楊勝平 章 縝 程 穎 錢韻芳 謝 晶*

（1 上海海洋大學食品學院 上海201306

2 上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心 上海201306）

冷鏈流通是保持生鮮水產(chǎn)品品質(zhì)的重要手段，研究發(fā)現(xiàn)低溫冷藏并不能完全抑制微生物的生長，部分能夠適應(yīng)低溫環(huán)境的腐敗微生物仍會生長繁殖，并最終導致冷藏水產(chǎn)品腐敗變質(zhì)[1-3]，這已成為水產(chǎn)品冷鏈流通保鮮的主要限制因素。低溫冷藏條件對嗜熱菌、嗜中溫菌的生長有明顯抑制作用，而對水產(chǎn)品中主要存在的耐冷菌（psychrotrophs）的抑制作用有限。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，耐冷菌在鯔魚[4]、凡納濱對蝦[5-6]、魷魚圈[7]、史氏鱘魚糜[8]等冷藏水產(chǎn)品微生物菌群中占主導地位。

在這些水產(chǎn)品耐冷菌中，以腐敗希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）最為典型。腐敗希瓦氏菌是冷藏凡納濱對蝦、帶魚的主要腐敗菌[2，9-10]，同時它也是牙鲆、大黃魚等大宗水產(chǎn)品的主要腐敗菌[11]。腐敗希瓦氏菌是一種革蘭氏陰性運動桿菌，具有較強的致腐敗能力，在其生長代謝活動中不僅能夠分解肌肉蛋白，將氨基酸脫羧生成腐胺、尸胺等生物胺[12]，還可還原氧化三甲胺（TMAO）為三甲胺（TMA）[13]，產(chǎn)生H2S等臭味物質(zhì)[14]，其形成的生物被膜可導致水產(chǎn)品表面發(fā)粘[15]。腐敗希瓦氏菌是導致低溫貯藏水產(chǎn)品發(fā)生腐敗的重要因素之一。

腐敗希瓦氏菌具有較強的溫度適應(yīng)能力，不僅能在常溫下較快生長，也能適應(yīng)低溫環(huán)境并保持一定生長速率，因而成為水產(chǎn)品中的優(yōu)勢菌。有研究表明，腐敗希瓦氏菌在新鮮水產(chǎn)品微生物菌群中的比例較小，在低溫貯藏過程中才迅速增長，如新鮮凡納濱對蝦中腐敗希瓦氏菌的數(shù)量僅占微生物菌落總數(shù)的1.6%，而4℃貯藏10 d后就增加到約24.7%[2]。在低溫貯藏的草魚片[12]、大西洋馬鮫魚[16]、牡蠣[17]等水產(chǎn)品中亦有類似發(fā)現(xiàn)。如何抑制低溫下腐敗希瓦氏菌的生長成為水產(chǎn)品冷藏保鮮中亟待解決的問題。

低溫脅迫下腐敗希瓦氏菌適冷調(diào)控機制對其生長動力學起著至關(guān)重要的作用，在適冷過程中，微生物細胞膜流動性的維持是其在低溫環(huán)境下進行正常代謝的關(guān)鍵因素[18]，而流動性的維持主要通過調(diào)節(jié)細胞膜中脂肪酸組成，降低膜脂熔點來實現(xiàn)。一般認為常見的調(diào)節(jié)方式包括：①增加不飽和脂肪酸（unsaturated fatty acid，UFA）含量；②縮短脂肪酸?；湹拈L度；③增加支鏈脂肪酸和異構(gòu)分支脂肪酸的比例；④減少環(huán)狀脂肪酸的含量[19]。其中，以脂肪酸不飽和度的調(diào)節(jié)最為關(guān)鍵，該調(diào)控通路可作為抑菌的靶標[20]。

目前，有關(guān)腐敗希瓦氏菌對細胞膜脂肪酸含量調(diào)節(jié)機制的報道較少。本文以水產(chǎn)品中常見的腐敗希瓦氏菌的模式菌株DSM6067為對象，研究不同培養(yǎng)溫度條件下的腐敗希瓦氏菌生長動力學參數(shù)、細胞膜脂肪酸組成、膜蛋白含量、細胞微觀結(jié)構(gòu)和細胞膜流動性變化，分析溫度對腐敗希瓦氏菌生長動力學參數(shù)及其細胞膜理化特性的影響，以期為通過表征細胞蛋白質(zhì)組差異表達，推測溫度敏感因子和不飽和脂肪酸代謝通路；通過研究不飽和脂肪酸代謝通路中去飽和酶基因的轉(zhuǎn)錄量以及轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子含量與溫度的關(guān)系，探討腐敗希瓦氏菌在適冷過程中的分子調(diào)控機理。對于進一步研究抑制冷鏈流通中腐敗希瓦氏菌的生長，保障水產(chǎn)品品質(zhì)的方法提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 腐敗希瓦氏菌模式菌株 腐敗希瓦氏菌模式菌株DSM 6067，德國Leibniz-Institut DSMZ GmbH微生物研究所。

