王天祎，侯佳佳，王超男，鮑宇暉，王建舫，李 佳，崔德鳳，張永紅

(北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/獸醫(yī)學(xué)(中醫(yī)藥)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206)

芹菜素是一種尚未開發(fā)利用完全的天然黃酮類化合物[1-2]，在水果、蔬菜中廣泛存在[3]。芹菜素具有廣泛的藥理作用，研究表明芹菜素對(duì)多種腫瘤均具有預(yù)防、抑制生長(zhǎng)、促進(jìn)腫瘤凋亡的作用機(jī)制[4-7]；對(duì)多種原因?qū)е碌那傲邢?、肝臟等組織器官的病變具有防護(hù)的作用，其對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變具有一定的預(yù)防作用[8-10]；芹菜素還具有抗氧化、抗菌、抗過敏、抗病毒、防護(hù)輻射損傷及預(yù)防高血壓等作用[11-13]。

目前，芹菜素的制備主要是以洋苷菊為原料[14]，但此種方法制備出來的芹菜素含量很低，導(dǎo)致芹菜素的生產(chǎn)率低下，生產(chǎn)成本偏高，限制芹菜素的廣泛應(yīng)用。目前有學(xué)者從亮葉楊桐葉中提取芹菜素，在亮葉楊桐葉的水提液中加入一定量的硫酸，加熱酸解，即可得到純度為64.80%芹菜素的粗提品[7]。田東等[15]選用以含二醇基固定相的微徑柱為第一維親水保留色譜(Hydrophilic Interaction Chromatography，HILIC)分離柱，含C18實(shí)心微球固定相的快速柱為第二維反相液相色譜(Reversed Phase Liquid Chromatography，RPLC)分離柱，構(gòu)建分離滁菊中多酚類化合物的親水保留色譜/反相液相色譜(Hydrophilic Interaction Chromatography/Reversed Phase Liquid Chromatography，HILIC/RPLC)二維系統(tǒng)，分離得到23個(gè)包含芹菜素的獨(dú)立色譜峰。由此可見，將二維色譜分離技術(shù)應(yīng)用于中藥及其他植物成分的分離制備是可行的。

二維液相分離系統(tǒng)通常是將高效液相色譜(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)與固相萃取(Solid-Phase Extraction，SPE)兩種裝置串接在一起進(jìn)行分離[16-17]，可以將一個(gè)特別復(fù)雜的成分在短時(shí)間內(nèi)制備分離純化[18]。本研究采用的二維高通量分離制備色譜系統(tǒng)，由主分離柱、18根捕獲柱和6根二次分離柱，蠕動(dòng)泵、組分分析軟件、紫外檢測(cè)(Ultraviolet，UV)檢測(cè)器等組成。樣品在每個(gè)固相捕獲柱捕獲到相對(duì)應(yīng)的樣品餾分，這些樣品餾分經(jīng)過洗脫后進(jìn)入二維分離柱，得到純度較高的多種餾分。二維高通量分離制備色譜系統(tǒng)的檢測(cè)靈敏度、分離能力、保留時(shí)間和峰面積都達(dá)到較優(yōu)的水平[16]；節(jié)省大量時(shí)間，擁有單次超高峰容量[19]；節(jié)約成本，它獨(dú)特的功能不僅降低溶劑和閥的成本，而且還在現(xiàn)有的液相色譜儀上進(jìn)行新的突破[20-22]。這些特性使二維液相色譜將取代許多傳統(tǒng)的分離方法用于進(jìn)行復(fù)雜樣品的制備分離[23]。

因芹菜中芹菜素含量較高[24]，本研究旨在利用在線二維反相液相色譜法從芹菜中提取制備芹菜素，并采用高效液相色譜、核磁及質(zhì)譜進(jìn)行分析鑒定，以建立操作簡(jiǎn)單的芹菜素提取制備法。

