魯玉杰，杜夢園，張 蒙，王爭艷

((河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院，河南糧食作物協(xié)同創(chuàng)新中心，糧食儲(chǔ)藏安全河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，鄭州 450001))

銹赤扁谷盜Cryptolestesferrugineus(Stephens)是當(dāng)今世界上最難殺死的儲(chǔ)糧害蟲之一，它能夠引起糧食局部發(fā)熱霉變(蘇青峰等，2013)。由于其長期單一使用磷化氫，導(dǎo)致銹赤扁谷盜對磷化氫的抗性急劇提高(曹陽，2006)，目前磷化氫熏蒸已經(jīng)很難徹底殺死銹赤扁谷盜。尋找新型的、對環(huán)境友好型的殺蟲劑，已成當(dāng)務(wù)之急。昆蟲生長調(diào)節(jié)劑殺蟲具有不污染環(huán)境、對人畜安全，以及對多數(shù)非靶標(biāo)生物無害的優(yōu)點(diǎn)(楊惠，2001)，符合新型殺蟲劑的要求。昆蟲生長調(diào)節(jié)劑的種類很多，其中苯甲?；孱悗锥≠|(zhì)合成抑制劑以其獨(dú)特的作用機(jī)制，對非靶標(biāo)生物具有較高的選擇性、使用濃度低、降解速度快、對環(huán)境友好等傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)無法比擬的優(yōu)點(diǎn)，被列為特異性的昆蟲生長調(diào)節(jié)劑，已成為新農(nóng)藥創(chuàng)制的一個(gè)熱門研究領(lǐng)域(羅會(huì)等，2009)。

定蟲隆(chlorfluazuron)是一種苯甲?；孱悗锥≠|(zhì)合成抑制劑(冒德壽等，2001)，能抑制害蟲的幾丁質(zhì)合成，阻斷蛻皮過程，致使蛻皮困難、取食量下降(梁英，2009)，從而導(dǎo)致其死亡或不育(李秀峰和李玉新，2001；羅會(huì)等，2009)。因其獨(dú)特的殺蟲機(jī)制、較高的特異性、低殘留等優(yōu)點(diǎn)，被稱為新型殺蟲劑，常用來防治鱗翅目、鞘翅目等害蟲(米娜等，2009)。研究表明，定蟲隆能有效的抑制谷蠹Rhizoperthadominica、米象Sitophilusoryzae、鋸谷盜Oryzaephilussurinamensis和赤擬谷盜Triboliumcastaneum4種儲(chǔ)糧害蟲的繁殖，具有很好的防治效果(Elek and Logstaff，1994)。相關(guān)的研究表明，除蟲脲能有效的抑制蚊子Culicidae幾丁質(zhì)的合成，使幼蟲不能形成新表皮，致使幼蟲畸形而死亡(Cetinetal.，2006)。氟蟲脲對東亞飛蝗Locustamigratoria的幾丁質(zhì)合成也有明顯的抑制作用(王貴強(qiáng)等，1996)，從而起到了防治害蟲的效果。苯甲?；孱悗锥≠|(zhì)合成抑制劑的作用機(jī)理可能是特異性的干擾昆蟲表皮幾丁質(zhì)的合成，但其作用于幾丁質(zhì)合成中的哪一環(huán)節(jié)至今尚不清楚。已有研究表明，幾丁質(zhì)合成抑制劑影響幾丁質(zhì)合成酶(Postetal.，1974)，也有研究表明定蟲隆并不直接抑制幾丁質(zhì)合成酶(Gangishettietal.，2009)。關(guān)于定蟲隆的具體作用靶標(biāo)及毒性機(jī)理，目前還沒有明確的結(jié)論。

定蟲隆作為一種幾丁質(zhì)合成抑制劑被廣泛應(yīng)用，而目前對于定蟲隆的研究一般集中在殺蟲活性及農(nóng)藥殘留方面(朱烈等，2016)，定蟲隆對銹赤扁谷盜產(chǎn)生的影響，及可能的作用靶標(biāo)尚沒有系統(tǒng)性的研究。本研究以銹赤扁谷盜為對象，通過亞致死劑量的定蟲隆處理銹赤扁谷盜，研究定蟲隆對其生長發(fā)育的影響，及可能作用的靶標(biāo)，為以后定蟲隆用于儲(chǔ)糧害蟲的防治提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1供試?yán)ハx

