陳建清 陶元平 楊遠(yuǎn) 胡良凱△

(1.上海市楊浦區(qū)市東醫(yī)院消化內(nèi)科，上海 200438；2.海軍軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院肝外三科，上海 200433)

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一,由于缺乏早期診斷標(biāo)志物和有效的治療靶點(diǎn)，大部分患者預(yù)后較差[1]。因此探索研究導(dǎo)致HCC發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，尋找新的有效治療靶點(diǎn)尤為重要。microRNAs(miRNAs)是一類單鏈非編碼RNA分子，通過與靶基因互補(bǔ)的序列結(jié)合抑制其翻譯過程或者直接降解mRNA，從而在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因的表達(dá)[2-3]。越來越多的證據(jù)表明，miRNAs在多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用[4-5]。miRNA-454-3p在各種類型的癌癥中發(fā)揮抑癌或致癌基因的作用。然而，miR-454-3p在HCC的生物學(xué)作用和分子機(jī)制的研究仍然非常有限。因此，本研究將深入探討miR-454-3p在肝細(xì)胞癌進(jìn)展中的作用和相應(yīng)的分子學(xué)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1組織標(biāo)本 本研究選取2010年1月1日至2013年12月31日于海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬東方肝膽外科醫(yī)院手術(shù)切取及病理確診為原發(fā)性肝癌的患者，取其肝癌組織及相應(yīng)癌旁組織(距離癌灶>5cm)各75例。所有患者HBsAg均陽性，術(shù)前均未行放化療或靶向治療，平均年齡(56.1±11.3)歲，其中男性60例，女性15例；血甲胎蛋白(AFP)水平>400 ng/mL 41例；腫瘤直徑>5 cm 41例；BCLC分期A期25例、B期50例、C期 0 例?；颊吲R床資料在醫(yī)院病案室查得，術(shù)前均未接受過放、化療治療。本研究經(jīng)海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬東方肝膽外科醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)?；颊邔?duì)本研究均知情同意。

1.2主要材料 肝癌細(xì)胞系(Huh-7、HepG2、MHCC-97H、HCCLM3、SMMC-7721)、正常肝上皮細(xì)胞系(LO2)和HEK-293T細(xì)胞均購自上?？茖W(xué)院細(xì)胞庫。DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；特級(jí)澳洲胎牛血清和0.25% EDTA-胰蛋白酶購自美國Gibco公司；限制性內(nèi)切酶Xho I、EcoR I、轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000、TRIzol、4×SDS loading buffer(Invitrogen)和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，SYBR Green試劑盒和RNAase free water均購自日本TaKaRa公司；miR-454-3p模擬物、miR-454-3p抑制劑和VGLL4過表達(dá)慢病毒購自上海吉瑪公司；SDS-PAGE凝膠配置試劑盒購自廣州碧云天公司；VGLL4抗體和GAPDH 抗體購自美國Abcam公司；BCA 蛋白定量試劑盒購和蛋白Marker自美國Thermo公司；ECL發(fā)光液購自美國Millipore公司；PVDF膜購自美國Whatman公司；Transwell小室購自美國Corning公司，實(shí)驗(yàn)所用引物由上海生工公司合成，其他生化試劑均為進(jìn)口分裝或國產(chǎn)分析純。

1.3方法

1.3.1細(xì)胞轉(zhuǎn)染 肝癌細(xì)胞系(Huh-7、HepG2、MHCC-97H、HCCLM3、SMMC-7721)、正常肝上皮細(xì)胞系(LO2)和HEK-293T細(xì)胞復(fù)蘇后，用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，置37℃、5% CO2、飽和濕度的恒溫孵箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合度大約為80%時(shí)用胰酶消化傳代。將對(duì)數(shù)生長期HepG2和 SMMC7721細(xì)胞種植于6孔培養(yǎng)板中(每孔大約1×105細(xì)胞)，第2天觀察細(xì)胞融合度大約為50%并開始進(jìn)行轉(zhuǎn)染。miR-454-3p模擬物(miR-454-3p mimic)和miR-control、miR-454-3p抑制劑(miR-454-3p inhibitor)和miR-NC、VGLL4過表達(dá)慢病毒以及對(duì)照組(NC) 購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。VGLL4野生型3’-UTR 和突變型3’-UTR 由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成并連接到psi-CHECK-2載體。采用Lipofectamine2000分別轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染步驟參照Invitrogen說明書。

