朱麗坤, 曹 爽, 蔣仕林, 尹曉琳

(河北省中醫(yī)院/河北醫(yī)科大學(xué)免疫教研室, 石家莊 050017)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病最常見的微血管炎癥的并發(fā)癥，主要表現(xiàn)為毛細(xì)血管間腎小球硬化癥，是1型糖尿病的主要死因，其機制復(fù)雜，以促炎因子為特征的慢性炎癥已被公認(rèn)為是其發(fā)生的機制之一[1]。近年來不少中藥用于治療DN有明顯的療效，黃芪的應(yīng)用也取得了一定的研究進展。黃芪是豆科植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的根，其性微溫，可入肺經(jīng)和脾經(jīng)，具有補氣健脾、升陽舉陷、益衛(wèi)固表、利尿消腫等功效[2]。已有研究發(fā)現(xiàn)，黃芪對細(xì)胞免疫、體液免疫和單核-巨噬細(xì)胞吞噬功能均有良好的促進作用，且臨床上用于治療DN有明顯的療效[3]。黃芪注射液是以黃芪為原料進行提取加工后的產(chǎn)物。db/db小鼠(diabetes mouse)由C57BL/KsJ近親交配常染色體隱性遺傳衍化而來，屬Ⅱ型糖尿病模型，在4周齡開始貪食及發(fā)胖，繼而產(chǎn)生高血糖、高血胰島素、胰高血糖素等，發(fā)生嚴(yán)重的糖尿病癥狀，并有明顯的腎病，一般在10個月內(nèi)死亡。本次研究旨在通過檢測db/db小鼠炎癥細(xì)胞和炎癥因子的表達(dá)，探討黃芪注射液對于DN免疫細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用，為完善黃芪注射液治療DN的免疫作用機制提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

4周齡SPF級C57BL/6小鼠購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[SCXK(京)2019-0009]，4周齡SPF級db/db小鼠購自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物中心[SCXK(京)2016-0010]，飼養(yǎng)于河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心[SYXK(冀)2018-003]。

1.2 主要儀器與試劑

全自動血細(xì)胞分析儀Sysmex 1800i, 購自日本Sysmex公司; 實時定量PCR儀, 購自美國AB公司; 流式細(xì)胞儀，購自美國BD公司；全自動酶標(biāo)儀，購自美國Bio Tek公司; NanoDrop核酸濃度測量儀，購自美國Thermo Scientific公司；黃芪注射液(含黃芪生藥1g/mL)，購自神威藥業(yè); 白細(xì)胞介素10(IL-10)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)的ELISA試劑盒購自RayBiotec公司; IL-10、IL-1β、單核細(xì)胞趨化蛋白1(MCP-1)和TNF-α的mRNA檢測試劑盒購自生工公司；Real-time試劑盒購自日本TaKaRa公司；流式抗CD4、CD25、FoxP3標(biāo)記抗體購自美國BD公司。

1.3 方法

1.3.1 動物處理及取材 C57BL/6鼠10只，雌雄各半，為對照組；db/db小鼠20只，雌雄各半，分為2組,每組10只，分別為糖尿病組和黃芪注射液治療組。對照組、糖尿病組小鼠每只每日腹腔注射100 μL PBS，黃芪注射液治療組小鼠按體質(zhì)量每只每日腹腔注射100 μL黃芪注射液(濃度為1 g/mL)(因黃芪中的黃芪多糖經(jīng)口給藥難以被吸收進入血液，故在此選擇腹腔注射的方式)，注射時間為12周。12周后摘除眼球取血，進行外周血白細(xì)胞計數(shù)及分類測定，提取血清測定細(xì)胞因子，取腎臟和脾臟組織分別進行Real -time PCR和流式細(xì)胞儀檢測。

