徐小艾，陳靖陽，黃 山，孫英健，沈 紅

(北京農(nóng)學院動物科學技術學院/獸醫(yī)學(中醫(yī)藥)北京市重點實驗室，北京 102206)

骨骼肌主要由成肌細胞發(fā)育而來，約占動物體重的40%～60%，骨骼肌的生長發(fā)育對于畜禽的產(chǎn)肉性能具有非常重要的影響[1]。隨著畜禽集約化養(yǎng)殖程度不斷提高，氧化應激發(fā)生愈發(fā)普遍，氧化應激造成過量自由基的產(chǎn)生會影響畜禽的肉品質。正常生理狀態(tài)下骨骼肌的生長發(fā)育十分穩(wěn)定，當骨骼肌處于氧化應激狀態(tài)時，原處于靜息狀態(tài)的骨骼肌衛(wèi)星細胞會被激活，進而增殖、分化、融合形成多核肌管，遷移至骨骼肌受損部位修復骨骼肌[2]。近年來，Nrf2-ARE作為公認的經(jīng)典抗氧化通路，可調控多種抗氧化酶蛋白的轉錄和表達[3]，通路由Nrf2、Keap1、ARE三個核心分子構成，其中Nrf2是關鍵分子[4]。在正常生理狀態(tài)下，Keap1的富含雙甘氨酸的結構域和Nrf2的Neh2結構域中的親水區(qū)結合，Keap1作為細胞質阻遏物在細胞質中隔離Nrf2，從而阻斷Nrf2的核易位和隨后ARE的反式激活[5]。在氧化應激刺激下，細胞處于氧化應激狀態(tài)，使胞內(nèi)Keap1構象發(fā)生改變，進而對Nrf2的泛素化作用減弱或消除，Nrf2與Keap1解離激活轉移入核，核內(nèi)Nrf2與抗氧化反應元件ARE結合，啟動Nrf2-ARE信號通路，下游超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、血紅素加氧酶1(HO-1)等在內(nèi)的抗氧化應激蛋白基因的轉錄，提高細胞抗氧化應激的能力[6]。

地鱉蟲早有記載，其擁有活血解凝、消腫止痛、接骨續(xù)筋等功效[7]?，F(xiàn)代醫(yī)學研究證明，地鱉蟲具有溶解血栓、調節(jié)血脂、抗癌等功效[8-10]。蛋白酶解地鱉獲得短肽具有較強的抗氧化作用[11]。本試驗擬以地鱉肽處理過氧化氫刺激的C2C12細胞，免疫熒光、Western Blot、RT-PCR法等方法檢測Nrf2核轉位及Nrf2-ARE信號通路下游相關基因表達，目的探索地鱉肽對H2O2誘導的C2C12細胞氧化損傷的保護作用，以期為未來開發(fā)地鱉肽用于畜禽養(yǎng)殖過程中預防氧化應激提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

C2C12細胞株由北京農(nóng)學院動物育種及輔助生殖實驗室惠贈。

噻唑藍(MTT)購于BIO-NEW公司(C-0068)，Nrf2、HO-1抗體均購自Abcam公司(ab62352)、(ab52947)，所用引物由生工生物工程股份有限公司合成，地鱉肽提取物由北京農(nóng)學院獸醫(yī)學(中醫(yī)藥)北京市重點實驗室制備，叔丁基對苯二酚(tert-Butylhydroquinone,TBHQ)購自上海麥克林生化科技有限公司。全自動酶聯(lián)免疫檢測儀購自上海美普達有限公司，核酸蛋白測定儀購自美林恒通儀器有限公司，熒光PCR儀購自Applied Biosystems公司，C-dight化學成像發(fā)光儀購自LI-COR公司。

1.2 方 法

1.2.1 試驗分組與處理 C2C12細胞復蘇后，待細胞貼壁密度達80%～90%時進行傳代分組培養(yǎng)，試驗分為對照組、H2O2組、H2O2+地鱉肽組、H2O2+TBHQ組，每組設3個重復。地鱉肽處理細胞24 h后，除對照組外，其余各組加入400 μmol/L H2O2刺激細胞8 h。

1.2.2 C2C12細胞活力檢測與細胞形態(tài)觀察 C2C12細胞接種于6孔板，經(jīng)分組處理后，MTT法檢測細胞活力。C2C12細胞接種于6孔板，經(jīng)分組處理后，PBS洗3次，倒置顯微鏡拍照觀察細胞形態(tài)。

