徐小艾，陳靖陽，黃 山，孫英健，沈 紅

(北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/獸醫(yī)學(xué)(中醫(yī)藥)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206)

骨骼肌主要由成肌細(xì)胞發(fā)育而來，約占動(dòng)物體重的40%～60%，骨骼肌的生長(zhǎng)發(fā)育對(duì)于畜禽的產(chǎn)肉性能具有非常重要的影響[1]。隨著畜禽集約化養(yǎng)殖程度不斷提高，氧化應(yīng)激發(fā)生愈發(fā)普遍，氧化應(yīng)激造成過量自由基的產(chǎn)生會(huì)影響畜禽的肉品質(zhì)。正常生理狀態(tài)下骨骼肌的生長(zhǎng)發(fā)育十分穩(wěn)定，當(dāng)骨骼肌處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，原處于靜息狀態(tài)的骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞會(huì)被激活，進(jìn)而增殖、分化、融合形成多核肌管，遷移至骨骼肌受損部位修復(fù)骨骼肌[2]。近年來，Nrf2-ARE作為公認(rèn)的經(jīng)典抗氧化通路，可調(diào)控多種抗氧化酶蛋白的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)[3]，通路由Nrf2、Keap1、ARE三個(gè)核心分子構(gòu)成，其中Nrf2是關(guān)鍵分子[4]。在正常生理狀態(tài)下，Keap1的富含雙甘氨酸的結(jié)構(gòu)域和Nrf2的Neh2結(jié)構(gòu)域中的親水區(qū)結(jié)合，Keap1作為細(xì)胞質(zhì)阻遏物在細(xì)胞質(zhì)中隔離Nrf2，從而阻斷Nrf2的核易位和隨后ARE的反式激活[5]。在氧化應(yīng)激刺激下，細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，使胞內(nèi)Keap1構(gòu)象發(fā)生改變，進(jìn)而對(duì)Nrf2的泛素化作用減弱或消除，Nrf2與Keap1解離激活轉(zhuǎn)移入核，核內(nèi)Nrf2與抗氧化反應(yīng)元件ARE結(jié)合，啟動(dòng)Nrf2-ARE信號(hào)通路，下游超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、血紅素加氧酶1(HO-1)等在內(nèi)的抗氧化應(yīng)激蛋白基因的轉(zhuǎn)錄，提高細(xì)胞抗氧化應(yīng)激的能力[6]。

地鱉蟲早有記載，其擁有活血解凝、消腫止痛、接骨續(xù)筋等功效[7]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證明，地鱉蟲具有溶解血栓、調(diào)節(jié)血脂、抗癌等功效[8-10]。蛋白酶解地鱉獲得短肽具有較強(qiáng)的抗氧化作用[11]。本試驗(yàn)擬以地鱉肽處理過氧化氫刺激的C2C12細(xì)胞，免疫熒光、Western Blot、RT-PCR法等方法檢測(cè)Nrf2核轉(zhuǎn)位及Nrf2-ARE信號(hào)通路下游相關(guān)基因表達(dá)，目的探索地鱉肽對(duì)H2O2誘導(dǎo)的C2C12細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用，以期為未來開發(fā)地鱉肽用于畜禽養(yǎng)殖過程中預(yù)防氧化應(yīng)激提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

C2C12細(xì)胞株由北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物育種及輔助生殖實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。

噻唑藍(lán)(MTT)購(gòu)于BIO-NEW公司(C-0068)，Nrf2、HO-1抗體均購(gòu)自Abcam公司(ab62352)、(ab52947)，所用引物由生工生物工程股份有限公司合成，地鱉肽提取物由北京農(nóng)學(xué)院獸醫(yī)學(xué)(中醫(yī)藥)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制備，叔丁基對(duì)苯二酚(tert-Butylhydroquinone,TBHQ)購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司。全自動(dòng)酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀購(gòu)自上海美普達(dá)有限公司，核酸蛋白測(cè)定儀購(gòu)自美林恒通儀器有限公司，熒光PCR儀購(gòu)自Applied Biosystems公司，C-dight化學(xué)成像發(fā)光儀購(gòu)自LI-COR公司。