銹赤扁谷盜試蟲來源于山西呂梁國家糧食儲(chǔ)備庫，在河南工業(yè)大學(xué)儲(chǔ)糧生態(tài)研究室的人工氣候室培養(yǎng)多代，飼養(yǎng)溫度30℃±1℃，相對濕度60%±5%，選擇同一時(shí)間孵化的幼蟲，轉(zhuǎn)移至玻璃瓶中，飼喂人工飼料，飼料為全麥粉 ∶燕麥 ∶酵母粉的比例為5 ∶4 ∶1。

1.1.2主要試劑與儀器

定蟲隆：含量99%，CSSBIO(中國)提供；RNA提取試劑盒Total RNA Miniprep Kit購自Axygen公司；熒光定量PCR試劑盒SYBR Premix Ex Taq購于TaKaRa公司；熒光定量PCR儀Step One Plus Real Time PCR(Thermo Fisher Scientific美國)。PCR引物合成由蘇州金唯智生物科技公司完成。

1.2 定蟲隆對銹赤扁谷盜的毒力測定

取1 mg定蟲隆粉劑，用1 mL丙酮溶解，配制1 mg/mL定蟲隆母液。在潔凈的培養(yǎng)皿中，每10 g全麥粉(含5%酵母粉)中加入10 mL含有所需量定蟲隆的丙酮溶液，將飼料配制成0.0050 mg/kg、0.0091 mg/kg、0.0166 mg/kg、0.0302 mg/kg、0.0549 mg/kg、0.1000 mg/kg 6個(gè)濃度梯度，并將懸浮液攪拌搖勻，然后將溶液放在通風(fēng)櫥下，直至丙酮完全揮發(fā)。使用和上述完全一樣的飼料，只添加丙酮作為對照。每組放入30頭銹赤扁谷盜2齡幼蟲，每個(gè)濃度3個(gè)重復(fù)。每天記錄幼蟲死亡數(shù)并觀察表型變化。

1.3 亞致死劑量下定蟲隆對銹赤扁谷盜生長發(fā)育的影響

根據(jù)定蟲隆對銹赤扁谷盜的毒力方程計(jì)算出銹赤扁谷盜的亞致死劑量LD10、LD20、LD30。用同樣的飼喂方法，分別用LD10、LD20、LD303個(gè)濃度的定蟲隆處理銹赤扁谷盜2齡幼蟲，以丙酮作為對照，觀察LD10、LD20和LD30下，定蟲隆對銹赤扁谷盜幼蟲發(fā)育歷期、體重、幾丁質(zhì)含量的影響。幾丁質(zhì)含量測定采用氨基葡萄糖法(Lehmann and White，1975)。

1.4 定蟲隆對幾丁質(zhì)合成酶表達(dá)量的影響

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室得到的銹赤扁谷盜幾丁質(zhì)合成酶1基因(CfCHS1)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，和已經(jīng)提交到GenBank的銹赤扁谷盜幾丁質(zhì)合成酶2基因(CfCHS2)的全長序列(GenBank登錄號(hào)：MH234580)，設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物(表1)。以同樣的飼喂方法，用LD30劑量的定蟲隆處理銹赤扁谷盜3齡幼蟲，每組30頭蟲，3組重復(fù)，以丙酮處理為對照。提取定蟲隆LD30處理48 h后的銹赤扁谷盜3齡幼蟲總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行熒光定量PCR。qPCR反應(yīng)體系：cDNA模板2 μL(<100 ng)，SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2×)10 μL，PCR上引物(10 μM)0.8 μL，PCR下引物(10 μM)0.8μL，ROX Reference Dye(50×)0.4 μL，ddH2O 6 μL，總反應(yīng)體系為20 μL。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火延伸30 s，72℃，30 s，40個(gè)循環(huán)。每組樣品進(jìn)行3個(gè)重復(fù)，以目的基因在對照組中的表達(dá)量為1，以ARF1為內(nèi)參基因。

表1 本文中所用引物的名稱、序列

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

死亡率(%)=(死亡數(shù)/總蟲數(shù))×100

校正死亡率(%)=[(處理組死亡率-對照組死亡率)/對照組存活率]×100

統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和檢驗(yàn)，P=0.05。

qPCR結(jié)果采用比較CT值得相對表達(dá)量法(2-ΔΔCt)計(jì)算基因的相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示。表達(dá)量的差異顯著性比較采用SPSS軟件中的單因素方差分析(ANOVA，Tukey氏多重比較法，P<0.05)進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 定蟲隆對銹赤扁谷盜的殺蟲活性

