肖昆林, 張 蕊, 孫 紅, 肖昆太, 馬建兵

(1. 廣州市花都區(qū)人民醫(yī)院, 廣州 510800;2. 西安交通大學(xué)附屬紅會(huì)醫(yī)院, 西安 710054;3. 廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)院, 廈門 361000）

骨性關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis, OA)是一種可導(dǎo)致患者出現(xiàn)嚴(yán)重殘疾的退行性關(guān)節(jié)疾病，以關(guān)節(jié)軟骨進(jìn)行性破壞為主要特點(diǎn)，膝關(guān)節(jié)最常受累[1]。OA動(dòng)物模型的建立是研究OA發(fā)病機(jī)制與治療方法的前提[2]。目前，OA動(dòng)物模型建立的方法主要有外科手術(shù)、關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射藥物和自發(fā)性O(shè)A 3種[3]。外科手術(shù)構(gòu)建OA模型的方法與臨床OA較為接近，但同時(shí)存在著創(chuàng)傷大、造模時(shí)間長(zhǎng)等缺點(diǎn)。自發(fā)性O(shè)A模型與臨床OA最為相似，但其造模時(shí)間過(guò)長(zhǎng)也不適合大力推廣。關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射藥物的建模方法所需時(shí)間較短，在疾病的研究中應(yīng)用廣泛。常見(jiàn)的注射藥物有Ⅱ型膠原酶和碘乙酸鹽，碘乙酸鹽誘導(dǎo)的大鼠OA模型表現(xiàn)為關(guān)節(jié)軟骨破壞，軟骨下骨損傷，以及炎癥和關(guān)節(jié)疼痛等[4]。關(guān)節(jié)腔注射不同劑量單碘乙酸(MIA)及在不同的時(shí)間點(diǎn), SD大鼠均呈現(xiàn)出OA病變, MIA注射的劑量1～10 mg/kg不等, 注射的時(shí)間1～8周不等[5,6]。然而目前為止, 尚無(wú)研究報(bào)道將OA疾病的進(jìn)程和關(guān)節(jié)腔注射MIA的劑量和時(shí)間相聯(lián)系。本研究通過(guò)關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射中等劑量的MIA, 誘導(dǎo)膝OA大鼠模型，分別于注射MIA后1周、2周和4周處死大鼠進(jìn)行觀察、檢測(cè)和關(guān)節(jié)軟骨組織病理學(xué)(OOCHAS)評(píng)分，并與臨床OA的發(fā)病進(jìn)程相聯(lián)系，為后期OA發(fā)病和治療機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)2月齡雄性SD大鼠24只，體質(zhì)量(210±18) g，2月齡購(gòu)自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心[SCXK(陜)-2018-001]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在西安市紅會(huì)醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心進(jìn)行，[SYXK(陜)2015-002]動(dòng)物實(shí)驗(yàn)通過(guò)西安市紅會(huì)醫(yī)院倫理委員會(huì)審查通過(guò)(編號(hào)IACUC2017-0819)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及主要儀器設(shè)備

MIA、戊巴比妥均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；微量注射器購(gòu)自上海高鴿公司；乙二胺四乙酸(EDTA)購(gòu)自科昊生物公司；質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛溶液購(gòu)自Boster公司；OCT購(gòu)自Tissue-Tek公司；HE染色試劑盒、甲苯胺藍(lán)染色試劑盒均購(gòu)自Solarbio公司，冰凍切片機(jī)、解剖顯微鏡均購(gòu)自Leica公司等。

1.3 膝骨性關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型的建立

將SD大鼠隨機(jī)分成2組，即模型組(18只)和對(duì)照組(6只)。2組大鼠均用3%的戊巴比妥鈉1 mL/kg腹腔注射麻醉后，取右膝關(guān)節(jié)備皮，模型組大鼠右膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射溶于50 μL生理鹽水的2 mg MIA，對(duì)照組大鼠右膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射等量的生理鹽水, 隨后將大鼠放回籠內(nèi)飼養(yǎng)(每籠3只),自由飲食。

1.4 形態(tài)學(xué)觀察及膝關(guān)節(jié)OOCHAS大體評(píng)分

關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射1周、2周和4周后，模型組大鼠采用空氣栓塞法處死每組各6只大鼠，對(duì)照組采用同樣的方法處死每組各2只大鼠，解剖取膝關(guān)節(jié)股骨髁和脛骨平臺(tái)軟骨組織，置于解剖顯微鏡下觀察并拍照。根據(jù)關(guān)節(jié)色澤、平滑度、關(guān)節(jié)液性狀以及關(guān)節(jié)面的磨損情況進(jìn)行膝關(guān)節(jié)OOCHAS大體評(píng)分，本研究采用雙盲法進(jìn)行評(píng)分。0分：關(guān)節(jié)面形態(tài)正常；1分：關(guān)節(jié)面具有輕微的纖維化(磨損、龜裂或剝落)或關(guān)節(jié)面輕微黃染；2分：關(guān)節(jié)軟骨缺損累計(jì)軟骨淺層和中層；3分：關(guān)節(jié)面缺損達(dá)軟骨深層；4分：關(guān)節(jié)面缺損累計(jì)軟骨全層，乃至軟骨下骨。

