霍艷穎，王夢婕，李 佳，姜代勛*，霍桂桃

(1. 北京農學院獸醫(yī)學(中醫(yī)藥)北京市重點實驗室，北京 102206；2. 中國食品藥品檢定研究院國家藥物安全評價監(jiān)測中心，北京 100176)

隨著中國家庭寵物飼養(yǎng)條件的改善和獸醫(yī)診療水平的提高，犬等動物的壽命得到很大提高。伴隨著犬老齡化的到來，犬心臟病的發(fā)病率大幅度升高，病犬主要表現(xiàn)出精神沉郁、食欲不振、咳嗽、呼吸困難、運動耐力降低、牙齦蒼白等癥狀。目前寵物診療機構主要應用多種西藥以減輕心臟負荷、增強心肌收縮力來緩解癥狀，寵物臨床上可供使用、有效治療犬心臟病的中藥方劑少之又少。

補坎益離丹是清末名醫(yī)鄭欽安為治療心病不安所設，主要用于心陽不足等心病的治療，至今對人心臟病仍有良好的治療作用[1-3]。中國歷來存在醫(yī)方人畜通用，醫(yī)理人畜互參的比較醫(yī)學體系。將補坎益離丹用于犬等動物心陽虛證的治療和研究將擴大該經典方劑的應用范圍。因該方劑中含有附子和桂心，傳統(tǒng)醫(yī)學認為二者均具有一定的毒性。本研究以小鼠為模型，研究補坎益離丹對其血常規(guī)、血生化指標及五臟組織細胞結構的影響，以確保補坎益離丹在犬等動物心陽虛證應用上的安全性，具有重要的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

試驗動物(昆明小鼠60只，雌雄各半，24～26 g)及飼料均由斯貝福生物技術有限公司提供，許可證號分別為：SCXK(京)2016-0002、SCXK(京)2015-0015。試驗在清潔級環(huán)境中進行，室溫27 ℃，相對濕度40%～70%，自然光線。飲用水為經高壓滅菌的自來水。小鼠采食、飲水不限。

1.2 主要試劑

附子、桂心、炙甘草、蛤粉購于北京同仁堂藥店大柵欄總店，生姜購于北京農學院家屬院便民商店，生化17項測試盒、血常規(guī)試劑盒購于愛德士生物科技公司，蘇木素伊紅染色試劑盒購于碧云天生物技術有限公司，其他試劑等購于北京化學試劑公司。

1.3 補坎益離丹的制備

補坎益離丹為清末名醫(yī)鄭欽安所創(chuàng)，包括附子八錢，桂心八錢，蛤粉五錢，炙甘草四錢，生姜5片。清朝一錢相當于現(xiàn)在的3.72 g，該方可換算成：附子30 g，桂心30 g，蛤粉19 g，炙甘草15 g，生姜5片(約60 g)。所有藥材在煎煮前浸泡30 min，將浸泡后的附子(制)放入砂鍋加入適量的蒸餾水，煎煮1 h。隨后加入桂心、蛤粉、炙甘草、生姜。先武火煮沸后，再文火煎1 h，倒出煎液。加入適量熱水進行二煎，文火再煎1 h，倒出煎液。合并2次煎液，濃縮至所需濃度。

1.4 慢性毒性試驗

昆明小鼠60只，雌雄各半，隨機平均分為空白組、低劑量組和高劑量組。適應性飼養(yǎng)5 d后，空白組每日灌胃生理鹽水0.5 ml、低劑量組每日灌胃0.1 g/mL補坎益離丹0.5 mL、高劑量組每日灌胃0.5 g/mL補坎益離丹0.5 mL，連續(xù)60 d。以50 kg成人體重為標準，補坎益離丹低劑量組相當于人常規(guī)用藥量，高劑量組相當于人常規(guī)用藥量的5倍。隨后各組小鼠摘眼球取血，IDEXX ProCyte Dx Hematology Analyzer檢測血常規(guī)指標，IDEXX Catalyst One Analyzer檢測血生化指標。取血后將小鼠脫椎處死，摘取肝臟、心臟、脾臟、肺臟、腎臟于4%多聚甲醛固定，常規(guī)方法制作組織切片。

1.5 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)以平均值±偏差表示，采用t-檢驗分析空白組與低劑量組、高劑量組差異顯著性。低劑量組、高劑量組與空白組比較，*表示差異顯著(P<0.05)。

2 結 果

2.1 臨床觀察

各組小鼠用藥期間被毛整潔，皮膚顏色正常，進食、飲水及生長狀況良好，對外界反應靈敏，未見異常分泌物等。試驗過程中，死亡7只小鼠。其中，空白組分別在第35天、第42天各死亡1只，低劑量組分別在第25天、第49天各死亡1只，高劑量組分別在第11天、第37天、第53天各死亡1只。