1.2.3 分光光度計檢測抗氧化酶及脂質過氧化產(chǎn)物 C2C12細胞接種于6孔板，經(jīng)分組處理后，PBS懸浮細胞，反復凍融破碎細胞，取細胞懸液檢測蛋白濃度。根據(jù)SOD、CAT、GSH-Px、MDA試劑盒檢測說明操作。

1.2.4 免疫熒光法檢測Nrf2核移位情況 C2C12細胞接種于玻片，經(jīng)分組處理后，多聚甲醛固定，破膜，山羊血清封閉，4 ℃孵育一抗過夜，37 ℃孵育二抗1 h，DAPI對細胞核進行染色 15 min，激光共聚焦顯微鏡拍照。

1.2.5 Western Blot法檢測Nrf2和HO-1蛋白表達 分組處理細胞，棄去培養(yǎng)基，預冷PBS洗，吸棄上清，每1 mL RIPA裂解液中加入10 μL PMSF，每孔150 μL，使其充分與細胞接觸，置于冰上5 min，細胞刮刀刮取細胞，置于1.5 mL EP管中，冰中孵育10 min，4 ℃ 12 000 g離心5 min，收集上清并用BCA法測定蛋白含量。取等量蛋白進行Western Blot試驗檢測。

1.2.6 RT-PCR法檢測Nrf2和抗氧化酶基因mRNA表達 分組處理細胞，提取細胞RNA，核酸蛋白測定儀檢測RNA濃度和OD260/280值，當OD260/280值在1.9～2.1之間時符合檢測要求。按照HiFi-MMLV cDNA Kit說明，反轉錄RNA，獲得cDNA。

引物根據(jù)GenBank中的序列用Primer5.0軟件設計而成，由生工生物工程股份有限公司制作合成(表1)，熒光定量PCR檢測分析基因相對表達量。

1.2.7 統(tǒng)計分析 試驗數(shù)據(jù)使用平均值±標準差表示，用Microsoft Excel對試驗結果進行整理并在試驗組間進行方差分析，當P≤0.05為差異顯著，用*和+表示，當P≤0.01為差異極顯著，用**和++表示。

表1 SYBR real-time PCR 反應引物序列Tab.1 Sequences of the primers in SYBR real-time PCR

2 結 果

2.1 地鱉肽對H2O2刺激C2C12細胞活力及形態(tài)的影響

MTT檢測細胞活力，結果H2O2組與對照組比較，細胞活力極顯著降低，H2O2+TBHQ組與H2O2+地鱉肽組比H2O2組均極顯著升高，隨著地鱉肽濃度增加細胞活力提高超過80%(圖1)。采用倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)，對照組C2C12細胞呈梭形或紡錘形，細胞明亮，分布均勻，相互接觸并聯(lián)結成網(wǎng)(圖2A)；H2O2組細胞有明顯腫脹，排列稀疏雜亂，彼此連接減少，有部分細胞脫落貼壁不實(圖2B)；與H2O2組比較，H2O2+地鱉肽組大部分細胞形態(tài)恢復至梭形，細胞密度升高，大致趨于正常形態(tài)(圖2C)。

注：與對照組相比，**P≤0.01；與H2O2組相比，+P≤0.05，++P≤0.01。Note：Compared with control group, **P≤0.01; compared with H2O2 group, +P≤0.05, ++P≤0.01. 圖1 地鱉肽對H2O2刺激C2C12細胞活力的影響Fig.1 Effects of ESP on H2O2-stimulated C2C12 cells viability

注：A是對照組，箭頭標記處為細胞正常形態(tài)；B是H2O2組，箭頭標記處為氧化損傷細胞形態(tài)；C是H2O2+地鱉肽組，箭頭標記處為藥物保護作用下細胞形態(tài)。Note:A is control group, the arrow mark is the normal form of cells; B is H2O2 group, the arrow mark is the shape of oxidative damage cells; C is H2O2+ESP group, the arrow mark is the cell morphology under drug protection.圖2 地鱉肽對H2O2刺激C2C12細胞形態(tài)的影響(400×) Fig.2 Effects of ESP on the morphology of H2O2-stimulated C2C12 cells (400×)