1.3.2qRT-PCR檢測(cè) 收集組織和肝癌細(xì)胞系(Huh-7、HepG2、MHCC-97H、HCCLM3、SMMC-7721)、正常肝上皮細(xì)胞系(LO2)樣品，加入1 mL Trizol提取液提取細(xì)胞總RNA。頸環(huán)法反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，取1 μL cDNA樣品用于miR-454-3p或VGLL4檢測(cè)；SYBR Green 法進(jìn)行PCR檢測(cè)。miR-454-3p及內(nèi)參U6、VGLL4及內(nèi)參GAPDH PCR引物購自廣州銳博生物科技有限公司，PCR 擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性5 min，然后94℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 1 min 30 s進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣重復(fù)3次。引物如下：miR-454-3p：正向5’-ACCCTATCAATATTGTCTCTGC-3’，反向5’-GCGAGCACAGAATTAATACGAC-3’；U6：正向5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，反向5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’；VGLL4：正向5’-CTCGCACTGACCAAGAACAG-3’，反向5’-TGCGAGAGGTTGCAGTTG-3’；GAPDH：正向5’-CAGGGCTGCTTTTAACTCTGGT-3’，反向5’-GATTTTGGAGGGATCTCGCT-3’。分別以GAPDH和U6作為mRNA和miRNA的內(nèi)參基因。用2-ΔΔCt方法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)水平。

1.3.3蛋白質(zhì)印跡法 向收集處理好的各組肝癌細(xì)胞，加入RIPA蛋白裂解液，冰上裂解，于4℃ 12 000 r/min離心15 min，取上清進(jìn)行蛋白質(zhì)定量后分裝，加入4×上樣緩沖液，70℃加熱10 min使蛋白質(zhì)變性，然后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳。用PVDF膜轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，用相應(yīng)的抗體anti-VGLL4(1∶1 000)4 ℃孵育過夜。TBST洗膜，加入二抗(1∶5 000)室溫孵育1 h。ECL發(fā)光試劑盒顯影，以GAPDH(1∶5 000)為內(nèi)參照，掃描灰度值并分析蛋白表達(dá)相對(duì)含量。

1.3.4MTT比色實(shí)驗(yàn) 將miR-454-3p mimic轉(zhuǎn)染至HepG2細(xì)胞、miR-454-3p inhibitor轉(zhuǎn)染至SMMC-7721細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后，將處于對(duì)數(shù)生長期的各組細(xì)胞胰酶消化，制成細(xì)胞懸液，接種至96孔板(2×l03/孔)中。培養(yǎng)24，48，72，96 h后，加入20 μL 5 g/L MTT，孵育4 h后離心去掉上清，加入DMSO 150 μL溶解結(jié)晶，測(cè)定吸光度A450nm。

1.3.5侵襲試驗(yàn) 將Transwell侵襲小室置入24孔板中，在Transwell小室的下室加入含10% FBS的DMEM高糖培養(yǎng)液，收集轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞重懸，加入200 μL重懸液共2×104細(xì)胞到Transwell小室的上室，其余操作步驟依參考文獻(xiàn)進(jìn)行[6]。