2.2 血常規(guī)指標結果

低劑量組、高劑量組與空白組比較，血常規(guī)主要指標如紅細胞數(shù)量、紅細胞比容、白細胞數(shù)量、中性粒細胞數(shù)量、淋巴細胞數(shù)量、單核細胞數(shù)量、血小板數(shù)量及血小板壓積等均未見明顯變化，差異不顯著(P>0.05)。低劑量組與空白組比較，平均紅細胞體積、網織紅細胞百分比、網織紅細胞顯著降低(P<0.05)，而嗜酸性粒細胞百分比顯著升高(P<0.05)。高劑量組與空白組比較，平均紅細胞體積、網織紅細胞百分比、平均血小板體積、血小板分布寬度顯著降低(P<0.05)，見表1。

表1 小鼠血常規(guī)指標Tab.1 Results of blood routine indexes in mice

2.3 生化指標結果

低劑量組、高劑量組與空白組比較，除低劑量組小鼠的尿素顯著高于空白組，存在顯著差異(P<0.05)外，其他生化指標均無顯著變化(P>0.05)，見表2。

表2 小鼠血生化指標Tab.2 Result of blood biochemical indexes in mice

2.4 組織切片

低劑量組、高劑量組與空白組比較，心臟心肌細胞均排列整齊、細胞核清晰完整、心肌纖維完整無斷裂；脾臟紅髓、白髓結構完整，無炎性細胞浸潤；肺臟肺泡囊、肺泡管均結構完整，無炎性細胞浸潤；腎臟腎小體、腎小管結構均完整，無炎性細胞浸潤；肝臟肝細胞排列整齊、細胞核清晰完整，無炎性細胞浸潤，見圖1。

3 討 論

血常規(guī)是臨床最普遍的檢查方法之一[4-6]，是指通過觀察血細胞的數(shù)量變化、形態(tài)分布以判斷血液狀況、輔助疾病診斷。血常規(guī)中的具體指標可敏感反映機體多種病理變化，其中以白細胞數(shù)、紅細胞數(shù)、血紅蛋白和血小板比較具有診斷價值。另外，血常規(guī)還是觀察藥物療效、副作用等常用參考指標。由于小鼠血液量少、易凝固，在檢測時一些樣品出現(xiàn)不同程度凝固，導致可統(tǒng)計的樣本量較少，但仍有一定的參考價值。低劑量、高劑量連續(xù)給予小鼠60 d后，血常規(guī)主要指標如白細胞數(shù)、紅細胞數(shù)、血紅蛋白及血小板等均沒有發(fā)生明顯改變，提示補坎益離丹長期應用對主要血細胞沒有不良影響。低劑量組、高劑量組平均紅細胞體積雖顯著降低，但與空白組比較下降幅度約為1/10，可忽略其影響；網織紅細胞是尚未完全成熟的紅細胞，在周圍血液中的數(shù)值可反映骨髓紅細胞的生成功能，低劑量組、高劑量組網織紅細胞百分比、網織紅細胞均明顯降低，雖提示紅細胞的生成減少，但紅細胞數(shù)跟空白組比較沒有發(fā)生顯著變化；低劑量組嗜酸性粒細胞百分比雖顯著升高，而嗜酸性粒細胞數(shù)則沒有升高的變化。高劑量組平均血小板體積明顯下降提示血小板生成不良，血小板分布寬度降低表明血小板的均一性高，而高劑量組血小板數(shù)跟空白組比較沒有異常變化。因未見公認的小鼠血常規(guī)指標參考值范圍，若參考犬的血常規(guī)相關指標正常變動區(qū)間范圍，則以上小鼠異常變化的血常規(guī)指標均應在正常范圍內。

血生化檢測是為臨床提供診斷、評價藥物作用的重要方法[7-9]，包括檢測血液中的糖類、酶類、離子、蛋白、脂類、代謝產物以及激素等。低劑量組、高劑量組用藥后，除低劑量組的尿素水平顯著升高外，主要生化指標均無顯著差異。血中尿素主要經腎小球濾過，通過尿液排出體外，當腎小球受損時濾過率降低，血中尿素升高。尿素是反映腎小球濾過功能的重要指標。低劑量組的尿素含量僅高于對照組約1/5，臨床意義不大。提示補坎益離丹長期應用對主要血生化指標沒有明顯不良影響。

石蠟切片不僅用于觀察正常組織細胞的形態(tài)結構，也是病理學、藥理學等研究疾病或藥物影響組織細胞形態(tài)變化的重要方法[10-12]。組織器官經過固定、石蠟包埋、切片及染色等步驟能清晰辨認其細胞結構。與空白組比較，低劑量組、高劑量組肝臟、心臟、脾臟、肺臟、腎臟均無明顯變化。提示補坎益離丹長期應用對肝臟、心臟、脾臟、肺臟、腎臟組織細胞結構沒有不良影響。

空白組死亡2只小鼠，低劑量組死亡2只小鼠，高劑量組死亡3只小鼠。小鼠死亡后經解剖發(fā)現(xiàn)肺臟均出現(xiàn)不同程度的充血或實變，而其他臟器無肉眼可見的變化。小鼠死亡原因可能與長期灌胃造成氣管、肺部的損傷或操作失誤導致死亡有關。

低劑量、高劑量在長期給藥的情況下，對小鼠臨床表現(xiàn)、血常規(guī)主要指標、血生化指標及五臟組織結構均沒有不良影響，表明含有附子、桂心的補坎益離丹安全性良好，可為犬等寵物臨床用藥研究提供參考。