1.2 方 法

1.2.1 試驗(yàn)分組與處理 C2C12細(xì)胞復(fù)蘇后，待細(xì)胞貼壁密度達(dá)80%～90%時(shí)進(jìn)行傳代分組培養(yǎng)，試驗(yàn)分為對(duì)照組、H2O2組、H2O2+地鱉肽組、H2O2+TBHQ組，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)。地鱉肽處理細(xì)胞24 h后，除對(duì)照組外，其余各組加入400 μmol/L H2O2刺激細(xì)胞8 h。

1.2.2 C2C12細(xì)胞活力檢測(cè)與細(xì)胞形態(tài)觀察 C2C12細(xì)胞接種于6孔板，經(jīng)分組處理后，MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力。C2C12細(xì)胞接種于6孔板，經(jīng)分組處理后，PBS洗3次，倒置顯微鏡拍照觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.2.3 分光光度計(jì)檢測(cè)抗氧化酶及脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物 C2C12細(xì)胞接種于6孔板，經(jīng)分組處理后，PBS懸浮細(xì)胞，反復(fù)凍融破碎細(xì)胞，取細(xì)胞懸液檢測(cè)蛋白濃度。根據(jù)SOD、CAT、GSH-Px、MDA試劑盒檢測(cè)說明操作。

1.2.4 免疫熒光法檢測(cè)Nrf2核移位情況 C2C12細(xì)胞接種于玻片，經(jīng)分組處理后，多聚甲醛固定，破膜，山羊血清封閉，4 ℃孵育一抗過夜，37 ℃孵育二抗1 h，DAPI對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色 15 min，激光共聚焦顯微鏡拍照。

1.2.5 Western Blot法檢測(cè)Nrf2和HO-1蛋白表達(dá) 分組處理細(xì)胞，棄去培養(yǎng)基，預(yù)冷PBS洗，吸棄上清，每1 mL RIPA裂解液中加入10 μL PMSF，每孔150 μL，使其充分與細(xì)胞接觸，置于冰上5 min，細(xì)胞刮刀刮取細(xì)胞，置于1.5 mL EP管中，冰中孵育10 min，4 ℃ 12 000 g離心5 min，收集上清并用BCA法測(cè)定蛋白含量。取等量蛋白進(jìn)行Western Blot試驗(yàn)檢測(cè)。

1.2.6 RT-PCR法檢測(cè)Nrf2和抗氧化酶基因mRNA表達(dá) 分組處理細(xì)胞，提取細(xì)胞RNA，核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)RNA濃度和OD260/280值，當(dāng)OD260/280值在1.9～2.1之間時(shí)符合檢測(cè)要求。按照HiFi-MMLV cDNA Kit說明，反轉(zhuǎn)錄RNA，獲得cDNA。

引物根據(jù)GenBank中的序列用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)而成，由生工生物工程股份有限公司制作合成(表1)，熒光定量PCR檢測(cè)分析基因相對(duì)表達(dá)量。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用Microsoft Excel對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行整理并在試驗(yàn)組間進(jìn)行方差分析，當(dāng)P≤0.05為差異顯著，用*和+表示，當(dāng)P≤0.01為差異極顯著，用**和++表示。

表1 SYBR real-time PCR 反應(yīng)引物序列Tab.1 Sequences of the primers in SYBR real-time PCR