根據(jù)生物測定結(jié)果，將其與劑量對數(shù)值進(jìn)行回歸分析，建立定蟲隆毒力方程：y=7.514+1.81x，r=0.974，計(jì)算得LD50為0.041 mg/kg，95%置信區(qū)間為0.025～0.059 mg/kg；LD95為0.331 mg/kg，95%置信區(qū)間為0.270～5.832 mg/kg。亞致死劑量LD10、LD20、LD30分別為0.008 mg/kg、0.014 mg/kg、0.021 mg/kg。

2.2 亞致死劑量定蟲隆對銹赤扁谷盜生長發(fā)育的影響

經(jīng)過亞致死劑量定蟲隆處理的銹赤扁谷盜幼蟲，各個(gè)發(fā)育歷期以及蛹期的天數(shù)都是有所增加的。隨著定蟲隆劑量的增加，銹赤扁谷盜的發(fā)育歷期明顯延長(表2)。定蟲隆劑量越高，處理時(shí)間越長，銹赤扁谷盜體重下降越顯著；經(jīng)定蟲隆LD30長期處理的銹赤扁谷盜，體重可下降25%(表3)。低劑量的定蟲隆就可以導(dǎo)致銹赤扁谷盜幾丁質(zhì)含量顯著下降(P<0.05)(圖1)。

表2 不同濃度定蟲隆處理后銹赤扁谷盜各蟲態(tài)的發(fā)育歷期

注：同列中不同的字母代表發(fā)育歷期差異顯著(P<0.05，Tukey’s B；n=3)。
Note: Different letters in the same column represent significant differences in development duration (P<0.05, Tukey’s B; n=3).

表3 不同濃度定蟲隆處理后銹赤扁谷盜各蟲態(tài)的體重

注：同列中不同的字母代表體重差異顯著(P<0.05，Tukey’s B；n=3)。
Note: Different letters in the same column represented significant differences in body weight (P<0.05, Tukey’s B; n=3).

圖1 定蟲隆處理后銹赤扁谷盜各蟲態(tài)幾丁質(zhì)的含量Fig.1 Content of chitin in different stages of Cryptolestes ferrugineus after treatment with chlorfluazuron注：柱上標(biāo)的不同字母代表幾丁質(zhì)含量差異顯著(P < 0.05，Tukey’s B；n=3)。Note: Different letters of the superscript on the column represent significant differences in the content of chitin (P < 0.05, Tukey’s B; n=3).

2.3 定蟲隆處理后銹赤扁谷盜幾丁質(zhì)合成酶基因表達(dá)量的變化

用LD30定蟲隆處理銹赤扁谷盜3齡幼蟲，幾丁質(zhì)合成酶基因表達(dá)量的變化如圖2所示。從圖2可以看出，CfCHS1基因的表達(dá)量明顯上調(diào)，是對照組的1.787倍。CfCHS2基因的表達(dá)量也明顯上調(diào)，是對照組表達(dá)量的1.274倍。說明了定蟲隆可以顯著提高銹赤扁谷盜幾丁質(zhì)合成酶CfCHS1和CfCHS2基因的表達(dá)量。

圖2 定蟲隆處理后銹赤扁谷盜3齡幼蟲幾丁質(zhì)合成酶CfCHS1和CfCHS2基因的表達(dá)量Fig.2 Expression level of chitin synthase CfCHS1 and CfCHS2 in the third instar larvae of Cryptolestes ferrugineus treatment with chlorfluazuron注：CK代表對照組，LC30代表處理組。數(shù)據(jù)均代表3次生物學(xué)重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。柱上標(biāo)的不同字母代表基因表達(dá)差異顯著(P<0.05，Tukey’s B；n=3)。Note: The data are means±SD.Histograms with different letters indicate statistically significant difference (P < 0.05, Tukey’s B; n=3).