1.1.2 試劑與儀器 試劑：腦心浸肉湯（BHI）、胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）等微生物培養(yǎng)基，青島海博生物技術(shù)有限公司；8-苯胺-1-萘磺酸（ANS），sigma公司；Bradford蛋白濃度測定試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)有限公司；12%電泳預制膠、電泳緩沖液，南京建成生物有限公司；雙色預染蛋白Marker、蛋白Loading Buffer、C510041高靈敏快速考馬斯亮藍染色試劑盒，生工生物工程（上海）股份有限公司。甲醇、正己烷、氯仿、十九烷酸甲酯、濃鹽酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉等試劑，國藥集團化學試劑有限公司。

主要設(shè)備與儀器：LDZX-50KBS蒸汽滅菌器，上海申安公司；VS-1300L-U潔凈工作臺，蘇州蘇凈泰安集團；Eppendorf 5427R型高速冷凍離心機，德國艾本德公司；H-2050R臺式冷凍離心機，湖南湘儀儀器有限公司；Ymnl-150型超聲波細胞粉碎機，南京以馬內(nèi)利儀器設(shè)備有限公司；SHA-2型制冷恒溫振蕩器，金壇市城西崢嶸實驗儀器廠；JEM-1200EX透射電子顯微鏡，日本JEOL公司；RF-6000熒光分光光度計，日本島津公司；Trace 1310 ISQ氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，ThermoFisher公司；iMark酶標儀、Mini-PROTEAN Tetra電泳儀、小型Trans-Blot垂直電泳槽，美國Bio-Red伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌種活化 腐敗希瓦氏菌模式菌株DSM 6067菌粉溶解于已滅菌的BHI培養(yǎng)基中，于30℃下活化培養(yǎng)12~18 h至菌液濃度達到108CFU/mL。取適量菌液接種于已滅菌的TSB培養(yǎng)基中再次活化，待用。

1.2.2 微生物生長曲線繪制及腐敗菌生長動力學模型的選取 細菌生長曲線的繪制：吸取0.1mL活化培養(yǎng)至108CFU/mL的TSB菌液于裝有100 mL新滅菌的TSB培養(yǎng)液的三角瓶中，分別在30，10℃和4℃下培養(yǎng)，在波長595 nm處測定菌液的OD值，根據(jù)OD595值繪制生長曲線。

腐敗希瓦氏菌生長動力學模型的選?。簠⒄崭爹i等[21]及Zwietering等[22]修正的Gompertz方程描述的腐敗菌生長動態(tài)方法。

1.2.3 細菌脂肪酸組成及含量的測定 參照Diomandé等[23]的方法并略有修改。將細菌培養(yǎng)至各溫度下對應(yīng)的對數(shù)生長中期（OD595值約為0.6），將菌液5 000 g離心，沉淀經(jīng)PBS緩沖溶液反復沖洗3次，收集菌體。菌體經(jīng)液氮猝滅，于-80℃隔夜凍藏，次日冷凍干燥成菌粉。取80~100 mg凍干菌粉加入15mL離心管中，繼續(xù)加入2mL 5%鹽酸甲醇溶液，3mL體積比為1∶1的氯仿-甲醇溶液，100μL十九烷酸甲酯內(nèi)標。在85℃水浴鍋中水浴1 h后降至室溫，在離心管中加入1mL正己烷，震蕩萃取2min，靜置1 h，待分層。取上層清液100μL，用正己烷定容1mL，0.45μm濾膜過膜后上機分析。

色譜條件：色譜柱：TG-5MS（30m×0.25mm×0.25μm），升溫程序：80℃保持1min，以10℃/min的速率升至200℃，繼續(xù)以5℃/min的速率升至250℃，最后以2℃/min的速率升到270℃，保持3 min。進樣口溫度：290℃，載氣流速：1.2mL/min，不分流進樣，開閥時間1min。