1.3.2 小鼠白細(xì)胞計數(shù)和分類檢測 全自動血細(xì)胞分析儀測定小鼠白細(xì)胞計數(shù)及分類。

1.3.3 血清中IL-10和TNF-α的表達(dá)檢測 按照ELISA試劑盒說明書進行操作。

1.3.4 目的基因mRNA表達(dá)檢測水平 提取小鼠腎臟組織的總RNA并對其濃度進行測定，RNA純度A260/A280在1.8～2.1。將上述總RNA反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，然后以cDNA為模板, 擴增β-actin(內(nèi)參),IL-1β, TNF-α和MCP-1。循環(huán)參數(shù)：總體積為10 μL，預(yù)變性 95 ℃ 30 s; PCR反應(yīng): 95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s；40個循環(huán)。數(shù)據(jù)處理使用相對定量值做統(tǒng)計學(xué)分析，柱形圖用平均值做。

1.3.5 脾臟中調(diào)節(jié)T細(xì)胞(Tregs)檢測 將脾臟研磨液置于離心管中, 離心棄上清，洗滌細(xì)胞后調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1×106/mL，每管0.1 mL。試驗管加CD4和CD25各2 μL，避光保存20 min。洗滌后，加入破膜劑，再加入抗FoxP3抗體2μL。孵育20 min后，洗滌，再加入4%多聚甲醛溶液0.1mL放置10 min，后加蒸餾水2 mL放置10 min。離心棄上清后，用PBS懸起細(xì)胞，于流式細(xì)胞儀檢測Tregs。

1.3.6 統(tǒng)計學(xué)分析 實驗均重復(fù)3次, 用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。所有數(shù)據(jù)均以s表示，組間比較采用方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 外周血白細(xì)胞數(shù)量、中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞百分比

發(fā)現(xiàn)糖尿病組小鼠白細(xì)胞計數(shù)、中性粒細(xì)胞百分比和單核細(xì)胞百分比與對照組比較明顯上升，經(jīng)過黃芪注射液治療后的糖尿病小鼠的白細(xì)胞計數(shù)、中性粒細(xì)胞百分比和單核細(xì)胞百分比均明顯下降(P＜0.05)(表1)。

2.2 黃芪注射液對血清中細(xì)胞因子變化的影響

糖尿病組小鼠的IL-10的含量與對照組比較明顯降低(P＜0.05); 黃芪注射液治療組小鼠IL-10的含量與糖尿病組比較有顯著升高(P＜0.05)。糖尿病組小鼠TNF-α的含量顯著高于對照組(P＜0.05);黃芪注射液治療組TNF-α的含量與糖尿病組相比又明顯降低(P＜0.05)(表2)。

表 1 不同組別小鼠白細(xì)胞計數(shù)、中性粒細(xì)胞百分比、單核細(xì)胞百分比的數(shù)值比較

表 2 不同組別小鼠血清IL-10和TNF-α的含量 pg/mL

2.3 小鼠腎臟炎癥因子的mRNA表達(dá)

與對照組小鼠IL-1β mRNA的表達(dá)量(0.97±0.31)相比，糖尿病組 (10.43±2.41)有明顯升高(P＜0.05)，而治療組(0.49±0.36)與糖尿病組相比則顯著降低(P＜0.05)。

與對照組小鼠MCP-1 mRNA的表達(dá)量(0.93±0.13)相比，糖尿病組(4.93±0.58)有明顯增高趨勢(P＜0.05)，而治療組(0.46±0.14)與糖尿病組相比有顯著降低趨勢(P＜0.05)。

與對照組小鼠TNF-α mRNA表達(dá)量(0.97±0.03)相比，糖尿病組(4.63±0.87)有明顯升高(P＜0.05)，而治療組(1.35±0.57)與糖尿病組相比有明顯降低(P＜0.05)。

2.4 黃芪對脾臟中Tregs細(xì)胞的影響

對照組小鼠的Tregs為2.42%±1.02%，糖尿病組的Tregs為3.53%±1.51%，黃芪注射液治療組為4.99%±2.53%(圖1)。黃芪注射液治療組與糖尿病組和對照組比較均明顯增加(P＜0.05)。

