徐小艾,陳靖陽,黃 山,孫英健,沈 紅
(北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/獸醫(yī)學(xué)(中醫(yī)藥)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 102206)
骨骼肌主要由成肌細(xì)胞發(fā)育而來,約占動(dòng)物體重的40%~60%,骨骼肌的生長(zhǎng)發(fā)育對(duì)于畜禽的產(chǎn)肉性能具有非常重要的影響[1]。隨著畜禽集約化養(yǎng)殖程度不斷提高,氧化應(yīng)激發(fā)生愈發(fā)普遍,氧化應(yīng)激造成過量自由基的產(chǎn)生會(huì)影響畜禽的肉品質(zhì)。正常生理狀態(tài)下骨骼肌的生長(zhǎng)發(fā)育十分穩(wěn)定,當(dāng)骨骼肌處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時(shí),原處于靜息狀態(tài)的骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞會(huì)被激活,進(jìn)而增殖、分化、融合形成多核肌管,遷移至骨骼肌受損部位修復(fù)骨骼肌[2]。近年來,Nrf2-ARE作為公認(rèn)的經(jīng)典抗氧化通路,可調(diào)控多種抗氧化酶蛋白的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)[3],通路由Nrf2、Keap1、ARE三個(gè)核心分子構(gòu)成,其中Nrf2是關(guān)鍵分子[4]。在正常生理狀態(tài)下,Keap1的富含雙甘氨酸的結(jié)構(gòu)域和Nrf2的Neh2結(jié)構(gòu)域中的親水區(qū)結(jié)合,Keap1作為細(xì)胞質(zhì)阻遏物在細(xì)胞質(zhì)中隔離Nrf2,從而阻斷Nrf2的核易位和隨后ARE的反式激活[5]。在氧化應(yīng)激刺激下,細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài),使胞內(nèi)Keap1構(gòu)象發(fā)生改變,進(jìn)而對(duì)Nrf2的泛素化作用減弱或消除,Nrf2與Keap1解離激活轉(zhuǎn)移入核,核內(nèi)Nrf2與抗氧化反應(yīng)元件ARE結(jié)合,啟動(dòng)Nrf2-ARE信號(hào)通路,下游超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、血紅素加氧酶1(HO-1)等在內(nèi)的抗氧化應(yīng)激蛋白基因的轉(zhuǎn)錄,提高細(xì)胞抗氧化應(yīng)激的能力[6]。
地鱉蟲早有記載,其擁有活血解凝、消腫止痛、接骨續(xù)筋等功效[7]?,F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證明,地鱉蟲具有溶解血栓、調(diào)節(jié)血脂、抗癌等功效[8-10]。蛋白酶解地鱉獲得短肽具有較強(qiáng)的抗氧化作用[11]。本試驗(yàn)擬以地鱉肽處理過氧化氫刺激的C2C12細(xì)胞,免疫熒光、Western Blot、RT-PCR法等方法檢測(cè)Nrf2核轉(zhuǎn)位及Nrf2-ARE信號(hào)通路下游相關(guān)基因表達(dá),目的探索地鱉肽對(duì)H2O2誘導(dǎo)的C2C12細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用,以期為未來開發(fā)地鱉肽用于畜禽養(yǎng)殖過程中預(yù)防氧化應(yīng)激提供依據(jù)。
C2C12細(xì)胞株由北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物育種及輔助生殖實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。
噻唑藍(lán)(MTT)購(gòu)于BIO-NEW公司(C-0068),Nrf2、HO-1抗體均購(gòu)自Abcam公司(ab62352)、(ab52947),所用引物由生工生物工程股份有限公司合成,地鱉肽提取物由北京農(nóng)學(xué)院獸醫(yī)學(xué)(中醫(yī)藥)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制備,叔丁基對(duì)苯二酚(tert-Butylhydroquinone,TBHQ)購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司。全自動(dòng)酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀購(gòu)自上海美普達(dá)有限公司,核酸蛋白測(cè)定儀購(gòu)自美林恒通儀器有限公司,熒光PCR儀購(gòu)自Applied Biosystems公司,C-dight化學(xué)成像發(fā)光儀購(gòu)自LI-COR公司。
1.2.1 試驗(yàn)分組與處理 C2C12細(xì)胞復(fù)蘇后,待細(xì)胞貼壁密度達(dá)80%~90%時(shí)進(jìn)行傳代分組培養(yǎng),試驗(yàn)分為對(duì)照組、H2O2組、H2O2+地鱉肽組、H2O2+TBHQ組,每組設(shè)3個(gè)重復(fù)。地鱉肽處理細(xì)胞24 h后,除對(duì)照組外,其余各組加入400 μmol/L H2O2刺激細(xì)胞8 h。