質(zhì)譜條件：離子源溫度：280℃，傳輸線溫度：280℃，溶劑延遲時間：5.00min，掃描范圍：30~400 amu，離子源：EI源70 eV。

1.2.4 細菌細胞膜蛋白聚丙烯酰胺凝膠電泳與膜蛋白含量的測定 將30，10℃和4℃條件下培養(yǎng)至對數(shù)生長中期（OD595值約為0.6）的細菌菌液于5 000 g下離心，沉淀經(jīng)PBS緩沖溶液反復沖洗3次后收集菌體。聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）參照雷雨婷等[24]的方法進行。樣品經(jīng)丙酮洗滌后，加入適量loading buffer煮沸5min，冷卻后加樣于1mm厚的凝膠孔道中，上樣量5μL。膜蛋白含量參照Dong等[25]的方法，使用Bradford蛋白濃度測定試劑盒測定。

1.2.5 透射電子顯微鏡（TEM）觀察細菌微觀結(jié)構(gòu)變化 將不同溫度下培養(yǎng)至對數(shù)生長中期的菌株離心，收集菌體并用0.2mol/L磷酸緩沖液稍清洗，加入2.5%的戊二醛固定液（勿沖散菌體），4℃下固定過夜，切片，透射電子顯微鏡觀察并拍照[26]。

1.2.6 細菌細胞膜流動性的測定 根據(jù)康亦兼等[27]的方法進行，略有修改。將活化好的菌種分別接種至100mL新滅菌的TSB培養(yǎng)液中，30℃培養(yǎng)8 h，此后將其轉(zhuǎn)移，置4℃環(huán)境下適冷培養(yǎng)。分別在30℃培養(yǎng)8 h，4℃培養(yǎng)24，72，144 h及216 h取菌樣，4℃下5 000 g離心10min，收集菌體，經(jīng)PBS緩沖液清洗3次，重懸于含0.5mmol/L DTT和0.1%TWEEN 20的PBS緩沖液中。將菌液于冰浴下超聲細胞粉碎機粉碎6min，之后將其在4℃下10 000 g離心20min，棄沉淀，測定上清液中蛋白濃度并保存于-40℃下待用。用Tris-Hcl緩沖液配制5mmol/L ANS母液，臨用前將其稀釋至1.0×10-4mol/L。膜蛋白終質(zhì)量濃度為5mg/L，ANS終質(zhì)量濃度為10μmol/L，于室溫孵育20 min，用熒光分光光度計在激發(fā)波長385 nm、發(fā)射波長480 nm條件下測定。

圖1 不同培養(yǎng)溫度下腐敗希瓦氏菌的生長曲線Fig.1 The growth curve of Shewanella putrefaciens at different temperatures

表1 不同培養(yǎng)溫度下腐敗希瓦氏菌的生長動力學參數(shù)Table1 The growth parameters of Shewanella putrefaciens at different temperatures

2 結(jié)果與分析

2.1 腐敗希瓦氏菌在30，10℃及4℃條件下的生長情況

腐敗希瓦氏菌模式菌株在30，10℃和4℃下的生長動態(tài)采用修正的Gompertz方程描述，在細菌生長期間OD595值擬合曲線如圖1所示。通過Compertz方程擬合所得腐敗希瓦氏菌的生長動力學參數(shù)見表1。

Compertz方程擬合的30，10℃及4℃培養(yǎng)下的生長曲線相關(guān)系數(shù)R2分別為0.9949，0.9971和0.9859，具有較高的擬合度，能夠較好地反映細菌的生長情況。由生長動力學參數(shù)可知腐敗希瓦氏菌在30，10℃及4℃下生長的延滯時間分別為3.35，25.94 h和122.03 h，隨著培養(yǎng)溫度的下降，細菌的延滯時間延長。腐敗希瓦氏菌在3種培養(yǎng)溫度下的最大比生長速率μmax：0.047 h-1（10℃），其與30℃下的0.081 h-1相比下降較明顯，而在4℃時的μmax僅為0.017 h-1?？梢?，培養(yǎng)溫度越低，微生物的增長越緩慢。30℃是腐敗希瓦氏菌的最適生長溫度，細菌迅速增長繁殖，經(jīng)短暫的延滯期后快速進入對數(shù)生長期，在8 h左右達到對數(shù)生長中期，并在24 h后基本趨于穩(wěn)定。培養(yǎng)溫度10℃下，希瓦氏菌經(jīng)40 h培養(yǎng)后達到對數(shù)生長中期。培養(yǎng)溫度4℃下的細菌增長速度較慢，腐敗希瓦氏菌在前122 h均在延滯期，168 h后達到對數(shù)生長中期。由腐敗希瓦氏菌生長動力學參數(shù)表明，不同培養(yǎng)溫度下腐敗希瓦氏菌DSM6067的增長雖然隨培養(yǎng)溫度的下降而減緩，但是仍能適應(yīng)低溫環(huán)境生長。

