蘇漢書，熊本海，方洛云，蔣林樹

(1.北京農(nóng)學院動物科學技術(shù)學院/奶牛營養(yǎng)學北京市重點實驗室，北京 102206；2.中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193)

近年來，通過添加植物提取物在維持畜禽機體健康及調(diào)控其生產(chǎn)性能方面有著非常廣闊的應用前景。而植物提取物如何調(diào)控反芻動物瘤胃發(fā)酵，已成為目前研究熱點[1-3]。同時，反芻動物瘤胃內(nèi)產(chǎn)生的甲烷不僅是一種溫室氣體，而且造成奶牛2%～5%的能量浪費[4]?，F(xiàn)研究表明，單寧如兒茶素[5]、皂苷如茶皂素[6]、植物精油如月桂酸[7]等植物提取物均可作為瘤胃發(fā)酵調(diào)節(jié)劑和甲烷抑制劑，但在奶牛生產(chǎn)中普遍存在造價高、適口性不好等使用限制。故尋求可有效抑制奶牛甲烷排放和調(diào)節(jié)瘤胃發(fā)酵的綠色添加劑迫在眉睫。

青蒿提取物(Artemisinin)是由青蒿中提取出來的一種具有過氧基的新型倍半萜類化合物[8]，最早由中國科學工作者于20世紀70年代首次應用于治療瘧疾[9]，現(xiàn)在廣泛應用于醫(yī)藥研究。至今，研究發(fā)現(xiàn)其具有抗瘧[10-11]、抗菌[12-14]、解熱[15]、增強免疫[16-17]、抗腫瘤[18]、抗寄生蟲[19]、抗內(nèi)毒素[20]等多種生物學作用。目前，青蒿提取物已作為綠色植物添加劑在畜牧生產(chǎn)中的應用取得顯著進展。研究證明青蒿提取物可以顯著提高動物生長性能[21]、抑制寄生蟲繁殖[22]、增強機體免疫力[23]。利用體外產(chǎn)氣法研究發(fā)現(xiàn)在維持瘤胃正常發(fā)酵的條件下，青蒿提取物可作為甲烷抑制劑。在青藏高原高寒草甸的枯草期時，牦牛的青蒿提取物適宜添加量為0.50%；返青期時牦牛適宜添加量為2.00%；青草期時牦牛適宜添加量為1.00%；枯黃期時牦牛適宜添加劑量為0.25%。其中返青期添加0.50%時抑制效果最佳[8]。而藏羊的四期牧草各適宜添加水平均為0.50%[24]。另添加5 g/kg青蒿提取物和70 g/kg大黃可以替代15 mg/kg莫能菌素來降低瘤胃發(fā)酵過程中甲烷的產(chǎn)量，作為改善山羊瘤胃發(fā)酵的綠色添加劑[25]。這說明青蒿提取物可以有效調(diào)控反芻動物瘤胃發(fā)酵及抑制甲烷排放。目前青蒿提取物對奶牛瘤胃發(fā)酵及甲烷排放的相關(guān)研究較少。

本試驗通過瘤胃體外發(fā)酵試驗，研究青蒿提取物對奶牛瘤胃發(fā)酵及甲烷生成的影響，旨在為今后青蒿提取物作為奶牛生產(chǎn)綠色飼料添加劑提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

青蒿提取物選購自陜西森弗天然制品有限公司，為棕黃色粉末。其含青蒿素39%，粗灰分25%，粗蛋白14%，多糖12.7%等。

1.2 瘤胃體外發(fā)酵試驗設(shè)計及方法

1.2.1 瘤胃液采集 在北京奶牛中心延慶基地良種場選取4頭體況相近、胎次相近的健康荷斯坦奶牛作為瘤胃液供體。于晨飼前通過口腔采液器進行瘤胃液采集，并轉(zhuǎn)移至事先預熱達39 ℃并充滿CO2的保溫瓶內(nèi)。收集完畢后迅速帶回實驗室4層紗布過濾備用。