1.5 標(biāo)本處理及切片制作

將關(guān)節(jié)標(biāo)本置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%的多聚甲醛溶液中固定，72 h后取出，置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)12.5% 的EDTA溶液中脫鈣2周，隨后放入30%的高糖溶液進(jìn)行沉糖，48h后取出，用冰凍切片包埋劑(OCT)進(jìn)行包埋，于冰凍切片機(jī)中制作7 μm厚冰凍切片，并放于-20℃冰箱保存。

1.6 組織學(xué)染色及OOCHAS組織學(xué)評(píng)分

將組織切片分別進(jìn)行伊紅-蘇木素(HE)及甲苯胺藍(lán)染色，并在光學(xué)顯微鏡下對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行拍照。根據(jù)關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)、蛋白多糖含量、軟骨細(xì)胞聚集及數(shù)量、潮線完整度等方面，采用雙盲法進(jìn)行OOCHAS組織學(xué)評(píng)分，累計(jì)0～12分為輕中度癥狀，13～24分為重度癥狀。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 膝關(guān)節(jié)面形態(tài)學(xué)觀察

圖1結(jié)果顯示，對(duì)照組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨面光滑，外觀呈淡紫色，軟骨面無(wú)充血、裂紋等。模型組大鼠造模1周后關(guān)節(jié)軟骨面略微粗糙，有小的裂隙且色澤灰暗；造模2周后關(guān)節(jié)軟骨面粗糙，光澤度消失，軟骨缺損深達(dá)軟骨中下層；造模4周后軟骨缺損累及軟骨全層，并深達(dá)軟骨下骨，股骨髁和脛骨平臺(tái)軟骨剝脫。

2.2 膝關(guān)節(jié)軟骨組織OOCHAS大體評(píng)分

對(duì)照組大鼠OOCHAS大體評(píng)分為0，造模1周和2周大鼠表現(xiàn)為關(guān)節(jié)軟骨的輕度損傷，4周表現(xiàn)為輕重度。單因素方差分析結(jié)果顯示, 造模后3個(gè)時(shí)間點(diǎn)大體評(píng)分分值差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2)。兩組間多重比較結(jié)果顯示，造模2周和4周相對(duì)于1周，4周相對(duì)于2周，分值均顯著提高，其中4周相對(duì)于1周，差異最顯著。

2.3 膝關(guān)節(jié)組織學(xué)染色結(jié)果

圖 1 大鼠膝關(guān)節(jié)組織形態(tài)學(xué)觀察Figure 1 Morphological observation of rat knee joint

圖 2 大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織OOCHAS大體評(píng)分Figure 2 Rat knee joint OOCHAS gross score

對(duì)照組大鼠(圖3a、圖4a)軟骨表層無(wú)裂隙，表層細(xì)胞呈梭形，近似水平排列；中間層細(xì)胞為圓形，散在分布；深層細(xì)胞呈柱狀排列；潮線清晰；鈣化層細(xì)胞較大，呈散在分布，軟骨基質(zhì)著色基本均勻。造模1周后見(jiàn)大鼠軟骨面出現(xiàn)小的裂隙，軟骨細(xì)胞數(shù)量輕度減少，潮線模糊，甲苯胺藍(lán)染色輕度變淡(圖3b、圖4b)。造模2周后大鼠關(guān)節(jié)軟骨組織破壞明顯，軟骨細(xì)胞數(shù)目明顯減少，潮線消失，甲苯胺藍(lán)染色明顯變淡(圖3c、圖4c)。造模4周后大鼠關(guān)節(jié)面缺損深達(dá)軟骨下骨，潮線周圍有新生血管出現(xiàn)，甲苯胺藍(lán)染色顯著變淡(圖3d、圖4d)。

2.4 OOCHAS組織學(xué)評(píng)分結(jié)果

圖 3 大鼠膝關(guān)節(jié)組織 HE 染色結(jié)果Figure 3 Representative histological images of HE staining after MIA intraarticular injection

圖 4 大鼠膝關(guān)節(jié)組織甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果Figure 4 Representative histological images of toluidine blue staining after MIA intraarticular injection

對(duì)照組大鼠OOCHAS組織學(xué)評(píng)分為0，模型組大鼠1周和2周表現(xiàn)為輕中度OA，4周后表為輕重度。單因素方差分析結(jié)果顯示，造模后3個(gè)時(shí)間點(diǎn)大鼠OOCHAS組織學(xué)評(píng)分分值差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。兩組間多重比較結(jié)果顯示, 造模2周和4周相對(duì)于1周，4周相對(duì)于2周，分值均顯著性提高，其中4周相對(duì)于1周，差異最顯著，與OOCHAS大體評(píng)分結(jié)果一致。

