuppaiahetal., 2015)。Liu等(2014)研究表明，溴氰蟲酰胺亞致死劑量LC20和LC50處理小菜蛾3齡幼蟲24 h和48 h后，顯著提高供試昆蟲體內羧酸酯酶、谷胱甘肽-S-轉移酶和多功能氧化酶的活性。余慧靈等(2015)研究發(fā)現(xiàn)，溴氰蟲酰胺亞致死劑量(LC10和LC25)處理甜菜夜蛾幼蟲24～96 h后，可誘導試蟲體內羧酸酯酶活性和谷胱甘肽-S-轉移酶活性呈先激活升高、后抑制降低的趨勢，具有明顯的劑量效應和時間效應。曾賢義(2017)研究也發(fā)現(xiàn)，溴氰蟲酰胺亞致死劑量LC30處理煙蚜8～48 h后，煙蚜體內的GSTs和MFO比活力均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，分別在16 h和36 h時達到最大值，并顯著高于對照處理。本研究發(fā)現(xiàn)，使用LD10和LD30劑量的溴氰蟲酰胺處理灰飛虱成蟲6～48 h后，灰飛虱體內的3種解毒酶的比活力均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，表現(xiàn)出明顯的時間和劑量效應；ESTs和MFO的比活力在處理12 h后達到最大值，GSTs的比活力在處理6 h后達到最大值，均顯著高于對照處理。但溴氰蟲酰胺亞致死劑量(LC10和LC25)處理甜菜夜蛾幼蟲24～96 h后，與對照相比，MFO活性受到明顯的抑制作用，且抑制程度與藥劑劑量成正比(余慧靈等，2015)。這種差異很可能是由于同一種殺蟲劑的亞致死劑量對不同種類害蟲體內的解毒酶活性影響有差別造成的(邢靜等，2011)。

本研究采用稻苗浸漬法和點滴法，檢測了山東省6個灰飛虱種群3齡若蟲和成蟲對溴氰蟲酰胺的敏感性，并測定了亞致死劑量(LD10和LD30)溴氰蟲酰胺對灰飛虱成蟲體內3種解毒代謝酶活性的影響。研究結果可為田間科學、合理使用溴氰蟲酰胺防治灰飛虱提供理論依據(jù)。但殺蟲劑的亞致死劑量除了影響昆蟲體內解毒酶活性，還可能影響昆蟲的繁殖力、生長發(fā)育、生態(tài)行為和抗藥性等一系列亞致死效應，且這種效應也會受昆蟲性別和處理濃度的影響。因此，溴氰蟲酰胺對灰飛虱的亞致死效應還需要深入系統(tǒng)研究。