圖2 不同培養(yǎng)溫度下腐敗希瓦氏菌細胞膜脂肪酸GC-MS圖譜Fig.2 GC-MS of fatty acids in Shewanella putrefaciens cell membrane at different temperatures

2.2 30，10℃及4℃條件下腐敗希瓦氏菌細胞膜脂肪酸組成含量變化

微生物為了適應(yīng)低溫環(huán)境，細胞膜脂肪酸組成會發(fā)生一定變化[28]。以C8：0（辛酸）、C24：1（神經(jīng)酸）等共35種脂肪酸作為標準品，分析30，10℃和4℃不同培養(yǎng)溫度下腐敗希瓦氏模式菌株在對數(shù)生長中期的細胞膜中脂肪酸情況，最終檢出13種脂肪酸。脂肪酸GC-MS圖譜及檢出的脂肪酸相對含量見圖2和圖3。從圖3可知，腐敗希瓦氏菌細胞膜脂肪酸以C16：0（棕櫚酸）、C16：1（棕櫚油酸）和C18：0（硬脂酸）為主。隨著培養(yǎng)溫度的下降，腐敗希瓦氏菌細胞膜中的C15：0、C16：0、C17：0、C17：1、C18：0、C18：1N9C和C18：1N9T含量均下降，而C12：0、C14：0及C16：1含量則上升較為明顯。其中4℃與30℃培養(yǎng)下細菌相比C16：1含量上升最為顯著，該現(xiàn)象與竇京嬌等[29]對北極海冰細菌在低溫脅迫下脂肪酸的變化研究結(jié)果相一致。由此說明單不飽和脂肪酸C16：1在維持細胞膜流動性方面可能起關(guān)鍵性作用。

圖3 不同培養(yǎng)溫度下腐敗希瓦氏菌細胞膜脂肪酸相對含量變化Fig.3 The changes of membrane fatty acids in Shewanella putrefaciens at different temperatures

2.3 30，10℃及4℃條件下腐敗希瓦氏菌細胞膜蛋白含量的變化

腐敗希瓦氏菌細胞膜蛋白SDS-PAGE電泳圖譜如圖4所示。隨著培養(yǎng)溫度的下降，腐敗希瓦氏菌膜蛋白種類有所增加，其中低溫培養(yǎng)下以分子質(zhì)量在30 ku及60~120 ku間的蛋白表達量較多。Bisht S C等[30]有關(guān)嗜冷菌的研究表明，細菌在低溫下產(chǎn)生的分子質(zhì)量為30 ku的蛋白一般為冷激蛋白。圖5顯示腐敗希瓦氏菌膜蛋白濃度情況。細菌膜蛋白濃度也隨著培養(yǎng)溫度的降低而上升?？梢姡瘮∠Ｍ呤暇鸀榱诉m應(yīng)低溫環(huán)境，其細胞膜蛋白表達種類和含量均有上升。對于不同培養(yǎng)溫度下腐敗希瓦氏菌所表達的差異蛋白種類還有待進一步研究。

圖4 不同培養(yǎng)溫度下腐敗希瓦氏菌細胞膜蛋白SDS-PAGE電泳圖譜Fig.4 SDS-PAGE of membrane proteins in Shewanella putrefaciens at different temperatures

圖5 不同培養(yǎng)溫度下腐敗希瓦氏菌細胞膜蛋白含量變化Fig.5 The changes of membrane proteins in Shewanella putrefaciens at different temperatures

2.4 30，10℃及4℃條件下腐敗希瓦氏菌細胞微觀形態(tài)變化

透射電子顯微鏡（TEM）觀察腐敗希瓦氏菌模式菌株DSM6067的細胞微觀結(jié)構(gòu)如圖6所示。在30℃培養(yǎng)時，腐敗希瓦氏菌的細胞壁膜呈現(xiàn)波浪狀褶皺，可能是因為腐敗希瓦氏菌的最適生長溫度為30℃，細胞壁膜出現(xiàn)的褶皺使其表面積增大，使細胞有利于代謝營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。隨著培養(yǎng)溫度的降低，腐敗希瓦氏菌細胞壁膜變得較為平滑，其表面積相對較小，從而影響其胞內(nèi)外物質(zhì)交換，細胞代謝增長速率下降。此外，透射電子顯微鏡下的腐敗希瓦氏菌部分細胞內(nèi)部出現(xiàn)空泡，可能與細胞內(nèi)容物外漏有關(guān)，此現(xiàn)象與蔡瑾[31]用TEM觀察細菌的結(jié)果類似。與10℃和4℃低溫培養(yǎng)下的細菌相比，30℃培養(yǎng)下的腐敗希瓦氏菌出現(xiàn)的空泡較多，可能是由于培養(yǎng)溫度較高，細菌細胞膜流動性較強，在TEM樣品前處理時易導致細胞膜破損，細胞內(nèi)容物流出形成空泡。