3 討論

DN是糖尿病患者最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一。DN的發(fā)生和發(fā)展過程中有許多炎癥因子的參與，例如，轉(zhuǎn)化生長因子β、白細(xì)胞介素家族、趨化因子、黏附分子、Toll樣受體、脂肪因子、血管內(nèi)皮生長因子等激發(fā)一系列的炎癥信號通路導(dǎo)致腎小管及腎間質(zhì)纖維化、細(xì)胞外基質(zhì)增厚，最終導(dǎo)致腎臟功能障礙[4]。目前，臨床上應(yīng)用黃芪治療DN已有一定的療效，但其作用機制尚不完全清楚。我們通過對免疫細(xì)胞及細(xì)胞因子的研究，探索DN的炎癥反應(yīng)及免疫作用機制。

有研究[5]表明，黃芪能夠提高中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的吞噬以及殺菌功能，能夠促進細(xì)胞免疫以及體液免疫,但在糖尿病患者中黃芪能否減弱這些細(xì)胞的浸潤，延緩DN發(fā)生還未見報道。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過黃芪注射液治療的糖尿病小鼠白細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞百分比和單核細(xì)胞百分比較對照組均顯著下降，證實了黃芪注射液有抑制炎癥反應(yīng)的作用。外周血白細(xì)胞的變化有望作為臨床輔助檢查，為DN患者的診斷與治療效果的評估提供科學(xué)依據(jù)。

有研究[6]證實，糖尿病早期無腎病等并發(fā)癥時, IL-10在炎性因素的刺激下水平升高, 而隨著糖尿病并發(fā)癥的出現(xiàn), IL-10水平下降。本實驗發(fā)現(xiàn)糖尿病組的IL-10水平低于正常對照組, 而黃芪注射液治療組中黃芪注射液可以增加db/db鼠的Tregs數(shù)量, 并增加IL-10 的表達(dá)。這一現(xiàn)象說明黃芪注射液可能通過調(diào)節(jié)Tregs的數(shù)量和IL-10的表達(dá)抑制炎癥反應(yīng)，預(yù)防腎臟炎癥的發(fā)生。

圖 1 黃芪注射液對小鼠脾臟中Tregs細(xì)胞的影響

在DN發(fā)展過程中, 巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞及腎小管上皮細(xì)胞等被激活后可以分泌TNF-α等促炎因子，使炎性反應(yīng)細(xì)胞聚集與黏附，循環(huán)微血管擴張，通透性增強，參與了腎小球組織損傷[7]。本研究發(fā)現(xiàn)糖尿病組小鼠血清中TNF-α的水平升高，而黃芪注射液治療組小鼠的TNF-α的血清蛋白表達(dá)水平與糖尿病組比較有所降低。說明黃芪注射液具有降低TNF-α的蛋白表達(dá)水平、減輕炎癥反應(yīng)、延緩DN的進展的作用。從炎癥因子基因表達(dá)水平看，db/db小鼠經(jīng)黃芪注射液治療后,腎臟的IL-1β、MCP-1和TNF-α的表達(dá)水平與治療前相比均有顯著降低，這與之前的相關(guān)文獻較一致，MCP-1可以促進巨噬細(xì)胞中單核細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生多種細(xì)胞因子如IL-6和TNF-α等，可誘導(dǎo)血管壁中的動脈粥樣硬化，導(dǎo)致疾病進展，IL-1可修飾血管通透性和增加趨化因子的表達(dá)，從而導(dǎo)致腎小球膜細(xì)胞外基質(zhì)的增殖和合成[8]。而治療組小鼠這幾個炎癥因子的顯著降低說明了黃芪注射液具有調(diào)節(jié)db/db小鼠腎臟的炎癥作用。為臨床應(yīng)用黃芪注射液治療DN提供可靠的實驗依據(jù)，但其具體的作用機制有待進一步研究。