1.2.2 人工唾液鹽和發(fā)酵底物配制 參照Menke等[26]的方法于試驗前1 d配制人工唾液鹽，各組分組成見表1。各溶液配制后依次加入蒸餾水、微量元素溶液、碳酸鹽緩沖液、磷酸鹽緩沖液、刃天青指示劑和還原液。充分混勻后持續(xù)通入CO2，直至溶液顏色由粉紅色變?yōu)闊o色透明，將pH調(diào)整至6.8，于39 ℃預熱備用。

發(fā)酵底物：由玉米青貯、苜蓿、棉籽、干酒糟及其可溶物等65 ℃烘干48 h后，研磨過1 mm篩，按照底物比例混勻備用。發(fā)酵底物組成及營養(yǎng)水平見表2。

表1 人工唾液鹽各組分組成Tab.1 Composition of different component of artificial saliva

表2 發(fā)酵底物組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))Tab.2 Composition and nutrient levels of fermentation substrate ( DM basis)

注：每千克預混料中含有：Cu 800 mg，Mn 1 200 mg，Zn 3 300 mg，Se 30 mg，Co 20 mg，F(xiàn)e 1 400 mg，I 70 mg，VA 1 100 000 IU，VD 330 000 IU，VE 3 000 IU；泌乳凈能為計算值，泌乳凈能=0.5501×消化能-0.0946[27]，其他營養(yǎng)水平為實測值。

Note: One kg of premix contained the following: Cu 800 mg, Mn 1 200 mg, Zn 3 300 mg, Se 30 mg, Co 20 mg, Fe 1 400 mg, I 70 mg, VA 1 100 000 IU, VD 330 000 IU, VE 3 000 IU; NEL was a calculated value, NEL=0.5501×DE-0.0946[27]; while other nutrient level were measured values.

1.2.3 體外發(fā)酵培養(yǎng) 采用單因素試驗設(shè)計，準確稱取500 mg發(fā)酵底物于150 mL體外發(fā)酵瓶中，分別添加0.00%(空白對照)、0.25%、0.50%、0.75%、1.00%、2.00%的青蒿提取物，共6個處理組，每組6個重復。接種時迅速將每個發(fā)酵瓶中加入25 mL瘤胃液和50 mL預熱的人工唾液鹽，持續(xù)通入CO25 s后，蓋上瓶塞，立即將氣袋與每個發(fā)酵瓶相連接，打開氣袋閥門，置于恒溫恒濕培養(yǎng)箱中39 ℃連續(xù)培養(yǎng)24 h，試驗共重復3次。

1.2.4 樣品采集及指標測定 發(fā)酵24 h后將發(fā)酵瓶置于冰水浴中，停止發(fā)酵，并立即關(guān)閉氣袋閥門，取下氣袋，檢測產(chǎn)氣量及甲烷。然后立即用便攜式pH計(梅特勒-托利多Seven 2 Go)測定pH值。將發(fā)酵液用已知重量的孔徑為37 μm、規(guī)格為15 cm×7 cm的尼龍袋過濾，濾渣用于檢測瘤胃體外發(fā)酵干物質(zhì)消失率；濾液分裝于2只2 mL離心管和2只10 mL離心管中。2 mL離心管中的發(fā)酵液用于氨態(tài)氮(NH3-N)以及揮發(fā)性脂肪酸(VFA)的測定，10 mL離心管發(fā)酵液作為備樣。

氨態(tài)氮質(zhì)量濃度利用靛酚比色法[28]測定。2 mL樣品于12 000×g離心20 min，取上清液40 μL至試管中；邊混勻邊加入2.5 mL苯酚顯色劑、2.0 mL次氯酸鹽試劑；置于37 ℃水浴中顯色30 min，冷卻后于550 nm下比色。

揮發(fā)性脂肪酸濃度采用內(nèi)標法測定[29]。使用安捷倫7890B型號氣相色譜儀測定。色譜條件：FID檢測器，流速為30 mL/min的氮氣作為載氣，空氣發(fā)生器提供流速為40 mL/min的氫氣，空氣流速400 mL/min，總流量54 mL/min，吹掃流量3 mL/min，分流比50∶1，線速度27.8 cm/s。DB-FFAP(15 m×0.32 mm×0.25 μm)填充柱，柱溫180 ℃，檢測溫度280 ℃，進樣口溫度250 ℃，進樣量2 μL。