圖6 不同培養(yǎng)溫度下腐敗希瓦氏菌細胞TEM顯微結(jié)構(gòu)變化Fig.6 The microscopic structure of Shewanella putrefaciens at different temperatures by TEM

2.5 腐敗希瓦氏菌在冷適應(yīng)過程中細胞膜流動性變化

8-苯胺-1-萘磺酸（8-Anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS）是一種熒光染料，其常作為一種蛋白質(zhì)熒光探測劑，較適用于標記測定親和力疏水性配體及其相應(yīng)的結(jié)合蛋白，如具有疏水性游離脂肪酸的脂肪酸結(jié)合蛋白（FABPs）。ANS的熒光強度值與細胞膜的流動性呈反比，即熒光強度越高，細胞膜的流動性越低[29]。本文采用ANS熒光探針法研究細胞膜流動性，不同培養(yǎng)溫度下腐敗希瓦氏菌細胞膜流動性如圖7所示。腐敗希瓦氏菌在波長485 nm處出現(xiàn)熒光強度峰值，細菌在30℃培養(yǎng)8 h，熒光強度值較低，說明細胞膜流動性較好。將其轉(zhuǎn)移至4℃環(huán)境中培養(yǎng)24 h后，細胞膜流動性顯著降低?？梢?，腐敗希瓦氏菌在低溫脅迫下細胞膜流動性下降。隨著4℃低溫環(huán)境中培養(yǎng)時間的延長，希瓦氏菌的細胞膜流動性增強，表明腐敗希瓦氏菌逐漸適應(yīng)了低溫環(huán)境。

圖7 腐敗希瓦氏菌適冷過程中細胞膜流動性變化Fig.7 The changes in membrane fluidity of Shewanella putrefaciens during cold adaptation process

3 結(jié)論

對不同培養(yǎng)溫度下腐敗希瓦氏菌模式菌株DSM067生長情況及細胞膜理化特性的研究表明，腐敗希瓦氏菌在低溫脅迫下生長速率下降，細胞膜理化特性發(fā)生一定的變化。腐敗希瓦氏菌模式菌株在30℃培養(yǎng)下經(jīng)3.35 h延滯期后即進入快速增長的對數(shù)生長期，而10℃下延滯期為25.94 h，4℃培養(yǎng)下細菌經(jīng)122.03 h才進入對數(shù)生長期；腐敗希瓦氏菌最大比生長速率表明，4℃下μmax為0.017 h-1，顯著低于30℃培養(yǎng)下的0.081 h-1。培養(yǎng)溫度越低細菌生長繁殖越緩慢。腐敗希瓦氏菌細胞膜脂肪酸組成以C16：0、C16：1和C18：0為主，隨著培養(yǎng)溫度的下降，單不飽和脂肪酸C16：1含量上升，其含量由30℃的26.62%升至4℃培養(yǎng)的46.66%。C16：1在腐敗希瓦氏菌適冷過程中維持細胞膜流動性方面起關(guān)鍵性作用。不同培養(yǎng)溫度下的腐敗希瓦氏菌膜蛋白質(zhì)表達出現(xiàn)差異，隨著培養(yǎng)溫度的降低，分子質(zhì)量在30 ku及60~120 ku間的細菌蛋白表達量增多。腐敗希瓦氏菌細胞TEM顯微結(jié)構(gòu)顯示：30℃培養(yǎng)下的細菌細胞壁膜呈現(xiàn)波浪狀褶皺，細胞膜表面積大，而培養(yǎng)溫度下降，細胞壁膜較為平滑。細胞中出現(xiàn)的空泡從一定程度上反映細胞膜的流動性，30℃最適培養(yǎng)溫度下細菌細胞膜流動性較好。對細菌細胞膜流動性的研究發(fā)現(xiàn)，腐敗希瓦氏菌從最適的30℃培養(yǎng)轉(zhuǎn)入4℃培養(yǎng)環(huán)境，細菌的膜流動性明顯下降，然而經(jīng)過一定時間的適冷，細菌細胞膜流動性得到一定的恢復，表明腐敗希瓦氏菌經(jīng)自身理化特性的變化逐漸適應(yīng)了低溫環(huán)境，從而能夠繼續(xù)生長繁殖。