3 討論與結(jié)論

目前關(guān)于苯甲?；逡种苿┑膩喼滤佬?yīng)研究相對較少，其作用機(jī)制也尚不清楚。本研究選取定蟲隆進(jìn)行試驗(yàn)，使用亞致死劑量持續(xù)處理銹赤扁谷盜幼蟲，發(fā)現(xiàn)其各個(gè)蟲態(tài)的發(fā)育歷期都明顯延長，體重下降，幾丁質(zhì)含量減少，并出現(xiàn)畸形死亡個(gè)體，這一結(jié)果與除蟲脲對中華稻蝗Oxyachinensis的影響(曾慧花等，2008)相同，與滅幼脲能顯著降低家蠅Muscadomestica幾丁質(zhì)的含量(Ishaaya and Casida，1974)的結(jié)果也是一致的。這說明定蟲隆作為幾丁質(zhì)合成抑制劑，的確抑制了銹赤扁谷盜幼蟲幾丁質(zhì)的合成，但發(fā)育歷期的延長，和體重的下降，暗示著定蟲隆可能對幼蟲產(chǎn)生其他影響。

在滅幼脲處理家蠶Bombyxmori和四斑按蚊Anophelesquadrimaculatus中，其幼蟲的體重均顯著減少(Leonardietal.，1996；Zhuetal.，2006)，這與本研究的結(jié)果相同。在除蟲脲對中華稻蝗的研究中發(fā)現(xiàn)，除蟲脲不僅抑制了中華稻蝗的體重的增長，還對其進(jìn)食產(chǎn)生了抑制(曾惠花等，2008)。Clarke用除蟲脲處理東亞飛蝗，發(fā)現(xiàn)除了表皮結(jié)構(gòu)外，東亞飛蝗圍食膜中的幾丁質(zhì)合成也受到了抑制(Clarkeetal.，1977)。根據(jù)前人的研究，幾丁質(zhì)合成酶2參與中腸圍食膜的形成(Merzendorfer，2006)。劉曉健利用RNAi干擾技術(shù)，對飛蝗幾丁質(zhì)合成酶2基因進(jìn)行沉默，其試蟲的取食量也明顯減少，體重降低(劉曉健等，2014)。根據(jù)大量研究推測，定蟲隆可能對銹赤扁谷盜幾丁質(zhì)合成酶2產(chǎn)生影響，使其不能正常反應(yīng)，致使圍食膜的形成受到影響，從而產(chǎn)生了與RNAi干擾相似的結(jié)果。

為了探究定蟲隆作用機(jī)理，本文在用定蟲隆處理銹赤扁谷盜之后，利用qPCR技術(shù)，測定了幾丁質(zhì)合成酶基因相對表達(dá)量的變化。結(jié)果顯示，亞致死劑量定蟲隆處理后，銹赤扁谷盜幾丁質(zhì)合成酶1和酶2的表達(dá)量顯著提高。為什么定蟲隆可以使幾丁質(zhì)合成酶基因的表達(dá)量提高？我們推測，定蟲隆可能作用于銹赤扁谷盜幾丁質(zhì)合成酶。定蟲隆抑制了幾丁質(zhì)合成酶，使其不能正常的進(jìn)行幾丁質(zhì)的合成，從而引起幾丁質(zhì)合成受阻，銹赤扁谷盜為了維持機(jī)體的穩(wěn)定，提高幾丁質(zhì)合成酶基因的表達(dá)量，從而形成一種代償性增加的反饋機(jī)制。Zhang and Zhu(2006)使用除蟲脲處理四斑按蚊，發(fā)現(xiàn)其AqCHS1的表達(dá)量增加也顯著提高。在氟蟲脲對東亞飛蝗和中華稻蝗處理后，其CHS1基因的表達(dá)量都有顯著的升高(劉曉健等，2010)。至于定蟲隆是如何作用于幾丁質(zhì)合成酶，幾丁質(zhì)含量的減少與幾丁質(zhì)合成酶表達(dá)量增加之間的關(guān)系，需要我們進(jìn)一步去研究。

本研究用定蟲隆處理銹赤扁谷盜，結(jié)果表明定蟲隆對銹赤扁谷盜的生長發(fā)育有明顯的抑制作用，可以有效控制銹赤扁谷盜，至于如何在儲(chǔ)糧環(huán)境中使用定蟲隆，還有待進(jìn)一步的研究，并需符合農(nóng)藥管理相關(guān)要求。定蟲隆在抑制幾丁質(zhì)合成的同時(shí)，也使銹赤扁谷盜的幾丁質(zhì)合成酶基因表達(dá)量提高，這表明定蟲隆可能作用于幾丁質(zhì)合成途徑中的幾丁質(zhì)合成酶。這為以后利用定蟲隆防治銹赤扁谷盜提供理論基礎(chǔ)。