干物質(zhì)消失率采用尼龍袋法測定。將尼龍袋發(fā)酵液濾渣在65 ℃烘干4 h后稱重。計算公式如下：干物質(zhì)消失率=(濾渣加尼龍袋烘干后重-尼龍袋重)/發(fā)酵底物重×100%。

甲烷濃度由發(fā)酵24 h后氣袋收集的氣體經(jīng)氣相色譜儀(安捷倫7890B)測定[30]。色譜條件：TCD檢測器，PorapakQ填充柱，流量為33 mL/min的氮氣作為載氣，進樣口溫度150 ℃，檢測溫度100 ℃，柱溫30 ℃，柱流量1.6 mL/min，進樣量1 mL。

運用氣袋法計算總產(chǎn)氣量。發(fā)酵24 h后，將發(fā)酵瓶連接的氣袋關(guān)閉閥門，采用注射器抽取其中氣體，讀取體積，估算產(chǎn)氣量。

發(fā)酵底物中粗蛋白含量參照GB/T 6433-2006測定、粗灰分含量參照GB/T 6438-2007測定、中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量參照GB/T 6434-2006測定、鈣含量參照GB/T 6436-2018測定、磷含量參照GB/T 6437-2018測定。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2016進行初步整理后，運用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行方差分析，組間采用Duncan法進行多重比較，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

統(tǒng)計分析模型：Y=μ+α+ε

式中：Y表示因變量值；μ表示總體平均值；α表示不同劑量的青蒿提取物處理效果；ε表示隨機誤差。

2 結(jié)果與分析

2.1 青蒿提取物對奶牛瘤胃pH、氨態(tài)氮、干物質(zhì)消失率的影響

如表3所示，與對照組相比，添加青蒿提取物對奶牛瘤胃體外發(fā)酵液pH值影響不顯著(P>0.05)。發(fā)酵液氨態(tài)氮范圍在34.25～41.02 mg/dL之間，試驗組與對照組相比差異顯著(P<0.05)。且當添加0.50%的青蒿提取物時，氨態(tài)氮達到最高值41.02 mg/dL，顯著高于對照組(P<0.05)。0.50%組、0.75%組與2.00%組的氨態(tài)氮差異顯著(P<0.05)。與對照組相比，當添加0.50%和0.75%的青蒿提取物時，體外發(fā)酵的干物質(zhì)消失率顯著升高，且在0.75%組干物質(zhì)消失率最高(P<0.01)。

2.2 青蒿提取物對奶牛瘤胃揮發(fā)性脂肪酸的影響

由表4可知，與對照組相比，添加不同劑量的青蒿提取物對總揮發(fā)酸、乙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸均無顯著影響；與對照組相比，2.00%組顯著降低丙酸含量，其余三組顯著升高丙酸含量(P<0.05)，整體呈先升高再降低的趨勢；對于乙酸/丙酸值，處理組均低于對照組，0.50%和0.75%組與對照組相比差異極顯著(P<0.01)，且0.50%組的乙酸/丙酸值最低。

2.3 青蒿提取物對奶牛瘤胃產(chǎn)氣量及甲烷濃度的影響

如表5所示，添加青蒿提取物對奶牛瘤胃體外發(fā)酵24 h產(chǎn)氣量影響效果不顯著。而與對照組相比，0.50%和1.00%組極顯著降低24 h甲烷產(chǎn)量(P<0.01)，0.50%時抑制效果最佳且甲烷產(chǎn)量隨添加劑量先減少后升高，在2.00%組時高于對照組。處理組發(fā)酵液中性洗滌纖維含量與對照組相比差異顯著，0.50%和0.75%組顯著低于對照組，1.00%和2.00%組顯著高于對照組，組間差異顯著，總體呈先降低后升高的趨勢(P<0.05)。

表3 青蒿提取物對奶牛瘤胃發(fā)酵24 h后pH、氨態(tài)氮、干物質(zhì)消失率的影響Tab.3 Effects of artemisinin on pH, NH3-N Concentration and Dry Matter Degradation Rate and in Dairy Cow Rumen for 24 h

