于新穎 魏長(zhǎng)浩 余誠(chéng)瑋 范亞葦 鄧澤元

（南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 南昌330047）

菜籽粕是菜籽經(jīng)榨油后剩下的富含蛋白的副產(chǎn)物，是一種優(yōu)良的植物蛋白源。菜籽粕蛋白含量約35%～42%[1]，其它營(yíng)養(yǎng)成分含量也十分豐富，是一種優(yōu)秀的飼料來(lái)源[2-3]。我國(guó)每年生產(chǎn)菜籽粕約700萬(wàn)t[4]，產(chǎn)量大，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，目前主要應(yīng)用于飼料。菜籽粕含有較高抗?fàn)I養(yǎng)因子，如硫甙、單寧、植酸等。使用未脫毒的菜籽粕喂養(yǎng)家禽家畜，不但影響日糧適口性，蛋白質(zhì)、碳水化合物等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用，而且可能使仔豬出現(xiàn)腹瀉，甚至造成臟器的損傷，限制了菜籽粕作為飼料的應(yīng)用[5-6]。微生物發(fā)酵菜籽粕不僅能降低抗?fàn)I養(yǎng)因子，提高粗蛋白含量，還能將高分子質(zhì)量蛋白降解為小分子的肽類，發(fā)酵產(chǎn)生的氨基酸在某種程度上平衡氨基酸的比例，發(fā)酵產(chǎn)生的各種消化酶可提高飼料中營(yíng)養(yǎng)成分的利用率，因此微生物發(fā)酵菜籽粕具有廣泛的應(yīng)用前景[7-8]。

粗壯脈紋孢菌是本實(shí)驗(yàn)室從江西傳統(tǒng)食品中提取、純化得到的菌種[9]。該菌有較強(qiáng)的生產(chǎn)類胡蘿卜素的和降解粗纖維的能力[10]，且菌體生長(zhǎng)所需的條件簡(jiǎn)單，原料成本低，發(fā)酵周期短，實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程易控制，極具開(kāi)發(fā)價(jià)值[11-12]。粗壯脈紋孢菌對(duì)農(nóng)副產(chǎn)物蛋白質(zhì)降解的研究甚少，是否對(duì)菜籽粕的抗?fàn)I養(yǎng)因子有降解作用也不了解。本試驗(yàn)工作人員利用粗壯脈紋孢菌固態(tài)發(fā)酵菜籽粕，通過(guò)測(cè)定菜籽粕在發(fā)酵過(guò)程中蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分、抗?fàn)I養(yǎng)因子含量的變化，探討通過(guò)粗壯脈紋孢菌提高菜籽粕的利用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菜籽粕由八維生物科技有限公司提供；粗壯脈紋孢菌（Neurospora crassa CGMCC3088）由本實(shí)驗(yàn)室篩選保存。

牛血清蛋白，北京索萊寶科技有限公司；植酸二鉀，sigma試劑公司；氯化鈀，天津市化學(xué)試劑研究所；鹽酸，天津市大茂化工試劑廠；丙酮，上海瑞捷化學(xué)試劑有限公司；無(wú)水乙醇，西隴科學(xué)股份有限公司；磺基水楊酸，天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司；考馬斯亮藍(lán)，上海藍(lán)秀科技發(fā)展有限公司；檸檬酸鐵銨，西隴化工股份有限公司。上述試劑均為分析純級(jí)。

1.2 儀器與設(shè)備

海能K9860全自動(dòng)凱氏定氮儀，山東海能科學(xué)儀器有限公司；F600粗纖維測(cè)定儀，山東海能科學(xué)儀器有限公司；722E型可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司；L-8900氨基酸分析儀，日本日立公司；馬弗爐，上海佳展儀器設(shè)備有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州國(guó)華電器有限公司；BSD-YF2200智能精密搖床，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；HPX-160BSH恒溫恒濕箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵菜籽粕的制備 菜籽粕需粉碎過(guò)60目篩，稱取10 g原料與16mL水充分混合，滅菌后加入4mL菌體密度為1.305×106個(gè)/mL的孢子懸液，攪拌均勻。在30℃、70%濕度下培養(yǎng)，發(fā)酵至96 h，每隔12 h取樣1次，于45℃烘干至恒重，粉碎后過(guò)60目篩，備用。

