許振坤, 任麗瑋, 原 濤

(河北省邯鄲市第一醫(yī)院心內(nèi)二科, 邯鄲 056002)

隨著人們生活水平的提高和高脂肪飲食習(xí)慣的形成，越來越多的冠心病患者合并有糖尿病和/或高脂血癥，而這些疾病有一個(gè)“共同土壤”—胰島素抵抗(insulin resistance, IR)。IR是指由于各種影響胰島素的原因，使得機(jī)體攝取和利用葡萄糖的效率降低，為了維持血糖的穩(wěn)定，機(jī)體代償性分泌過多胰島素，從而形成高胰島素血癥[1]。代表性癥狀為血脂紊亂、肥胖、動(dòng)脈粥樣硬化(AS)等。其中AS主要表現(xiàn)為動(dòng)脈粥樣斑塊，不穩(wěn)定粥樣斑塊極易破裂，誘發(fā)急性血栓，導(dǎo)致急性動(dòng)脈綜合征，甚至危及生命，所以AS給人類生命健康造成了嚴(yán)重的威脅。評(píng)估斑塊的結(jié)構(gòu)和組成，密切關(guān)注其動(dòng)態(tài)，對(duì)防止其破裂和選擇合適的治療時(shí)機(jī)和方案具有重要的臨床價(jià)值[2,3]。

目前常見的AS動(dòng)物模型包括：載脂蛋白E基因敲除小鼠(ApoE-/-小鼠)[4]和高脂飲食兔等模型的建立。前者由于實(shí)驗(yàn)過程復(fù)雜，成本較高，故不易推廣；后者其脂代謝雖與人類有相似之處，但由于造模時(shí)間過長(zhǎng)，且高脂飲食改變兔的飲食結(jié)構(gòu)，容易使其發(fā)生膽固醇貯積癥繼發(fā)感染而死亡。本實(shí)驗(yàn)試圖通過高脂飲食聯(lián)合球囊剝脫法建立AS兔模型，加之飼喂方便、易獲得且成本低，故可行性較高；同時(shí)對(duì)高脂飲食后兔的血糖和胰島素指數(shù)進(jìn)行分析，驗(yàn)證高脂飲食可誘發(fā)IR，進(jìn)一步探討IR可能對(duì)AS發(fā)生、發(fā)展有一定促進(jìn)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

20只普通級(jí)雄性新西蘭白兔，體質(zhì)量2.0～2.5kg, 購自天津醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部[SCXK(津)2018-8-001]。將兔單籠喂養(yǎng)普通飼料1周，溫度22～26℃，相對(duì)濕度50%～60%，12 h晝夜循環(huán)，自由攝食及飲水，隨后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑和儀器設(shè)備

羅氏全自動(dòng)生化分析儀7200購自德國(guó)羅氏診斷公司，低速臺(tái)式離心機(jī)DT5-6購自北京時(shí)代北利公司，LEICADM LB2 型雙目顯微鏡購自德國(guó)Leica公司，普通球囊(2.0～2.5) mm×20 mm、0.014''×185 cm ATW PTCA引導(dǎo)鋼絲和球囊擴(kuò)張壓力泵均購自美國(guó)Cordis公司。胰島素放免測(cè)定試劑盒(天津九鼎醫(yī)學(xué)生物工程有限公司)，血糖儀及試紙(Medisafe，上海泰爾茂醫(yī)療產(chǎn)品有限公司)，膽固醇(天津市瑞科生物技術(shù)有限公司)，蛋黃粉和豬油(天津安賽商貿(mào)有限公司)。

1.3 干預(yù)措施

所有兔連續(xù)飼喂高脂飼料(普通顆粒飼料+4%膽固醇+10%豬油+10%蛋黃粉)12周，允許兔自由攝水。

在高脂飼喂養(yǎng)1周后，實(shí)施頸總動(dòng)脈內(nèi)膜損傷術(shù)：(1)動(dòng)物術(shù)前12 h禁食，不禁水，稱重、麻醉(肌肉注射l mg/kg速眠新，吉林省華牧動(dòng)物保健品有限公司，批號(hào)00115821)，固定于手術(shù)臺(tái)上；(2)剪去頸部體毛, 剃毛直徑7 cm，常規(guī)消毒鋪巾; (3)沿頸部正中切開皮膚5.0 cm左右，分離皮下組織及肌肉，暴露并游離左側(cè)頸總動(dòng)脈3.0～4.0 cm; (4)于甲狀軟骨上方水平分離左側(cè)頸內(nèi)、外動(dòng)脈，分別用動(dòng)脈夾臨時(shí)夾閉頸總動(dòng)脈近心端及頸內(nèi)動(dòng)脈; (5)頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)心端結(jié)扎，近心端用線提起，距頸內(nèi)、外動(dòng)脈分叉點(diǎn)0.5 cm 約45°角“v”形剪開頸外動(dòng)脈；(6)插入引導(dǎo)鋼絲，在鋼絲引導(dǎo)下逆行插入球囊約10.0 cm;(7)連接球囊擴(kuò)張壓力泵, 注入肝素生理鹽水, 膨至303.975～ 405.300 kPa，自近心端緩慢回拉，回拉有阻力時(shí)表明球囊直徑與血管吻合，反復(fù)3次后撤出球囊導(dǎo)管、導(dǎo)絲; (8)結(jié)扎左頸外動(dòng)脈近心端，使左頸總、頸內(nèi)動(dòng)脈恢復(fù)血流，縫合皮膚；(9)從耳緣靜脈給予肝素200 U/kg，傷口處灑入4萬 U慶大霉素(華北制藥集團(tuán)有限公司，批號(hào)：070501)預(yù)防感染，術(shù)后連續(xù)3d每日肌肉注射40萬U青霉素。術(shù)后于普通飼料飼喂3 d后改為高脂飼料飼喂，每只每日80g，持續(xù)至12周。