注：同行數(shù)據(jù)肩標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同或無字母肩標表示差異不顯著(P>0.05)。

Note:Values in the same row with different small letter superscripts mean significant difference(P<0.05)，while with the same or no letter superscripts mean no significant difference(P>0.05)

表4 青蒿提取物對奶牛瘤胃發(fā)酵24 h后揮發(fā)性脂肪酸的影響Tab.4 Effects of artemisinin onvolatile fatty acids in Dairy Cow Rumen for 24 h

注：同行數(shù)據(jù)肩標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同或無字母肩標表示差異不顯著(P>0.05)。

Note: Values in the same row with different small letter superscripts mean significant difference(P<0.05)，while with the same or no letter superscripts mean no significant difference(P>0.05)

表5 青蒿提取物對奶牛瘤胃發(fā)酵24 h后產(chǎn)氣量及甲烷濃度的影響Tab.5 Effects of artemisinin on gas production and CH4 Concentration in Dairy Cow Rumen for 24 h

注：同行數(shù)據(jù)肩標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同或無字母肩標表示差異不顯著(P>0.05)。

Note: Values in the same row with different small letter superscripts mean significant difference(P<0.05)，while with the same or no letter superscripts mean no significant difference(P>0.05)

3 討 論

奶牛瘤胃是一個復雜的大環(huán)境，維護瘤胃內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定對奶牛營養(yǎng)生理至關(guān)重要。而pH值是反映瘤胃酸堿平衡和瘤胃微生物環(huán)境狀態(tài)的重要指標，在一定程度上反映瘤胃消化代謝情況，其過高或過低均對瘤胃微生物的繁殖和發(fā)酵有不利影響。瘤胃內(nèi)pH值受奶牛唾液分泌、瘤胃內(nèi)有機酸積聚以及飼料精粗比的影響[31]。pH值正常范圍在6.2～6.8之間，在本試驗中，與對照組相比，添加不同劑量的青蒿提取物對奶牛瘤胃體外發(fā)酵液的pH值影響不顯著，雖總體呈升高的趨勢，但均在瘤胃pH正常值范圍之內(nèi)。氨態(tài)氮作為衡量瘤胃氮代謝的關(guān)鍵指標，是微生物合成菌體蛋白的前體物質(zhì)。在本試驗中，添加一定劑量的青蒿提取物能夠顯著提高氨態(tài)氮的質(zhì)量濃度。瘤胃氨態(tài)氮質(zhì)量濃度的最佳范圍為6.58～36.7mg/dL[32]，Satter等[33]發(fā)現(xiàn)，體外條件下，保證瘤胃微生物最快生長的氨態(tài)氮質(zhì)量濃度范圍為20～50 mg/dL。當添加0.50%的青蒿提取物時，氨態(tài)氮質(zhì)量濃度達到最高值41.02 mg/dL，效果最顯著，雖略高于正常值，但仍在微生物正常生長范圍之內(nèi)。這與拜彬強等[24]研究結(jié)果一致。同時氨態(tài)氮取決于瘤胃微生物對飼料粗蛋白的降解與微生物合成蛋白時的氨利用水平。本試驗研究結(jié)果表明，青蒿提取物可通過調(diào)控氨態(tài)氮促進瘤胃內(nèi)微生物分解粗蛋白，進而促進瘤胃發(fā)酵，可能機理為青蒿提取物提高瘤胃內(nèi)微生物活性。這與試驗干物質(zhì)消失率結(jié)果相一致，添加青蒿提取物顯著提高奶牛瘤胃干物質(zhì)消失率。綜合來看，青蒿提取物可調(diào)控瘤胃發(fā)酵且無顯著不良影響。