1.3.2 營(yíng)養(yǎng)成分的測(cè)定

1.3.2.1 粗蛋白含量的測(cè)定 采用凱氏定氮法（GB 5009.5-2010）測(cè)定。

1.3.2.2 粗纖維的測(cè)定 采用國(guó)標(biāo)GB/T6434-2006飼料中粗纖維的含量測(cè)定[12]方法。

1.3.2.3 類胡蘿卜素含量的測(cè)定[13]取0.5 g原料用0.8mol/L HCl溶液潤(rùn)濕，后用水洗至中性，離心取濾渣。加入10mL丙酮，浸提30min，離心取上層清液，重復(fù)提取1次，合并兩次提取液，用丙酮定容25mL，在461 nm處測(cè)定吸光度。類胡蘿卜素含量的計(jì)算公式：

式中：A——類胡蘿卜素最大吸收波長(zhǎng)處的吸光值；V——提取所用的丙酮體積（mL）；D——測(cè)定試樣時(shí)的稀釋倍數(shù)；m——培養(yǎng)物的質(zhì)量（g）；0.16——類胡蘿卜素的克分子消光系數(shù)。

1.3.2.4 可溶性蛋白含量的測(cè)定 采用考馬斯亮藍(lán)G－250染色法[14]測(cè)定。取樣品0.5 g于研缽中，加入5.0mL蒸餾水研磨均勻，離心吸取1.0mL上清液，加入5.0mL考馬斯亮藍(lán)G-250溶液，放置5min后于595 nm處測(cè)定吸光度。

式中：m′——從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得蛋白質(zhì)的質(zhì)量（μg）；V——樣品提取液總體積（mL）；Vs——測(cè)定時(shí)所取樣品提取液體積（mL）；m——樣品質(zhì)量（g）。

1.3.2.5 酸溶性蛋白含量的測(cè)定 采用GB/T 22492-2008測(cè)定。

1.3.2.6 氨基酸組分的測(cè)定 酸處理、堿處理的前處理方法參照GB/T 18246-2000，用全自動(dòng)氨基酸分析儀測(cè)定樣品中的氨基酸含量。

1.3.3 抗?fàn)I養(yǎng)因子的測(cè)定

1.3.3.1 植酸含量的測(cè)定 采用三氯化鐵比色法[15]測(cè)定。稱取樣品0.5 g，加入1.2%HCl和10%Na2SO4混合液20mL，25℃浸提2 h，離心取上清液2mL，加入15%三氯乙酸2mL于4℃靜置2 h。靜置后，離心取上清液2mL，用0.75mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值6.0~6.5。用蒸餾水稀釋至30mL，取3mL稀釋液加入0.03%FeCl3·6H2O和0.3%磺基水楊酸混合液1mL，混合均勻后于500 nm處比色。植酸含量計(jì)算公式：

式中：m——利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中植酸的質(zhì)量（g）；n——稀釋倍數(shù)；V——提取液體積mL；M——樣品干重（g）。

1.3.3.2 單寧含量的測(cè)定 采用GB/T15686-2008測(cè)定。稱取0.5 g樣品，加入10mL 75%二甲基甲酰胺溶液，浸提1 h，離心取1mL上清液，加入6 mL水和1mL 8 g/L氨溶液，混勻后，取1mL上清液，加入5mL蒸餾水和1mL 3.5 g/L檸檬酸鐵銨溶液，振蕩10 s，加入1mL 8 g/L氨溶液振蕩10 s。室溫下靜置10min后，于525 nm處以水為空白對(duì)照，測(cè)定吸光度。式樣的吸光值為添加檸檬酸鐵銨的數(shù)值減去未加檸檬酸鐵銨的數(shù)值。

式中：X——干物質(zhì)中單寧酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（%）；c——從標(biāo)準(zhǔn)曲線得出的提取液中單寧酸的質(zhì)量濃度（mg/mL）；m——式樣質(zhì)量（g）；H——樣品水分含量（%）。

1.3.3.3 硫甙含量的測(cè)定 采用氯化鈀顯色法[16]測(cè)定。稱取樣品0.1 g，于90℃烘2 h，然后在沸水浴中干蒸10min。干蒸后向試管中加入7mL蒸餾水，繼續(xù)蒸煮1 h。之后將樣品冷卻至25℃并定容10 mL。離心取2 mL上清液，分別加入4 mL 0.15%羧甲基纖維素鈉溶液和2mL 8mmol/L氯化鈀顯色劑，在25℃下放置2 h，于540 nm處測(cè)定其吸光值A(chǔ)1。同時(shí)吸取2mL濾液，將2mL氯化鈀溶液改成加入2mL水，其余步驟與上述相同，得到吸光值A(chǔ)2。

式中：X——硫甙的含量（μmol/g）；185.2——根據(jù)多次試驗(yàn)得到的結(jié)果等經(jīng)計(jì)算得出的一個(gè)常用的系數(shù)；0.2——修正值。