1 材料和方法

1.1 儀器、試劑與材料

二維高通量分離制備色譜系統(tǒng)(Sepbox 2D-250)；高效液相色譜(Waters e2695-2998/2424)；核磁共振儀(Thermo)；液-質(zhì)聯(lián)用儀(LCQ Fleet)；核酸蛋白檢測(cè)儀(NanoDrop2000)；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司)；高速粉碎機(jī)(鑫田企業(yè)有限公司)；電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)；超純水制備儀(上海力康發(fā)展有限公司)；真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)

乙腈、甲醇(液相級(jí)、色譜級(jí)，賽默飛世爾科技有限公司)；無水乙醇(分析純，北京化工廠)；磷酸(MOS級(jí)，北京化學(xué)試劑公司)；重水(北京百靈威科有限公司)；C4粉(液相級(jí)，ssigma)；芹菜素標(biāo)準(zhǔn)品(液相級(jí)，sigma)。

新鮮芹菜，2017年8月購(gòu)于北京市昌平區(qū)回龍觀城北市場(chǎng)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 流動(dòng)相的制備 0.4%磷酸溶液：取磷酸溶液4 mL，加996 mL的超純水，混勻備用；分別將甲醇、乙腈、0.4%磷酸溶液和超純水過濾，超聲排氣備用。

1.2.2 樣品的制備 將新鮮的芹菜洗凈，分離根莖和葉；芹菜葉剪碎后在65 ℃鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)烘干后粉碎；稱取芹菜葉粉末40.0 g于500 mL錐形瓶中，加入95%乙醇400 mL，將錐形瓶放入超聲機(jī)中，設(shè)定超聲功率為250 W，溫度為65 ℃，提取0.5 h；用孔徑為0.45 μm的濾膜真空抽濾，將提取液和濾渣分離；濾渣中再次加入95%乙醇溶液280 mL，超聲提取0.5 h；重復(fù)前一步驟2次；將3次提取的濾液合并，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干燥，用一定體積甲醇溶出，即為芹菜粗提樣品。稱取該芹菜粗提樣品4 g與12 g C4粉混合于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中，加入約150 mL甲醇，超聲使其溶解完全；置35 ℃，60 r/min旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去甲醇，得到干燥的粉末狀芹菜樣品。

1.2.3 二維液相色譜的制備分離 將進(jìn)樣柱底端用200 mg C4填實(shí)，再取制備好的芹菜樣品1 g填實(shí)，最后用C4粉將進(jìn)樣柱填滿，連入全自動(dòng)二維液相分離系統(tǒng)，用1.2.1的流動(dòng)相洗脫。利用構(gòu)建的二維液相色譜軟件系統(tǒng)進(jìn)行分析，篩選最適二維液相分離色譜條件，對(duì)芹菜樣品進(jìn)行分離純化，收集各餾分備用，其中以待測(cè)樣品為芹菜素樣品。

1.2.4 高效液相色譜檢測(cè) 取芹菜素標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg，加入少量甲醇溶解，用30%乙醇定容至100 mL；選用核酸蛋白檢測(cè)儀(NanoDrop2000)的UV-VIS(紫外-可見光吸收光譜，Ultraviolet-visible spectroscopy)程序?qū)η鄄怂貥?biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行200～800 nm全波長(zhǎng)掃描，以30%乙醇作為基點(diǎn)進(jìn)行調(diào)零，確定芹菜素的最適吸收波長(zhǎng)。

稱取芹菜素標(biāo)準(zhǔn)品5 mg，用甲醇定容于10 mL容量瓶中，制成0.5 mg/mL的芹菜素標(biāo)準(zhǔn)品溶液。分別取0.5 mg/mL的芹菜素標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.2、0.4、0.8、1.6、2.4、3.2 mL，用甲醇定容至10 mL，制成0.01、0.02、0.04、0.08、0.12、0.16 mg/mL的芹菜素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，過濾進(jìn)行高效液相色譜檢測(cè)。以芹菜素標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度作為橫坐標(biāo)，峰面積值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程。