2 結(jié) 果

2.1 地鱉肽對(duì)H2O2刺激C2C12細(xì)胞活力及形態(tài)的影響

MTT檢測(cè)細(xì)胞活力，結(jié)果H2O2組與對(duì)照組比較，細(xì)胞活力極顯著降低，H2O2+TBHQ組與H2O2+地鱉肽組比H2O2組均極顯著升高，隨著地鱉肽濃度增加細(xì)胞活力提高超過80%(圖1)。采用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，對(duì)照組C2C12細(xì)胞呈梭形或紡錘形，細(xì)胞明亮，分布均勻，相互接觸并聯(lián)結(jié)成網(wǎng)(圖2A)；H2O2組細(xì)胞有明顯腫脹，排列稀疏雜亂，彼此連接減少，有部分細(xì)胞脫落貼壁不實(shí)(圖2B)；與H2O2組比較，H2O2+地鱉肽組大部分細(xì)胞形態(tài)恢復(fù)至梭形，細(xì)胞密度升高，大致趨于正常形態(tài)(圖2C)。

注：與對(duì)照組相比，**P≤0.01；與H2O2組相比，+P≤0.05，++P≤0.01。Note：Compared with control group, **P≤0.01; compared with H2O2 group, +P≤0.05, ++P≤0.01. 圖1 地鱉肽對(duì)H2O2刺激C2C12細(xì)胞活力的影響Fig.1 Effects of ESP on H2O2-stimulated C2C12 cells viability

注：A是對(duì)照組，箭頭標(biāo)記處為細(xì)胞正常形態(tài)；B是H2O2組，箭頭標(biāo)記處為氧化損傷細(xì)胞形態(tài)；C是H2O2+地鱉肽組，箭頭標(biāo)記處為藥物保護(hù)作用下細(xì)胞形態(tài)。Note:A is control group, the arrow mark is the normal form of cells; B is H2O2 group, the arrow mark is the shape of oxidative damage cells; C is H2O2+ESP group, the arrow mark is the cell morphology under drug protection.圖2 地鱉肽對(duì)H2O2刺激C2C12細(xì)胞形態(tài)的影響(400×) Fig.2 Effects of ESP on the morphology of H2O2-stimulated C2C12 cells (400×)

2.2 地鱉肽對(duì)抗氧化酶和過氧化物(MDA)生成的影響

抗氧化酶的活性反映機(jī)體的抗氧化能力，MDA是脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，其含量反映機(jī)體組織細(xì)胞過氧化程度。本研究采用分光光度計(jì)法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活力、過氧化物(MDA)含量，結(jié)果與對(duì)照組相比，H2O2組抗氧化酶(SOD、CAT、GSH-Px)活力均極顯著降低，MDA含量顯著升高；與H2O2組相比，H2O2+TBHQ組或H2O2+地鱉肽組細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶的活力均極顯著提高，其中SOD活性提高最大，MDA含量降低(圖3)，地鱉肽提高細(xì)胞抗氧化能力，降低細(xì)胞過氧化反應(yīng)。

注：與對(duì)照組相比，* P≤0.05，**P≤0.01；與H2O2組相比，+ P≤0.05， ++ P≤0.01。Note: Compared with control group, * P≤0.05, **P≤0.01; compared with H2O2 group, + P≤0.05, ++ P≤0.01.圖3 地鱉肽對(duì)H2O2刺激C2C12細(xì)胞抗氧化酶及MDA蛋白表達(dá)量的影響Fig.3 Effect of ESP on antioxidant enzymes and MDA content in H2O2-stimulated C2C12 cells

2.3 地鱉肽對(duì)細(xì)胞內(nèi)Nrf2核移位的影響

通過免疫熒光法確定細(xì)胞Nrf2核移位情況，對(duì)照組Nrf2主要分布在細(xì)胞質(zhì)中，細(xì)胞核內(nèi)有極少量的熒光標(biāo)記Nrf2的表達(dá)；H2O2+TBHQ組細(xì)胞作為Nrf2激活的陽性對(duì)照，其細(xì)胞核內(nèi)的Nrf2蛋白綠色熒光表達(dá)明顯增多；H2O2組細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核Nrf2蛋白均稍有增多；H2O2+地鱉肽組細(xì)胞核內(nèi)Nrf2綠色熒光比H2O2組明顯增加，與H2O2+TBHQ組接近，H2O2+地鱉肽組促進(jìn)Nrf2核移位(圖4)。