1.4 血液指標(biāo)檢測(cè)

分別于高脂飼喂前及飼喂12周后空腹取兔耳緣靜脈血測(cè)定總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、甘油三酯(TG)、空腹血糖(FBG)及空腹胰島素(FSI),計(jì)算胰島素敏感指數(shù)(ISI)和穩(wěn)態(tài)模型-胰島素抵抗(HOMA-IR)水平, 血脂、血糖、胰島素水平差異大者不用作實(shí)驗(yàn)。20只兔均行頸總動(dòng)脈內(nèi)膜球囊損傷后予高脂飼料喂養(yǎng)。ISI的計(jì)算方法: ISI=1/(FSI, mIU/L)×(FBG, mmol/L)，HOMA-IR的計(jì)算方法：HOMA-IR =(FSI, mIU/L)×(FBG, mmol/L)/22.5。分析HOMA-IR與血脂的相關(guān)性。

1.5 組織病理學(xué)觀察

處死兔后, 根據(jù)球囊損傷術(shù)中球囊導(dǎo)管進(jìn)入的深度及損傷長(zhǎng)度, 截取損傷段頸總動(dòng)脈1.5～ 2.0 cm,生理鹽水沖洗后以體積分?jǐn)?shù)10%甲醛溶液固定及石蠟包埋, 蘇木素伊紅(HE)染色, 直視下觀察粥樣斑塊形態(tài), 病理切片厚度為5 μm, 光學(xué)顯微鏡觀察。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 一般情況

2只兔死于頸總動(dòng)脈球囊損傷術(shù)后感染，2只兔于飼喂高脂飼料3周后出現(xiàn)腹瀉，及時(shí)調(diào)整進(jìn)食結(jié)構(gòu)后好轉(zhuǎn)，腹瀉消失，繼續(xù)用于實(shí)驗(yàn)。

2.2 高脂飼喂前后兔體質(zhì)量及血脂變化

高脂飼喂12周后，可見體質(zhì)量、TC、TG、LDL-C顯著升高, HDL-C顯著降低(P＜0.01)(表1)。

2.3 高脂飼喂前后兔血糖及胰島素變化

高脂飼喂12周后，可見FBG無明顯變化(P=0.550)。FSI及HOMA-IR顯著升高，ISI顯著降低(P＜0.01)(表2)。

2.4 HOMA-IR與血脂的相關(guān)分析

經(jīng)Pearson直線相關(guān)分析, 結(jié)果顯示: HOMA-IR與TG存在正相關(guān)(r=0.52,P=0.039)，回歸方程為2.416+0.065X，與TC、LDL、HDL無相關(guān)性(P＞0.05).

表 1 高脂飼喂前后兔的體質(zhì)量及血脂情況

表 2 高脂飼喂前后血糖及胰島素情況(

表 2 高脂飼喂前后血糖及胰島素情況(

注: 與高脂飼喂前比較, *P＞0.05, **P＜0.01

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2.5 病理形態(tài)學(xué)結(jié)果

(1)肉眼觀察: 解剖見高脂飼喂12周后，肝臟體積增大，表面光滑，邊緣鈍，色發(fā)白，質(zhì)軟，比重輕，肝臟明顯脂肪肝改變(圖1A)。高脂飼喂后兔頸總動(dòng)脈管腔壁增厚，可見突起于內(nèi)膜表面的散在的、大小不等的黃白色脂質(zhì)條紋及隆起的脂質(zhì)斑塊形成(圖1B)。(2)光學(xué)顯微鏡觀察: 高脂飼喂前，可見兔頸動(dòng)脈內(nèi)膜光滑，未見脂紋或脂斑，上皮細(xì)胞完整，中膜無增生(圖2A); 經(jīng)高脂飼喂12周后，兔頸動(dòng)脈未行球囊損傷側(cè)頸動(dòng)脈內(nèi)膜絕大部分光滑，僅局部見稍微隆起于腔內(nèi)的脂斑，其內(nèi)可見少量泡沫細(xì)胞(圖2B); 頸動(dòng)脈球囊損傷聯(lián)合高脂飼喂12周后可見頸總動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞脫落，多數(shù)血管可見粥樣斑塊或纖維板塊，內(nèi)膜下可見大量炎性細(xì)胞(泡沫細(xì)胞和淋巴細(xì)胞)浸潤(rùn)，斑塊中可見新生血管; 中層平滑細(xì)胞排列紊亂，胞質(zhì)嗜酸性平滑肌細(xì)胞減少, 代之以大量胞質(zhì)淡染和充滿脂質(zhì)空泡的泡沫細(xì)胞，彈力纖維斷裂、溶解，斑塊向管腔凸出，膠原增生(圖2C和圖2D)。