1.3.4 菜籽粕蛋白的SDS-PAGE分析

1）樣品制備 稱取菜籽粕0.5 g，用0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液（pH 7.0）10mL浸提2 h，于5 000 r/min，4℃離心10min，取上清液測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2）蛋白的SDS-PAGE分析 SDS-PAGE電泳的分離膠12%，濃縮膠5%，電泳時(shí)，取40μL樣品加入10μL上樣緩沖液，混勻后在沸水中水浴5min。上樣量20μL，樣品在濃縮膠時(shí)電壓80 V，進(jìn)入分離膠后上升至120 V，當(dāng)溴酚藍(lán)距離下緣0.5～1.0 cm 時(shí)結(jié)束電泳。膠片用考馬斯亮藍(lán)R-250染色[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 菜籽粕在發(fā)酵過(guò)程中各種營(yíng)養(yǎng)成分的變化

2.1.1 粗蛋白含量的變化從圖1可知，新鮮菜籽粕粗蛋白含量為（44.62±0.28）g/100g，發(fā)酵96 h粗蛋白含量上升至（50.20±0.29）g/100g，提高了12.51%，且各時(shí)間段所測(cè)粗蛋白含量相對(duì)于原樣（發(fā)酵0 h）中粗蛋白含量均存在極顯著性的增加（P＜0.01）。發(fā)酵0～12 h，粗蛋白質(zhì)含量急劇上升，其原因可能是因粗壯脈紋孢菌大量繁殖，快速分解蛋白質(zhì)和淀粉等成分，并轉(zhuǎn)化為菌體蛋白[18]；發(fā)酵12～84 h，粗蛋白質(zhì)含量呈現(xiàn)緩慢增加的趨勢(shì)；發(fā)酵84～96 h粗蛋白質(zhì)含量又快速升高，這階段粗壯脈紋孢菌已停止生長(zhǎng)[19]。在發(fā)酵過(guò)程中消耗了菜籽粕中的脂質(zhì)、糖類等碳源，相應(yīng)增加了粗蛋白的比例[20]。

2.1.2 粗纖維含量的變化從圖2可知，發(fā)酵96 h后菜籽粕粗纖維素含量由（20.70±0.02）g/100g降至（15.84±0.17）g/100g，粗纖維降解率達(dá)23.48%。從24 h開(kāi)始粗纖維含量相對(duì)于原樣（發(fā)酵0 h）中粗纖維含量均存在極顯著性的下降（P＜0.01），原因是粗壯脈紋孢菌生長(zhǎng)的同時(shí)產(chǎn)生纖維素酶，降解樣品中的粗纖維。

2.1.3 類胡蘿卜素含量的變化 粗壯脈紋孢菌生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中增加了菜籽粕中的類胡蘿卜素含量。如圖3所示，0～84 h，類胡蘿卜素含量整體呈上升趨勢(shì)，在84 h時(shí)類胡蘿卜素含量達(dá)到最大值（64.68±1.42）μg/100g。84～96 h類胡蘿卜素含量開(kāi)始下降，可能是因?yàn)榫w進(jìn)入衰亡期，類胡蘿卜素性質(zhì)不穩(wěn)定，部分類胡蘿卜素被氧化，使得其含量開(kāi)始下降[12]。

圖1 發(fā)酵過(guò)程中粗蛋白含量的變化Fig.1 The changes of crude protein contents during fermentation

圖2 發(fā)酵過(guò)程中粗纖維含量的變化Fig.2 The changes of crude fiber degradation contents during fermentation

圖3 發(fā)酵過(guò)程中類胡蘿卜素含量的變化Fig.3 The changes of carotenoid contents during fermentation

2.1.4 可溶性蛋白含量的變化從圖4可知發(fā)酵96 h，可溶性蛋白含量從（11.93±1.18）mg/g升至（39.67±2.54）mg/g，提高232.52%。各時(shí)間段可溶性蛋白含量相對(duì)于原樣（發(fā)酵0 h）中可溶性蛋白含量存在極顯著性的增加（P＜0.01）。發(fā)酵0～36 h，可溶性蛋白含量急速增加，是因?yàn)榇謮衙}紋孢菌為滿足自身生長(zhǎng)繁殖，大量分解底物的蛋白質(zhì)，使其分解成氨基酸、多肽等物質(zhì)。發(fā)酵36～72 h，可溶性蛋白基本保持不變。發(fā)酵72～96 h，可溶性蛋白含量又呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，可能是發(fā)酵后期，底物被大量消耗的同時(shí)菌體死亡并破裂，菌體的內(nèi)源性蛋白等物質(zhì)流出。