1.2.2 C2C12細(xì)胞活力檢測(cè)與細(xì)胞形態(tài)觀察 C2C12細(xì)胞接種于6孔板,經(jīng)分組處理后,MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力。C2C12細(xì)胞接種于6孔板,經(jīng)分組處理后,PBS洗3次,倒置顯微鏡拍照觀察細(xì)胞形態(tài)。
1.2.3 分光光度計(jì)檢測(cè)抗氧化酶及脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物 C2C12細(xì)胞接種于6孔板,經(jīng)分組處理后,PBS懸浮細(xì)胞,反復(fù)凍融破碎細(xì)胞,取細(xì)胞懸液檢測(cè)蛋白濃度。根據(jù)SOD、CAT、GSH-Px、MDA試劑盒檢測(cè)說明操作。
1.2.4 免疫熒光法檢測(cè)Nrf2核移位情況 C2C12細(xì)胞接種于玻片,經(jīng)分組處理后,多聚甲醛固定,破膜,山羊血清封閉,4 ℃孵育一抗過夜,37 ℃孵育二抗1 h,DAPI對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色 15 min,激光共聚焦顯微鏡拍照。
1.2.5 Western Blot法檢測(cè)Nrf2和HO-1蛋白表達(dá) 分組處理細(xì)胞,棄去培養(yǎng)基,預(yù)冷PBS洗,吸棄上清,每1 mL RIPA裂解液中加入10 μL PMSF,每孔150 μL,使其充分與細(xì)胞接觸,置于冰上5 min,細(xì)胞刮刀刮取細(xì)胞,置于1.5 mL EP管中,冰中孵育10 min,4 ℃ 12 000 g離心5 min,收集上清并用BCA法測(cè)定蛋白含量。取等量蛋白進(jìn)行Western Blot試驗(yàn)檢測(cè)。
1.2.6 RT-PCR法檢測(cè)Nrf2和抗氧化酶基因mRNA表達(dá) 分組處理細(xì)胞,提取細(xì)胞RNA,核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)RNA濃度和OD260/280值,當(dāng)OD260/280值在1.9~2.1之間時(shí)符合檢測(cè)要求。按照HiFi-MMLV cDNA Kit說明,反轉(zhuǎn)錄RNA,獲得cDNA。
引物根據(jù)GenBank中的序列用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)而成,由生工生物工程股份有限公司制作合成(表1),熒光定量PCR檢測(cè)分析基因相對(duì)表達(dá)量。
1.2.7 統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,用Microsoft Excel對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行整理并在試驗(yàn)組間進(jìn)行方差分析,當(dāng)P≤0.05為差異顯著,用*和+表示,當(dāng)P≤0.01為差異極顯著,用**和++表示。
表1 SYBR real-time PCR 反應(yīng)引物序列Tab.1 Sequences of the primers in SYBR real-time PCR
MTT檢測(cè)細(xì)胞活力,結(jié)果H2O2組與對(duì)照組比較,細(xì)胞活力極顯著降低,H2O2+TBHQ組與H2O2+地鱉肽組比H2O2組均極顯著升高,隨著地鱉肽濃度增加細(xì)胞活力提高超過80%(圖1)。采用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài),對(duì)照組C2C12細(xì)胞呈梭形或紡錘形,細(xì)胞明亮,分布均勻,相互接觸并聯(lián)結(jié)成網(wǎng)(圖2A);H2O2組細(xì)胞有明顯腫脹,排列稀疏雜亂,彼此連接減少,有部分細(xì)胞脫落貼壁不實(shí)(圖2B);與H2O2組比較,H2O2+地鱉肽組大部分細(xì)胞形態(tài)恢復(fù)至梭形,細(xì)胞密度升高,大致趨于正常形態(tài)(圖2C)。
注:與對(duì)照組相比,**P≤0.01;與H2O2組相比,+P≤0.05,++P≤0.01。Note:Compared with control group, **P≤0.01; compared with H2O2 group, +P≤0.05, ++P≤0.01. 圖1 地鱉肽對(duì)H2O2刺激C2C12細(xì)胞活力的影響Fig.1 Effects of ESP on H2O2-stimulated C2C12 cells viability
注:A是對(duì)照組,箭頭標(biāo)記處為細(xì)胞正常形態(tài);B是H2O2組,箭頭標(biāo)記處為氧化損傷細(xì)胞形態(tài);C是H2O2+地鱉肽組,箭頭標(biāo)記處為藥物保護(hù)作用下細(xì)胞形態(tài)。Note:A is control group, the arrow mark is the normal form of cells; B is H2O2 group, the arrow mark is the shape of oxidative damage cells; C is H2O2+ESP group, the arrow mark is the cell morphology under drug protection.圖2 地鱉肽對(duì)H2O2刺激C2C12細(xì)胞形態(tài)的影響(400×) Fig.2 Effects of ESP on the morphology of H2O2-stimulated C2C12 cells (400×)