3 討論

圖1 高脂喂養(yǎng)12周后兔肝臟及頸動(dòng)脈肉眼觀察

圖 2 兔頸動(dòng)脈病理學(xué)觀察

AS是一種慢性炎癥反應(yīng)性疾病，常累及大、中動(dòng)脈。相關(guān)研究[5,6]提示，高脂血癥能夠激活體內(nèi)炎癥免疫反應(yīng)，致使血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，功能紊亂，是AS的始動(dòng)因素。我們通常所提的IR是指當(dāng)單位胰島素生物學(xué)功能下降時(shí)，外周組織利用葡萄糖發(fā)生障礙，導(dǎo)致血糖水平顯著上升, 評(píng)估IR程度的定量指標(biāo)主要是HOMA-IR,HOMA-IR越高，說明IR越嚴(yán)重[7]。代謝性疾病發(fā)病的主要關(guān)鍵環(huán)節(jié)是IR, 并且IR與某些心臟病(如冠狀動(dòng)脈粥樣型)的發(fā)病因素有關(guān), 其中AS最初的明顯變化就是動(dòng)脈血管內(nèi)皮發(fā)生異常, 血管壁受傷可導(dǎo)致脂質(zhì)聚集, 并導(dǎo)致血管內(nèi)膜纖維化和增生, 血管壁變厚, 而管腔狹窄和血脂代謝異常可導(dǎo)致血液黏稠度增加，而流動(dòng)性減小，脂質(zhì)聚集于損傷的血管內(nèi)壁并逐漸形成斑塊，尤其是易損斑塊，在受到刺激后斑塊破裂，血栓沉渣可堵塞血管腔，誘發(fā)急性缺血性疾病。而IR與內(nèi)皮功能紊亂和炎癥因子又有著密切的關(guān)聯(lián)[8]，同時(shí)還可誘發(fā)高血糖狀態(tài)，從而誘導(dǎo)載脂蛋白C3(APOC3)基因的轉(zhuǎn)錄及表達(dá), 進(jìn)而引起富含甘油三酯的脂蛋白(triglyceride-rich lipoproteins, TRLs)代謝紊亂[9],導(dǎo)致血脂異常，激活體內(nèi)炎癥因子，從而進(jìn)入惡性循環(huán)。因此，建立合適的IR的AS動(dòng)物模型有助于更好地了解AS斑塊形成的確切機(jī)制。

本實(shí)驗(yàn)建立了18只兔的頸總動(dòng)脈粥樣硬化斑塊模型，高脂飼養(yǎng)12周后均出現(xiàn)高TG和高TC血癥，體質(zhì)量均明顯增加，通過HOMA-IR計(jì)算提示亦同樣出現(xiàn)IR，經(jīng)Pearson直線相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)HOMA-IR與TG存在正相關(guān)，提示高TG血癥、肥胖、IR三者之間確實(shí)存在一定相關(guān)性，前期研究[10,11]也發(fā)現(xiàn)，肥胖人群中存在糖脂代謝異常、體脂水平增高及IR。而對(duì)于IR動(dòng)物模型的制作，兔形成的粥樣斑塊與人類相似性較高，是AS的易感動(dòng)物，因此常選兔制作AS模型[12]。本實(shí)驗(yàn)通過病理觀察表明，高脂飼喂12周后，未損傷側(cè)兔頸總動(dòng)脈僅局部見稍微隆起于腔內(nèi)的脂斑，少量泡沫細(xì)胞；而球囊損傷側(cè)兔頸總動(dòng)脈斑塊較大，內(nèi)含有纖維組織，泡沫細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，明顯隆起突入管腔，彈力纖維斷裂、溶解，符合不穩(wěn)定性AS斑塊的特征。球囊損傷可使得兔頸總動(dòng)脈受到創(chuàng)傷性刺激，血管內(nèi)皮損傷，激活氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，不斷加重血管內(nèi)壁細(xì)胞和組織損傷，為頸總動(dòng)脈粥樣硬化病變和斑塊性質(zhì)創(chuàng)造了條件; 高脂飲食不僅可導(dǎo)致血脂代謝異常，還可影響基質(zhì)金屬蛋白酶的降解，也是推動(dòng)病變進(jìn)程的重要條件。

目前對(duì)于飼喂高脂飼料建立動(dòng)物模型的研究?jī)H僅局限于對(duì)AS的研究或者IR的研究，很少有研究將兩者結(jié)合起來。本實(shí)驗(yàn)成功建立了頸總動(dòng)脈粥樣硬化合并IR的動(dòng)物模型，符合AS合并IR的形成機(jī)制，模擬了人類代謝綜合征的形成過程，在生理、病理及藥物學(xué)效應(yīng)方面為冠心病的研究提供了可靠的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。