揮發(fā)性脂肪酸可提供反芻動物所需的主要能量，其組成比例及具體濃度可直接反應瘤胃代謝活動水平。瘤胃發(fā)酵生成的揮發(fā)性脂肪酸，包括乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、戊酸、異戊酸，其中乙酸、丙酸、丁酸占總揮發(fā)酸的95%左右。飼料中纖維物質(zhì)與非纖維性碳水化合物經(jīng)瘤胃微生物分解為丙酮酸。丙酮酸發(fā)生代謝轉(zhuǎn)化，合成可被繼續(xù)利用的營養(yǎng)物質(zhì)，如乙酸、丙酸等揮發(fā)性脂肪酸，CO2和H2及CH4。糖降解過程中丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙酸和丁酸時產(chǎn)生H2，而氫可用于丙酸生成。CH4產(chǎn)量與瘤胃發(fā)酵產(chǎn)生的乙酸含量和乙酸/丙酸值呈正相關(guān)，與丙酸含量呈負相關(guān)[34]。本試驗中，添加不同劑量的青蒿提取物對總揮發(fā)酸、乙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異酸均無顯著影響；對丙酸影響效果顯著，整體呈先升高再降低的趨勢，在0.75%時達到最高值，2.00%丙酸減少可能是由于高劑量青蒿提取物抑制瘤胃丙酸生成；與對照組相比，添加不同劑量的青蒿提取物極顯著降低乙酸/丙酸值，與王小晶等研究結(jié)果一致[25]，側(cè)面印證丙酸結(jié)果。試驗說明，青蒿提取物可以影響瘤胃發(fā)酵產(chǎn)生的揮發(fā)酸組成，從而改變瘤胃發(fā)酵模式；通過增加丙酸濃度競爭性消耗H2，降低乙酸/丙酸值，可調(diào)控瘤胃內(nèi)甲烷生成。

產(chǎn)氣量可評價飼料營養(yǎng)價值與可發(fā)酵程度，在一定程度上能衡量瘤胃微生物活躍程度總趨勢。添加青蒿提取物對奶牛瘤胃體外發(fā)酵24 h產(chǎn)氣量影響效果不顯著。說明青蒿提取物不會影響瘤胃對飼料的正常發(fā)酵。而與對照組相比，0.50%和1.00%組極顯著降低24 h甲烷產(chǎn)量，且甲烷產(chǎn)量先減少后升高，在2.00%組時高于對照組，與青蒿提取物存在劑量依賴關(guān)系。這與拜彬強等[24]、王小晶等[25]的研究結(jié)果一致，說明青蒿提取物可以顯著調(diào)控甲烷的生成，且0.50%時抑制效果最佳。氫氣是瘤胃中甲烷生成的主要底物。研究發(fā)現(xiàn)原蟲可產(chǎn)生豐富的氫氣，它們的去除(脫氣)可使體內(nèi)甲烷生成降低11%[35]。就植物提取物來說，其活性成分主要包括苷類、多糖類、揮發(fā)油、黃酮、單寧以及生物堿等，這些成分可顯著抑制瘤胃原蟲生長活性[36]。同時研究證實，青蒿提取物具有抑制多種原蟲的作用[37]。故青蒿提取物抑制甲烷生成的機理可能是通過抑制原蟲蛋白抑制瘤胃原蟲，從而達到降低甲烷產(chǎn)量的效果。青蒿提取物對發(fā)酵液殘渣中性洗滌纖維含量與對照組相比差異顯著，總體呈先降低后升高的趨勢，0.50%和0.75%組發(fā)酵殘渣中性洗滌纖維含量顯著低于對照組。研究發(fā)現(xiàn)飼料中中性洗滌纖維發(fā)酵越充分，甲烷產(chǎn)量相對越高[38]，從而青蒿提取物通過抑制中性洗滌纖維發(fā)酵可減少甲烷生成。故青蒿提取物可作為調(diào)控奶牛瘤胃甲烷抑制的綠色添加劑。

4 結(jié) 論

體外條件下，添加不同劑量的青蒿提取物對奶牛瘤胃pH、揮發(fā)酸及24 h總產(chǎn)氣量均無影響，但升高氨態(tài)氮質(zhì)量濃度及干物質(zhì)消失率，降低乙酸/丙酸值。另青蒿提取物可有效抑制甲烷生成，綜合考慮，添加0.50%青蒿提取物對奶牛瘤胃體外發(fā)酵及甲烷調(diào)控最適宜。