將1.2.2制備各個(gè)餾分，過濾、吸取10 μL進(jìn)行高效液相色譜檢測(cè)，確定含有芹菜素的餾分。

1.2.5 核磁共振檢測(cè) 對(duì)芹菜素標(biāo)準(zhǔn)品和芹菜素樣品進(jìn)行化學(xué)成分表征。將5 mg芹菜素標(biāo)準(zhǔn)品及含有芹菜素的餾分分別溶解于0.3 mL重水中，轉(zhuǎn)移至核磁管中，進(jìn)行核磁共振檢測(cè)，利用分析軟件分析，即可獲得該餾分的一維1H-NMR譜以及一維13C-NMR譜，從而可以確定所得到的樣品餾分是否為芹菜素。

1.2.6 質(zhì)譜檢測(cè) 對(duì)芹菜素標(biāo)準(zhǔn)品和芹菜素樣品進(jìn)行定性分析。將5 mg芹菜素標(biāo)準(zhǔn)品及芹菜素樣品餾分分別溶解于0.5 mL甲醇中，過濾、檢測(cè)，通過相應(yīng)軟件分析，獲得該餾分的化學(xué)組成，與芹菜素標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比對(duì)。

1.3 色譜條件

二維液相主成分分離色譜條件：流動(dòng)相為甲醇、乙腈、水，梯度洗脫，條件見表1。

分析型反相色譜條件：博納愛爾杰Venusil ASB C18色譜柱，流動(dòng)相：甲醇、0.4%磷酸水溶液(甲醇和0.4%磷酸水溶液體積比為1∶1)，柱溫：28 ℃，流速：0.8 mL/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：346 nm，進(jìn)樣量：芹菜素標(biāo)準(zhǔn)品和芹菜素樣品均為10 μL。

表1 Sepbox 2D-250二維液相主成分分離色譜檢測(cè)條件Tab.1 Sepbox 2D-250 Detection conditions of 2D-LC main separation chromatography

2 結(jié) 果

2.1 分離結(jié)果

芹菜樣品的二維液相分離如圖1所示。芹菜中活性成分組分按色譜峰觸發(fā)模式，同一色譜峰收集一次。芹菜的二維液相色譜二次分離，共分15個(gè)步驟，收集84個(gè)餾分樣品，將同一峰收集到的餾分樣品進(jìn)行合并收集，離心管做好標(biāo)記。

2.2 紫外最適吸收波長(zhǎng)的確定

芹菜素的紫外光譜中由三個(gè)主要的吸收峰組成，其中一個(gè)出現(xiàn)在200 nm，一個(gè)在270 nm，另一個(gè)在346 nm附近(圖2)。346 nm處波長(zhǎng)相比于其他兩處吸收峰更加規(guī)則和穩(wěn)定，有利于芹菜素在液相條件下的檢測(cè)。選擇346 nm為芹菜素的檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.3 高效液相色譜檢測(cè)

芹菜素標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖3。將所收集到的84個(gè)餾分分別進(jìn)行高效液相色譜檢測(cè)，圖4A為芹菜素標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖。圖4B為芹菜樣品經(jīng)二維液相色譜分離后的19號(hào)餾分高效液相色譜圖。從圖4中可以看出，19號(hào)餾分與芹菜素標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間分別是19.295 min和19.646 min，且都只有一個(gè)主要的色譜峰，二者基本沒有差異。表明19號(hào)餾分的主要成分為芹菜素。

圖1 主成分分離色譜圖Fig.1 Main separation

圖2 芹菜素標(biāo)準(zhǔn)品溶液200～800 nm全波長(zhǎng)掃描圖譜Fig.2 200-800 nm UV absorption wavelength of apigenin standard

圖3 芹菜素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve of apigenin

2.4 核磁檢測(cè)結(jié)果

以質(zhì)譜和核磁共振對(duì)19號(hào)餾分-芹菜素和芹菜素標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行分析[25]。圖5A和圖5B分別為芹菜素標(biāo)準(zhǔn)品和19號(hào)餾分核磁檢測(cè)的C譜圖和H譜圖；對(duì)比芹菜素標(biāo)準(zhǔn)品和芹菜樣品的檢測(cè)結(jié)果圖5可知，19號(hào)餾分與芹菜素標(biāo)準(zhǔn)品核磁檢測(cè)圖像基本一致，表明19號(hào)餾分為芹菜素。芹菜素的化學(xué)結(jié)構(gòu)為C15H10O5。