1.3.6基因分析 miR-454-3p使用預(yù)測(cè)軟件Targetscan(http://www.targetscan.org)進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)。為了確定VGLL4 mRNA的3’-UTR 是否為miR-454-3p的直接靶蛋白，VGLL4 mRNA的野生型全長3'-UTR及突變型3’-UTR擴(kuò)增并連接到psi-CHECK-2載體(Promega，美國)，分別命名為3’-UTR -VGLL4-WT和3’-UTR -VGLL4-MUT。HEK-293T細(xì)胞共轉(zhuǎn)染200 nmol/L miR-NC或者miR-454-3p模擬物和100 ng質(zhì)粒(3’-UTR-VGLL4-WT或3’-UTR-VGLL4-MUT)，24孔板培養(yǎng)48 h。收集細(xì)胞裂解，Renilla和firefly熒光素酶熒光強(qiáng)度使用Dual-Luciferase報(bào)告分析系統(tǒng)(Promega)進(jìn)行分析。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 18.0版進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。miR-454-3p在肝癌和癌旁組織中表達(dá)情況的比較采用配對(duì)樣本的t檢驗(yàn); 不同組間細(xì)胞侵襲數(shù)的比較采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)或單因素方差分析和LSD-t檢驗(yàn)；兩組間細(xì)胞增殖能力的比較采用2×5析因設(shè)計(jì)的方差分析；皮爾森相關(guān)系數(shù)分析miR-454-3p和VGLL4相關(guān)性。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1miR-454-3p在肝癌組織和肝癌細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào) qRT-PCR結(jié)果提示，與癌旁組織(0.223 ±0.017)相比,miR-454-3p在肝癌組(0.145±0.010)的相對(duì)表達(dá)量上調(diào)(圖1A)。采用同樣的試驗(yàn)方法檢測(cè)miR-454-3p在細(xì)胞中的表達(dá)水平，qRT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)LO2、SMMC-7721、MHCC-97H、HCCLM3、Huh-7和HepG2細(xì)胞中miR-454-3p的相對(duì)表達(dá)量為(1.000±0.029)，(5.542 ±0.418)，(4.538 ±0.979)，(3.993 ±0.484)，(3.274 ±0.331) 和(2.060 ±0.080)。和人正常肝細(xì)胞系LO2相比，肝癌細(xì)胞系SMMC-7721、MHCC-97H、HCCLM3、Huh-7和HepG2細(xì)胞中miR-454-3p的表達(dá)上調(diào)，差異顯著具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1B)。

2.2miR-454-3p促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力 qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，miR-454-3p在HepG2細(xì)胞中的表達(dá)miR-454-3p mimic組于control組相比，上調(diào)10.280倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001);在SMMC-7721細(xì)胞中miR-454-3p inhibitor組于miR-NC組相比，下調(diào)5.128倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。結(jié)果證明miR-454-3p模擬物和抑制劑轉(zhuǎn)染成功(圖2A)。MTT結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-454-3p后，HepG2細(xì)胞的增殖能力增強(qiáng)，與control組相比，在72 h和96 h差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；相反的，抑制miR-454-3p后,SMMC-7721細(xì)胞的增殖能力減弱，與miR-NC組相比,在72 h和96 h差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01、P<0.001)(圖2B)。在HepG2細(xì)胞中miR-454-3p mimic組和control組的侵襲細(xì)胞數(shù)分別(279±11)和(185±5)。在SMMC-7721細(xì)胞中miR-454-3p inhibitor組和miR-NC組的侵襲細(xì)胞數(shù)分別(251±13)和(140±13)。結(jié)果表明，miR-454-3p上調(diào)可顯著增強(qiáng)HepG2細(xì)胞的侵襲能力。相比之下，miR-454-3p下調(diào)降低了SMMC-7721細(xì)胞的侵襲能力(圖2C)。

2.3VGLL4是miR-445-3p的直接靶基因 如圖3A所示，qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)VGLL4的mRNA表達(dá)在HepG2細(xì)胞中miR-454-3p mimic組于control組相比，下調(diào)5.128倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001);在SMMC-7721細(xì)胞中miR-454-3p inhibitor組于miR-NC組相比，上調(diào)5.667倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)VGLL4的蛋白的表達(dá)趨勢(shì)和mRNA一致(圖3B)。為了證明VGLL4是否為miR-454-3p的靶基因，采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)(圖3C)。VGLL4-WT+control組和VGLL4-WT+ miR-454-3p mimic組的熒光活性變化倍數(shù)分別為(1.108±0.070)和(0.383±0.017)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。VGLL4-MUT+control組及VGLL4-MUT+miR-454-3p mimic組的熒光活性變化倍數(shù)分別為(1.139±0.083)和(1.060±0.101)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。利用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)HCC組織和對(duì)應(yīng)癌旁組織中VGLL4的mRNA表達(dá)情況，以GAPDH為內(nèi)參基因，結(jié)果提示，與癌旁組織(0.264±0.016)相比,VGLL4在肝癌組(0.176±0.011)的相對(duì)表達(dá)量降低(圖3E)。皮爾森相關(guān)系數(shù)分析提示，在75例HCC組織中miR-454-3p和VGLL4 mRNA表達(dá)成負(fù)相關(guān)(圖3F)。