2.2 地鱉肽對抗氧化酶和過氧化物(MDA)生成的影響

抗氧化酶的活性反映機體的抗氧化能力，MDA是脂質過氧化的產(chǎn)物，其含量反映機體組織細胞過氧化程度。本研究采用分光光度計法檢測細胞內(nèi)抗氧化酶活力、過氧化物(MDA)含量，結果與對照組相比，H2O2組抗氧化酶(SOD、CAT、GSH-Px)活力均極顯著降低，MDA含量顯著升高；與H2O2組相比，H2O2+TBHQ組或H2O2+地鱉肽組細胞內(nèi)抗氧化酶的活力均極顯著提高，其中SOD活性提高最大，MDA含量降低(圖3)，地鱉肽提高細胞抗氧化能力，降低細胞過氧化反應。

注：與對照組相比，* P≤0.05，**P≤0.01；與H2O2組相比，+ P≤0.05， ++ P≤0.01。Note: Compared with control group, * P≤0.05, **P≤0.01; compared with H2O2 group, + P≤0.05, ++ P≤0.01.圖3 地鱉肽對H2O2刺激C2C12細胞抗氧化酶及MDA蛋白表達量的影響Fig.3 Effect of ESP on antioxidant enzymes and MDA content in H2O2-stimulated C2C12 cells

2.3 地鱉肽對細胞內(nèi)Nrf2核移位的影響

通過免疫熒光法確定細胞Nrf2核移位情況，對照組Nrf2主要分布在細胞質中，細胞核內(nèi)有極少量的熒光標記Nrf2的表達；H2O2+TBHQ組細胞作為Nrf2激活的陽性對照，其細胞核內(nèi)的Nrf2蛋白綠色熒光表達明顯增多；H2O2組細胞質與細胞核Nrf2蛋白均稍有增多；H2O2+地鱉肽組細胞核內(nèi)Nrf2綠色熒光比H2O2組明顯增加，與H2O2+TBHQ組接近，H2O2+地鱉肽組促進Nrf2核移位(圖4)。

注：箭頭標記處為細胞核內(nèi)Nrf2蛋白表達增加。Note: The arrow mark indicates an increase in Nrf2 protein expression in the nucleus.圖4 地鱉肽對H2O2刺激C2C12細胞Nrf2核移位的影響(800×)Fig.4 Effects of ESW polypeptide on the shift of Nrf2 in C2C12 cells stimulated by H2O2(800×)

2.4 地鱉肽對細胞內(nèi)Nrf2和HO-1蛋白表達水平的影響

采用Western Blot檢測Nrf2和HO-1蛋白表達，細胞受到H2O2刺激，Nrf2和HO-1的蛋白表達量稍有升高，但差異不顯著；H2O2+TBHQ組與H2O2+地鱉肽組Nrf2和HO-1表達均顯著高于對照組與H2O2組，差異顯著，而且H2O2+地鱉肽組Nrf2蛋白表達高于H2O2+TBHQ組(圖5)。

注：與H2O2組相比，+P≤0.05。 Note:Compared with H2O2 group, +P≤0.05.圖5 地鱉肽對H2O2刺激C2C12細胞Nrf2和HO-1蛋白表達的影響Fig.5 Effect of ESP on the expression of Nrf2 and HO-1 in C2C12 cells stimulated by H2O2

2.5 地鱉肽對細胞內(nèi)Nrf2及抗氧化酶基因mRNA表達的影響

采用RT-PCR法檢測細胞內(nèi)抗氧化通路因子Nrf2及抗氧化酶mRNA表達。H2O2組比對照組細胞顯著下調Nrf2的表達，叔丁基對苯二酚(TBHQ)及不同濃度地鱉肽處理細胞后，細胞內(nèi)Nrf2表達量均有所提高，其中藥物在400 μg/mL時具有顯著差異(圖6)。

與對照組相比，H2O2下調抗氧化酶SOD2、CAT、GSH-Px、HO-1的表達量，且差異顯著；與H2O2組相比，叔丁基對苯二酚及不同濃度地鱉肽處理的細胞其抗氧化酶表達量均升高，地鱉肽為100 μg/mL時SOD2和GSH-Px表達極顯著上調，SOD1、CAT、HO-1相對表達量雖高于H2O2組，但無顯著差異，地鱉肽在200 μg/mL時，抗氧化酶表達量均顯著或極顯著上調，地鱉肽藥物升至400 μg/mL后，顯著或極顯著上調SOD1、SOD2、CAT、GSH-Px表達量，HO-1相對表達量雖高于H2O2組，但無顯著差異(圖6)。