2.5 質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果

圖6分別是芹菜素標(biāo)準(zhǔn)品與19號(hào)餾分質(zhì)譜檢測(cè)的結(jié)果，對(duì)比二者的質(zhì)譜圖可發(fā)現(xiàn)19號(hào)餾分的圖譜與芹菜素標(biāo)準(zhǔn)品基本相同，表明19號(hào)餾分物質(zhì)結(jié)構(gòu)符合芹菜素標(biāo)準(zhǔn)品的基本結(jié)構(gòu)。19號(hào)餾分化學(xué)

圖4 芹菜素標(biāo)準(zhǔn)品(A)和19號(hào)餾分(B)高效液相色譜圖Fig.4 Chromatograms of apigenin standard and No.19 sample

圖5 芹菜素標(biāo)準(zhǔn)品核磁檢測(cè)13C譜圖和1H譜圖(A)和19號(hào)餾分核磁檢測(cè)13C譜圖和1H譜圖(B)Fig.5 13C-NMR spectra of standard and 1H-NMR spectra of standard (A) and 3C-NMR spectra of No.19 sample and 1H-NMR spectra of No.19 sample (B)

圖6 芹菜素標(biāo)準(zhǔn)品(A)和19號(hào)餾分(B)質(zhì)譜檢測(cè)圖Fig.6 MS/MS spectrum of standard and No.19 sample

成分為芹菜素。

3 討 論

本研究構(gòu)建在線二維反相液相色譜從芹菜中分離純化芹菜素的一套方法和流程，經(jīng)過反向高效液相色譜、核磁、質(zhì)譜三種方法的對(duì)比檢測(cè)，結(jié)果均顯示分離純化得到的19號(hào)餾分與芹菜素標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)結(jié)果基本一致。表明19號(hào)餾分即為芹菜素。說明芹菜樣品經(jīng)過二維液相色譜分離后可以快速得到芹菜素單品，且分離到的芹菜素純度較高達(dá)到99%，高于購(gòu)買的芹菜素標(biāo)準(zhǔn)品純度≥95%。

使用質(zhì)譜和核磁共振對(duì)其鑒定，確定獲得的化合物單品符合芹菜素的結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成。本研究所用方法操作簡(jiǎn)單、純化效率高，對(duì)于復(fù)雜樣品中芹菜素的制備純化具有極大的應(yīng)用價(jià)值。為芹菜素藥效作用的研究提供試驗(yàn)基礎(chǔ)，促使芹菜素在食品、藥用領(lǐng)域及畜牧業(yè)上的發(fā)展。

二維液相色譜進(jìn)行主成分分離色譜條件的選擇，擬定采用水和乙腈作為分離芹菜素的流動(dòng)相，采用紫外光檢測(cè)器和蒸發(fā)光散射檢測(cè)器共同檢測(cè)，所得到的樣品主成分分離圖的分離效果并不好，且兩個(gè)檢測(cè)器檢測(cè)效果差異并不大。將流動(dòng)相換成甲醇和水后，各組分所形成的峰數(shù)量變多，但各峰之間的分離程度不夠好，可見甲醇的分離效果比乙腈好。采用甲醇、乙腈、水三個(gè)流動(dòng)相，且檢測(cè)條件如表1時(shí)，得到的樣品主成分分離圖效果最好，各峰之間的分離程度足夠，故采用表1分離條件為芹菜素二維液相主成分分離色譜條件。

利用該方法分離芹菜樣品，共分15個(gè)步驟，收集84個(gè)餾分樣品。初步鑒定1個(gè)有效成分即芹菜素，而其他83個(gè)餾分有待進(jìn)一步研究。為后續(xù)鑒定奠定基礎(chǔ)?？傮w而言，該方法操作簡(jiǎn)便、分離效果好，為中藥等復(fù)雜體系的分離分析提供一種很好的方法。