圖 5 造模后大鼠膝關(guān)節(jié)OOCHAS組織學(xué)評(píng)分Figure 5 The result of OOCHAS histological score of rat model after MIA intraarticular injection

3 討論

本研究通過(guò)關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射MIA的方法誘導(dǎo)OA大鼠模型, 結(jié)果顯示造模1周和2周后, 大鼠活動(dòng)量逐漸減少, 關(guān)節(jié)軟骨面出現(xiàn)了大小不一的缺損,股骨和脛骨平臺(tái)軟骨變薄, OOCHAS大體評(píng)分和組織學(xué)評(píng)分顯示輕中度OA癥狀，與臨床OA早中期軟骨退變的表現(xiàn)相似; 造模4周后，大鼠活動(dòng)量明顯減少，并逐漸出現(xiàn)跛行，關(guān)節(jié)軟骨面破壞加重, 呈糜爛狀, 軟骨缺損深達(dá)軟骨下骨層, OOCHAS大體評(píng)分和組織學(xué)評(píng)分顯示輕重度OA癥狀，與臨床晚期的軟骨退行性變的表現(xiàn)較為接近。

在以往的研究[7]報(bào)道中, 軟骨的病理?yè)p傷被作為評(píng)估OA各項(xiàng)指標(biāo)的“金標(biāo)準(zhǔn)”。Morais等[8]通過(guò)關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射MIA的方法建立OA大鼠模型，發(fā)現(xiàn)該OA模型表現(xiàn)出軟骨細(xì)胞的變性和凋亡，即出現(xiàn)了軟骨損傷，最終膝關(guān)節(jié)間隙變窄，疼痛加重，與人的骨關(guān)節(jié)炎癥狀相似。進(jìn)一步證實(shí)了關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射MIA建立OA大鼠模型是一個(gè)良好的方法，可以在相關(guān)研究中推廣使用。

OOCHAS評(píng)分體系由國(guó)際骨關(guān)節(jié)炎學(xué)會(huì)(OARSI)在1998年根據(jù)不同種類動(dòng)物的OA軟骨組織退變特征和病理學(xué)特點(diǎn)所構(gòu)建，是一套專門用于OA的評(píng)分體系，該評(píng)分系統(tǒng)從關(guān)節(jié)軟骨整體結(jié)構(gòu)、蛋白多糖含量、軟骨細(xì)胞特性、潮線完整度、骨贅形成等五個(gè)方面分不同等級(jí)對(duì)軟骨損傷的程度進(jìn)行評(píng)分，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)OA各個(gè)時(shí)期的病理?yè)p傷進(jìn)行評(píng)價(jià)[9]。本研究對(duì)膝關(guān)節(jié)軟骨從宏觀形態(tài)學(xué)觀察，組織學(xué)染色，OOCHAS評(píng)分系統(tǒng)采用雙盲法進(jìn)行評(píng)分，發(fā)現(xiàn)MIA誘導(dǎo)的膝OA大鼠模型，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，膝關(guān)節(jié)軟骨呈進(jìn)行性退變，軟骨細(xì)胞外基質(zhì)蛋白聚糖成分含量逐漸降低，類似于臨床膝OA的發(fā)病進(jìn)程。

關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞是關(guān)節(jié)軟骨中唯一的細(xì)胞類型，通過(guò)合成和分解細(xì)胞外基質(zhì)維持軟骨細(xì)胞外環(huán)境的穩(wěn)定[10,11]。細(xì)胞外基質(zhì)成分主要包括II型膠原和蛋白多糖[12]。Roberto等[5]通過(guò)向大鼠脛股關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射MIA，發(fā)現(xiàn)MIA對(duì)軟骨細(xì)胞中甘油醛-3磷酸脫氫酶的活性具有抑制作用，導(dǎo)致糖酵解中斷，細(xì)胞外基質(zhì)蛋白聚糖合成的數(shù)量和質(zhì)量下降，從而引起軟骨細(xì)胞凋亡。軟骨細(xì)胞的逐漸減少導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨的組織學(xué)和形態(tài)學(xué)特征改變，最終產(chǎn)生與人OA癥狀相似的變化[13,14]。另外，用關(guān)節(jié)腔注射MIA的方法誘導(dǎo)OA動(dòng)物模型，還具有創(chuàng)傷小、時(shí)間短、可重復(fù)性強(qiáng)以及相對(duì)容易操作等優(yōu)點(diǎn)，已被應(yīng)用于許多動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[15-17]。雖然MIA誘導(dǎo)OA大鼠模型的方法已被廣泛應(yīng)用，但也存在著一些不足之處，它沒(méi)有在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)與人OA的發(fā)病進(jìn)程相聯(lián)系和比較，而本文恰恰彌補(bǔ)了這個(gè)不足。

綜上所述，本研究通過(guò)關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射單碘乙酸成功誘導(dǎo)了膝OA模型，并將不同時(shí)間點(diǎn)的結(jié)果與臨床疾病進(jìn)程相聯(lián)系，為后期功能和機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)。