2.4上調(diào)VGLL4表達(dá)抵消了miR-454-3p促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的能力 MTT結(jié)果顯示，miR-454-3p mimic +VGLL4組與control組相比，在24，48，72，96 h差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。侵襲實(shí)驗(yàn)研究顯示，在HepG2細(xì)胞中miR-454-3p mimic +VGLL4組和control組的侵襲細(xì)胞數(shù)分別(175±2)和(179±5)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。以上數(shù)據(jù)表明miR-454-3p可通過調(diào)節(jié)VGLL4的表達(dá)而發(fā)揮促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的能力(圖4A～C)。

3 討 論

在本研究中，我們闡明了miRNA-454-3p在促進(jìn)HCC進(jìn)展中的關(guān)鍵作用的新機(jī)制。我們發(fā)現(xiàn)，miRNA-454-3p在肝癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)顯著上調(diào)。我們還觀察到miR-454-3p處理可增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力，而敲除miR-454-3p的表達(dá)則產(chǎn)生相反的結(jié)果。此外，我們的研究表明VGLL4是miR-454-3p的直接靶向，本研究提示miR-454-3p在肝癌的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要作用。

VGLL蛋白在哺乳動(dòng)物中有4種亞型，依次命名為VGLL1-4，近期研究發(fā)現(xiàn)VGLL蛋白通過與TEAD相互作用在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[7]。其中，VGLL4攜帶兩個(gè)于TEAD相互作用的TDU域。VGLL4可以通過不同的分子信號(hào)通路抑制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，例；VGLL4可通過負(fù)性調(diào)節(jié)凋亡蛋白抑制劑(IAPs)來促進(jìn)細(xì)胞凋亡[8]。VGLL4在多種腫瘤和癌癥中發(fā)揮抑癌基因的作用[9-13],低表達(dá)的VGLL4通常預(yù)示患者預(yù)后較差。在肺癌中的腫瘤組織中VGLL4的表達(dá)明顯低于對(duì)應(yīng)的癌旁組織,VGLL4和TEAD4之間的交互作用抑制了YAP介導(dǎo)的相關(guān)靶基因的表達(dá)從而抑制了肺癌細(xì)胞的增殖能力[14]。在乳腺癌中，VGLL4同樣通過與YAP結(jié)合，進(jìn)而抑制YAP下游基因來發(fā)揮抑制腫瘤的作用[15]。在胃癌中,VGLL4可以提高E-cadherin蛋白的表達(dá)水平同時(shí)降低β-catenin蛋白表達(dá)水平[16]。最新研究證實(shí)過表達(dá)VGLL4可以抵消MicroRNA-301a-3p 促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的能力。在本研究中，通過熒光素酶報(bào)告分析證實(shí)VGLL4是miR-454-3p的直接靶向。與此同時(shí)，VGLL4的mRNA和蛋白水平與miR-454-3p在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。此外，細(xì)胞功能學(xué)試驗(yàn)證實(shí)過表達(dá)miR-454-3p可促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲。然而，過表達(dá)VGLL4可以抵消miR-454-3p促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲的能力。這些結(jié)果表明miR-454-3p通過調(diào)節(jié)VGLL4的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞增殖和侵襲。

綜上所述，我們證明miR-454-3p在肝癌組織中的上調(diào)表達(dá)，細(xì)胞功能學(xué)試驗(yàn)證實(shí)miR-454-3p促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲。本研究首次證明VGLL4是miR-454-3p的直接靶向。該研究為肝癌的治療提供新的靶點(diǎn)和思路。

(本文圖1～4見封三)