3 討 論

Nrf2-ARE信號通路抗氧化途徑已受到廣泛的研究，當機體發(fā)生氧化應激時，過量產(chǎn)生的活性氧，可以激活該通路，Keap1釋放Nrf2，進而轉移入核，與細胞核內(nèi)抗氧化原件ARE結合，啟動下游抗氧化基因的轉錄與表達用以抵抗氧化應激的過度發(fā)生[12]。SOD、CAT和GSH-Px等是最主要的抗氧化酶，在氧化應激過程中，能夠清除多余的自由基，MDA是脂質過氧化的產(chǎn)物，其含量反映過氧化程度。趙磊等研究發(fā)現(xiàn)，茶多酚通過提高細胞內(nèi)SOD、CAT、GSH-Px的活性中和產(chǎn)生過多的ROS，緩解氧化應激對細胞的損傷作用[13]。齊曉龍等發(fā)現(xiàn)CLA可顯著提高蛋雞血清和肝臟中SOD、CAT、GSH-Px活力并顯著降低MDA含量[14]。本研究顯示，地鱉肽顯著緩解H2O2對C2C12細胞活力的抑制作用，在細胞形態(tài)的恢復上具有同樣的體現(xiàn)。進一步檢測細胞內(nèi)SOD、CAT、GSH-Px等抗氧化酶活性及脂質過氧化產(chǎn)物MDA的含量，地鱉肽對細胞內(nèi)抗氧化酶活性呈促進作用，MDA含量降低。

HO-1是Nrf2-ARE信號通路下游表達的重要抗氧化蛋白之一，能夠催化血紅素降解產(chǎn)生等摩爾量的膽綠素、一氧化碳(CO)和游離鐵，血紅素是一種強效的氧化劑，而膽綠素和CO轉化膽紅素具有抗氧化活性，因此，HO-1對機體氧化應激過程提供保護作用[15]。梁嫣然等研究發(fā)現(xiàn)，利福平能夠誘導Nrf2的核轉位及上調HO-1蛋白的表達；在使用基因沉默法抑制HO-1基因表達后，可逆轉利福平

注：與對照組相比，*P≤0.05，** P≤0.01；與H2O2組相比，+ P≤0.05， ++ P≤0.01。Note: Compared with control group, * P≤0.05, ** P≤0.01; compared with H2O2 group, + P≤0.05, ++ P≤0.01.圖6 地鱉肽對H2O2刺激C2C12細胞Nrf2及其下游抗氧化酶基因mRNA表達量的影響Fig.6 Effects of ESP on the expression of Nrf2 and antioxidant enzyme mRNA in C2C12 cells stimulated by H2O2

預處理對魚藤酮誘導的氧化損傷的抑制作用[16]。姜璐等研究表明，銀杏內(nèi)酯A通過上調Nrf2、HO-1、GSH的表達進而對四氯化碳誘發(fā)的HepG2細胞損傷起到保護作用，同時抑制氧化應激反應[17]。

地鱉肽顯著緩解H2O2對C2C12細胞活力的抑制作用，在細胞形態(tài)的恢復上具有同樣的體現(xiàn)。進一步檢測細胞內(nèi)SOD、CAT、GSH-Px等抗氧化酶及脂質過氧化產(chǎn)物MDA的表達量，地鱉肽對細胞內(nèi)抗氧化酶的表達呈促進作用，MDA表達量降低。地鱉肽能夠促進Nrf2的表達及其核移位，進而激活Nrf2-ARE信號通路，增強細胞抗氧化能力。運用Western Blot技術檢測細胞內(nèi)Nrf2及其下游抗氧化蛋白HO-1的蛋白表達量，與免疫熒光結果相一致，地鱉肽顯著促進細胞內(nèi)Nrf2和HO-1的蛋白表達。地鱉肽可能通過啟動細胞Nrf2-ARE信號通路關鍵分子，促進抗氧化蛋白表達，呈現(xiàn)抗氧化作用。

地鱉肽可能通過增加細胞內(nèi)Nrf2-ARE信號通路中重要分子的表達，啟動Nrf2-ARE信號通路實現(xiàn)抗氧化的作用。本研究結果為開發(fā)地鱉肽作為一種天然抗氧化劑提供依據(jù)，同時為地鱉深加工及高值化利用提供新的思路。