抗氧化酶的活性反映機(jī)體的抗氧化能力,MDA是脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物,其含量反映機(jī)體組織細(xì)胞過氧化程度。本研究采用分光光度計(jì)法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活力、過氧化物(MDA)含量,結(jié)果與對(duì)照組相比,H2O2組抗氧化酶(SOD、CAT、GSH-Px)活力均極顯著降低,MDA含量顯著升高;與H2O2組相比,H2O2+TBHQ組或H2O2+地鱉肽組細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶的活力均極顯著提高,其中SOD活性提高最大,MDA含量降低(圖3),地鱉肽提高細(xì)胞抗氧化能力,降低細(xì)胞過氧化反應(yīng)。
注:與對(duì)照組相比,* P≤0.05,**P≤0.01;與H2O2組相比,+ P≤0.05, ++ P≤0.01。Note: Compared with control group, * P≤0.05, **P≤0.01; compared with H2O2 group, + P≤0.05, ++ P≤0.01.圖3 地鱉肽對(duì)H2O2刺激C2C12細(xì)胞抗氧化酶及MDA蛋白表達(dá)量的影響Fig.3 Effect of ESP on antioxidant enzymes and MDA content in H2O2-stimulated C2C12 cells
通過免疫熒光法確定細(xì)胞Nrf2核移位情況,對(duì)照組Nrf2主要分布在細(xì)胞質(zhì)中,細(xì)胞核內(nèi)有極少量的熒光標(biāo)記Nrf2的表達(dá);H2O2+TBHQ組細(xì)胞作為Nrf2激活的陽性對(duì)照,其細(xì)胞核內(nèi)的Nrf2蛋白綠色熒光表達(dá)明顯增多;H2O2組細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核Nrf2蛋白均稍有增多;H2O2+地鱉肽組細(xì)胞核內(nèi)Nrf2綠色熒光比H2O2組明顯增加,與H2O2+TBHQ組接近,H2O2+地鱉肽組促進(jìn)Nrf2核移位(圖4)。
注:箭頭標(biāo)記處為細(xì)胞核內(nèi)Nrf2蛋白表達(dá)增加。Note: The arrow mark indicates an increase in Nrf2 protein expression in the nucleus.圖4 地鱉肽對(duì)H2O2刺激C2C12細(xì)胞Nrf2核移位的影響(800×)Fig.4 Effects of ESW polypeptide on the shift of Nrf2 in C2C12 cells stimulated by H2O2(800×)
采用Western Blot檢測(cè)Nrf2和HO-1蛋白表達(dá),細(xì)胞受到H2O2刺激,Nrf2和HO-1的蛋白表達(dá)量稍有升高,但差異不顯著;H2O2+TBHQ組與H2O2+地鱉肽組Nrf2和HO-1表達(dá)均顯著高于對(duì)照組與H2O2組,差異顯著,而且H2O2+地鱉肽組Nrf2蛋白表達(dá)高于H2O2+TBHQ組(圖5)。
注:與H2O2組相比,+P≤0.05。 Note:Compared with H2O2 group, +P≤0.05.圖5 地鱉肽對(duì)H2O2刺激C2C12細(xì)胞Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)的影響Fig.5 Effect of ESP on the expression of Nrf2 and HO-1 in C2C12 cells stimulated by H2O2
采用RT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)抗氧化通路因子Nrf2及抗氧化酶mRNA表達(dá)。H2O2組比對(duì)照組細(xì)胞顯著下調(diào)Nrf2的表達(dá),叔丁基對(duì)苯二酚(TBHQ)及不同濃度地鱉肽處理細(xì)胞后,細(xì)胞內(nèi)Nrf2表達(dá)量均有所提高,其中藥物在400 μg/mL時(shí)具有顯著差異(圖6)。
與對(duì)照組相比,H2O2下調(diào)抗氧化酶SOD2、CAT、GSH-Px、HO-1的表達(dá)量,且差異顯著;與H2O2組相比,叔丁基對(duì)苯二酚及不同濃度地鱉肽處理的細(xì)胞其抗氧化酶表達(dá)量均升高,地鱉肽為100 μg/mL時(shí)SOD2和GSH-Px表達(dá)極顯著上調(diào),SOD1、CAT、HO-1相對(duì)表達(dá)量雖高于H2O2組,但無顯著差異,地鱉肽在200 μg/mL時(shí),抗氧化酶表達(dá)量均顯著或極顯著上調(diào),地鱉肽藥物升至400 μg/mL后,顯著或極顯著上調(diào)SOD1、SOD2、CAT、GSH-Px表達(dá)量,HO-1相對(duì)表達(dá)量雖高于H2O2組,但無顯著差異(圖6)。