注：箭頭標(biāo)記處為細(xì)胞核內(nèi)Nrf2蛋白表達(dá)增加。Note: The arrow mark indicates an increase in Nrf2 protein expression in the nucleus.圖4 地鱉肽對(duì)H2O2刺激C2C12細(xì)胞Nrf2核移位的影響(800×)Fig.4 Effects of ESW polypeptide on the shift of Nrf2 in C2C12 cells stimulated by H2O2(800×)

2.4 地鱉肽對(duì)細(xì)胞內(nèi)Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)水平的影響

采用Western Blot檢測(cè)Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)，細(xì)胞受到H2O2刺激，Nrf2和HO-1的蛋白表達(dá)量稍有升高，但差異不顯著；H2O2+TBHQ組與H2O2+地鱉肽組Nrf2和HO-1表達(dá)均顯著高于對(duì)照組與H2O2組，差異顯著，而且H2O2+地鱉肽組Nrf2蛋白表達(dá)高于H2O2+TBHQ組(圖5)。

注：與H2O2組相比，+P≤0.05。 Note:Compared with H2O2 group, +P≤0.05.圖5 地鱉肽對(duì)H2O2刺激C2C12細(xì)胞Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)的影響Fig.5 Effect of ESP on the expression of Nrf2 and HO-1 in C2C12 cells stimulated by H2O2

2.5 地鱉肽對(duì)細(xì)胞內(nèi)Nrf2及抗氧化酶基因mRNA表達(dá)的影響

采用RT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)抗氧化通路因子Nrf2及抗氧化酶mRNA表達(dá)。H2O2組比對(duì)照組細(xì)胞顯著下調(diào)Nrf2的表達(dá)，叔丁基對(duì)苯二酚(TBHQ)及不同濃度地鱉肽處理細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)Nrf2表達(dá)量均有所提高，其中藥物在400 μg/mL時(shí)具有顯著差異(圖6)。

與對(duì)照組相比，H2O2下調(diào)抗氧化酶SOD2、CAT、GSH-Px、HO-1的表達(dá)量，且差異顯著；與H2O2組相比，叔丁基對(duì)苯二酚及不同濃度地鱉肽處理的細(xì)胞其抗氧化酶表達(dá)量均升高，地鱉肽為100 μg/mL時(shí)SOD2和GSH-Px表達(dá)極顯著上調(diào)，SOD1、CAT、HO-1相對(duì)表達(dá)量雖高于H2O2組，但無顯著差異，地鱉肽在200 μg/mL時(shí)，抗氧化酶表達(dá)量均顯著或極顯著上調(diào)，地鱉肽藥物升至400 μg/mL后，顯著或極顯著上調(diào)SOD1、SOD2、CAT、GSH-Px表達(dá)量，HO-1相對(duì)表達(dá)量雖高于H2O2組，但無顯著差異(圖6)。

3 討 論

Nrf2-ARE信號(hào)通路抗氧化途徑已受到廣泛的研究，當(dāng)機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激時(shí)，過量產(chǎn)生的活性氧，可以激活該通路，Keap1釋放Nrf2，進(jìn)而轉(zhuǎn)移入核，與細(xì)胞核內(nèi)抗氧化原件ARE結(jié)合，啟動(dòng)下游抗氧化基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)用以抵抗氧化應(yīng)激的過度發(fā)生[12]。SOD、CAT和GSH-Px等是最主要的抗氧化酶，在氧化應(yīng)激過程中，能夠清除多余的自由基，MDA是脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，其含量反映過氧化程度。趙磊等研究發(fā)現(xiàn)，茶多酚通過提高細(xì)胞內(nèi)SOD、CAT、GSH-Px的活性中和產(chǎn)生過多的ROS，緩解氧化應(yīng)激對(duì)細(xì)胞的損傷作用[13]。齊曉龍等發(fā)現(xiàn)CLA可顯著提高蛋雞血清和肝臟中SOD、CAT、GSH-Px活力并顯著降低MDA含量[14]。本研究顯示，地鱉肽顯著緩解H2O2對(duì)C2C12細(xì)胞活力的抑制作用，在細(xì)胞形態(tài)的恢復(fù)上具有同樣的體現(xiàn)。進(jìn)一步檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)SOD、CAT、GSH-Px等抗氧化酶活性及脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的含量，地鱉肽對(duì)細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活性呈促進(jìn)作用，MDA含量降低。