圖4 發(fā)酵過(guò)程中可溶性蛋白含量的變化Fig.4 The changes of soluble protein contents during fermentation

2.1.5 酸溶性蛋白含量的變化 各時(shí)間段酸溶性蛋白含量相對(duì)于原樣（發(fā)酵0 h）中酸溶性蛋白含量均極顯著性地增加（P＜0.01）。從圖5可知，菜籽粕原料中酸溶性蛋白含量?jī)H（6.33±0.03）g/100g，發(fā)酵24 h后酸溶性蛋白含量達(dá)到最大值（25.86±0.04）g/100g，提高了232.52%。發(fā)酵24～36 h酸溶性蛋白含量下降，原因是發(fā)酵過(guò)程中酸溶蛋白含量達(dá)到最高后，再延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間，粗壯脈紋孢菌可將蛋白質(zhì)降解成肽類和氨基酸等，并可能繼續(xù)降解為氨等揮發(fā)性成分，從而使發(fā)酵產(chǎn)品中酸溶蛋白含量下降[21]，36 h后基本保持穩(wěn)定。

圖5 發(fā)酵過(guò)程中酸溶性蛋白含量的變化Fig.5 The changes of acid soluble protein contents during fermentation

2.1.6 游離氨基酸含量的變化 由表1可知，發(fā)酵可大幅度提高菜籽粕中大部分游離氨基酸的含量，發(fā)酵前為2.60mg/g，發(fā)酵96 h后為21.41mg/g，提高了18.81mg/g。其中，谷氨酸變化最大，提高了6.65mg/g，總必需氨基酸的含量發(fā)酵后較發(fā)酵前提高了6.64mg/g。

表1 游離氨基酸含量的變化Table1 The changes of free amino acid contents

2.2 抗?fàn)I養(yǎng)因子含量的變化

發(fā)酵過(guò)程中單寧、植酸、硫甙含量均呈下降趨勢(shì)，且存在顯著性差異（P＜0.05），表明粗壯脈紋孢菌固態(tài)發(fā)酵菜籽粕有減少菜籽粕中抗?fàn)I養(yǎng)因子的作用。單寧降解率為24.98%，相對(duì)于肖萌[22]使用益生菌發(fā)酵菜籽粕單寧降解率為5.40%，Wang等[23]利用產(chǎn)芥子酸的真菌發(fā)酵菜籽粕單寧的降解率15.80%來(lái)說(shuō)高出很多。植酸的降解率為10.20%，與肖萌[22]用益生菌發(fā)酵菜籽粕的植酸降解率10.10%相近，而低于孫林等[24]利用枯草芽孢桿菌發(fā)酵菜籽粕后植酸降解率為90.15%和陳娟等[25]利用多菌發(fā)酵使植酸降解率為43.90%。硫甙降解率為14.79%，與孫林等[24]利用蠟樣芽孢桿菌發(fā)酵菜籽粕的硫甙降解率13.56%相近。相比于肖萌[22]利用混合益生菌發(fā)酵菜籽粕的降解率42.50%以及李燕[26]用多菌進(jìn)行混菌發(fā)酵使硫甙脫除率達(dá)到92.12%要低，采用混菌發(fā)酵可能更有效降低菜籽粕中的抗?fàn)I養(yǎng)因子。

表2 抗?fàn)I養(yǎng)因子含量的變化Table2 The changes of anti-nutritional factor contents

2.3 菜籽粕蛋白的SDS-PAGE分析

圖6 SDS-PAGE分析Fig.6 SDS-PAGE analysis

從圖6可看出，原料菜籽粕蛋白主要集中在10~35 ku，接種粗壯脈紋孢菌后，由于微生物開(kāi)始利用菜籽粕中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)生長(zhǎng)，使得蛋白質(zhì)降解，發(fā)酵96 h后，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量降到15 ku以下，說(shuō)明原料中的大分子蛋白經(jīng)發(fā)酵被降解成小分子，這些小分子蛋白或多肽有利于動(dòng)物胃、腸道的吸收利用[27]。

3 結(jié)論

粗壯脈紋孢菌固態(tài)發(fā)酵菜籽粕可使菜籽粕中的粗蛋白、酸溶性蛋白、類胡蘿卜素，可溶性蛋白、總氨基酸含量增加，這些都利于動(dòng)物的消化和吸收；同時(shí)也可使粗纖維含量以及單寧、植酸、硫甙等抗?fàn)I養(yǎng)因子含量下降，有效解決了未經(jīng)處理的菜籽粕用于飼料的安全性問(wèn)題。本方法簡(jiǎn)單實(shí)用，可用于大批量菜籽粕飼料的生產(chǎn)，提高菜籽粕的利用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)效益。