Nrf2-ARE信號(hào)通路抗氧化途徑已受到廣泛的研究,當(dāng)機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激時(shí),過量產(chǎn)生的活性氧,可以激活該通路,Keap1釋放Nrf2,進(jìn)而轉(zhuǎn)移入核,與細(xì)胞核內(nèi)抗氧化原件ARE結(jié)合,啟動(dòng)下游抗氧化基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)用以抵抗氧化應(yīng)激的過度發(fā)生[12]。SOD、CAT和GSH-Px等是最主要的抗氧化酶,在氧化應(yīng)激過程中,能夠清除多余的自由基,MDA是脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物,其含量反映過氧化程度。趙磊等研究發(fā)現(xiàn),茶多酚通過提高細(xì)胞內(nèi)SOD、CAT、GSH-Px的活性中和產(chǎn)生過多的ROS,緩解氧化應(yīng)激對(duì)細(xì)胞的損傷作用[13]。齊曉龍等發(fā)現(xiàn)CLA可顯著提高蛋雞血清和肝臟中SOD、CAT、GSH-Px活力并顯著降低MDA含量[14]。本研究顯示,地鱉肽顯著緩解H2O2對(duì)C2C12細(xì)胞活力的抑制作用,在細(xì)胞形態(tài)的恢復(fù)上具有同樣的體現(xiàn)。進(jìn)一步檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)SOD、CAT、GSH-Px等抗氧化酶活性及脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的含量,地鱉肽對(duì)細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活性呈促進(jìn)作用,MDA含量降低。
HO-1是Nrf2-ARE信號(hào)通路下游表達(dá)的重要抗氧化蛋白之一,能夠催化血紅素降解產(chǎn)生等摩爾量的膽綠素、一氧化碳(CO)和游離鐵,血紅素是一種強(qiáng)效的氧化劑,而膽綠素和CO轉(zhuǎn)化膽紅素具有抗氧化活性,因此,HO-1對(duì)機(jī)體氧化應(yīng)激過程提供保護(hù)作用[15]。梁嫣然等研究發(fā)現(xiàn),利福平能夠誘導(dǎo)Nrf2的核轉(zhuǎn)位及上調(diào)HO-1蛋白的表達(dá);在使用基因沉默法抑制HO-1基因表達(dá)后,可逆轉(zhuǎn)利福平
注:與對(duì)照組相比,*P≤0.05,** P≤0.01;與H2O2組相比,+ P≤0.05, ++ P≤0.01。Note: Compared with control group, * P≤0.05, ** P≤0.01; compared with H2O2 group, + P≤0.05, ++ P≤0.01.圖6 地鱉肽對(duì)H2O2刺激C2C12細(xì)胞Nrf2及其下游抗氧化酶基因mRNA表達(dá)量的影響Fig.6 Effects of ESP on the expression of Nrf2 and antioxidant enzyme mRNA in C2C12 cells stimulated by H2O2
預(yù)處理對(duì)魚藤酮誘導(dǎo)的氧化損傷的抑制作用[16]。姜璐等研究表明,銀杏內(nèi)酯A通過上調(diào)Nrf2、HO-1、GSH的表達(dá)進(jìn)而對(duì)四氯化碳誘發(fā)的HepG2細(xì)胞損傷起到保護(hù)作用,同時(shí)抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)[17]。
地鱉肽顯著緩解H2O2對(duì)C2C12細(xì)胞活力的抑制作用,在細(xì)胞形態(tài)的恢復(fù)上具有同樣的體現(xiàn)。進(jìn)一步檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)SOD、CAT、GSH-Px等抗氧化酶及脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的表達(dá)量,地鱉肽對(duì)細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶的表達(dá)呈促進(jìn)作用,MDA表達(dá)量降低。地鱉肽能夠促進(jìn)Nrf2的表達(dá)及其核移位,進(jìn)而激活Nrf2-ARE信號(hào)通路,增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化能力。運(yùn)用Western Blot技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Nrf2及其下游抗氧化蛋白HO-1的蛋白表達(dá)量,與免疫熒光結(jié)果相一致,地鱉肽顯著促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)Nrf2和HO-1的蛋白表達(dá)。地鱉肽可能通過啟動(dòng)細(xì)胞Nrf2-ARE信號(hào)通路關(guān)鍵分子,促進(jìn)抗氧化蛋白表達(dá),呈現(xiàn)抗氧化作用。
地鱉肽可能通過增加細(xì)胞內(nèi)Nrf2-ARE信號(hào)通路中重要分子的表達(dá),啟動(dòng)Nrf2-ARE信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)抗氧化的作用。本研究結(jié)果為開發(fā)地鱉肽作為一種天然抗氧化劑提供依據(jù),同時(shí)為地鱉深加工及高值化利用提供新的思路。