HO-1是Nrf2-ARE信號(hào)通路下游表達(dá)的重要抗氧化蛋白之一，能夠催化血紅素降解產(chǎn)生等摩爾量的膽綠素、一氧化碳(CO)和游離鐵，血紅素是一種強(qiáng)效的氧化劑，而膽綠素和CO轉(zhuǎn)化膽紅素具有抗氧化活性，因此，HO-1對(duì)機(jī)體氧化應(yīng)激過程提供保護(hù)作用[15]。梁嫣然等研究發(fā)現(xiàn)，利福平能夠誘導(dǎo)Nrf2的核轉(zhuǎn)位及上調(diào)HO-1蛋白的表達(dá)；在使用基因沉默法抑制HO-1基因表達(dá)后，可逆轉(zhuǎn)利福平

注：與對(duì)照組相比，*P≤0.05，** P≤0.01；與H2O2組相比，+ P≤0.05， ++ P≤0.01。Note: Compared with control group, * P≤0.05, ** P≤0.01; compared with H2O2 group, + P≤0.05, ++ P≤0.01.圖6 地鱉肽對(duì)H2O2刺激C2C12細(xì)胞Nrf2及其下游抗氧化酶基因mRNA表達(dá)量的影響Fig.6 Effects of ESP on the expression of Nrf2 and antioxidant enzyme mRNA in C2C12 cells stimulated by H2O2

預(yù)處理對(duì)魚藤酮誘導(dǎo)的氧化損傷的抑制作用[16]。姜璐等研究表明，銀杏內(nèi)酯A通過上調(diào)Nrf2、HO-1、GSH的表達(dá)進(jìn)而對(duì)四氯化碳誘發(fā)的HepG2細(xì)胞損傷起到保護(hù)作用，同時(shí)抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)[17]。

地鱉肽顯著緩解H2O2對(duì)C2C12細(xì)胞活力的抑制作用，在細(xì)胞形態(tài)的恢復(fù)上具有同樣的體現(xiàn)。進(jìn)一步檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)SOD、CAT、GSH-Px等抗氧化酶及脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的表達(dá)量，地鱉肽對(duì)細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶的表達(dá)呈促進(jìn)作用，MDA表達(dá)量降低。地鱉肽能夠促進(jìn)Nrf2的表達(dá)及其核移位，進(jìn)而激活Nrf2-ARE信號(hào)通路，增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化能力。運(yùn)用Western Blot技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Nrf2及其下游抗氧化蛋白HO-1的蛋白表達(dá)量，與免疫熒光結(jié)果相一致，地鱉肽顯著促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)Nrf2和HO-1的蛋白表達(dá)。地鱉肽可能通過啟動(dòng)細(xì)胞Nrf2-ARE信號(hào)通路關(guān)鍵分子，促進(jìn)抗氧化蛋白表達(dá)，呈現(xiàn)抗氧化作用。

地鱉肽可能通過增加細(xì)胞內(nèi)Nrf2-ARE信號(hào)通路中重要分子的表達(dá)，啟動(dòng)Nrf2-ARE信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)抗氧化的作用。本研究結(jié)果為開發(fā)地鱉肽作為一種天然抗氧化劑提供依據(jù)，同時(shí)為地鱉深加工及高值化利用提供新的思路。