(江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院,江蘇泰州 225300)

我國(guó)淡水魚(yú)養(yǎng)殖與加工業(yè)發(fā)展較快,2017年水產(chǎn)總量已超過(guò)3000萬(wàn)t,但在淡水魚(yú)加工中會(huì)產(chǎn)生大量魚(yú)鱗、魚(yú)皮、魚(yú)骨、魚(yú)內(nèi)臟等下腳料。據(jù)報(bào)道,我國(guó)每年淡水魚(yú)副產(chǎn)物產(chǎn)量在250萬(wàn)噸以上,但絕大部分未被利用,不但造成大量浪費(fèi),還對(duì)環(huán)境造成了污染[1]。

魚(yú)油因富含人體所需的多種多不飽和脂肪酸,近年來(lái)已成為研究開(kāi)發(fā)的熱點(diǎn)。但深海魚(yú)類(lèi)資源有限,且用于提取魚(yú)油成本較高,而青魚(yú)是我國(guó)養(yǎng)殖和加工的主要淡水魚(yú)類(lèi)之一,其內(nèi)臟中含有較多的二十碳五烯酸(EPA)和有腦黃金之稱(chēng)的二十二碳六烯酸(DHA)[2-3],因此,研究青魚(yú)內(nèi)臟魚(yú)油的提取有助于廢棄資源的再生利用,具有較大的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

目前魚(yú)油提取方法主要有蒸煮法、稀堿水解法、低溫提油法、水酶法和酸水解法等[4]。微波輔助萃取相比其他傳統(tǒng)提取方法,具有升溫快速均勻、熱效率高、無(wú)污染、溶劑回收率高等優(yōu)點(diǎn),大大縮短了提取時(shí)間,提高了萃取得率,節(jié)約了成本[5-7]。李雪等[8]利用微波輔助正己烷萃取羅非魚(yú)魚(yú)油,魚(yú)油萃取得率明顯提高。趙超等[9]采用微波輔助無(wú)水乙醇提取林蛙卵油,林蛙卵油的提取率可達(dá)到20%±0.67%。而至今未見(jiàn)有關(guān)于微波輔助酶提取青魚(yú)內(nèi)臟魚(yú)油的報(bào)道。本研究用微波輔助酶法提取青魚(yú)內(nèi)臟魚(yú)油,對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,并通過(guò)氣相色譜分析方法對(duì)魚(yú)油脂肪酸組成進(jìn)行分析測(cè)定,為淡水魚(yú)下腳料的綜合開(kāi)發(fā)利用提供新路徑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

青魚(yú) 購(gòu)自大型超市;胰蛋白酶(250 U/g) 上海伯奧生物科技有限公司;胃蛋白酶(3000 U/g)、中性蛋白酶(8000 U/g)、堿性蛋白酶(5000 U/g) 上海伯奧生物科技有限公司;37 種混合脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品 美國(guó)Sigma公司;其他試劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純(AR)。

AL204型電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司;DS-1型組織搗碎機(jī) 上海精密儀器儀表有限公司;EL20K型酸度計(jì) 梅特勒-托利多儀器有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海青浦滬西儀器廠;MKJ-J1-8型實(shí)驗(yàn)室微波爐 青島邁威機(jī)電有限公司;7890B氣相色譜(GC)儀 美國(guó)Agilent公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 原料預(yù)處理 新鮮青魚(yú)內(nèi)臟,去除內(nèi)臟中的殘留物,洗凈,瀝干,在組織搗碎機(jī)中搗碎,混勻,置于4 ℃冰箱冷藏備用[10]。

1.2.2 魚(yú)油的微波輔助酶提取 每份樣品稱(chēng)20.0 g,置于250 mL錐形瓶中,按固液比(3∶1)加入蒸餾水,再用NaOH(1∶1,W/V)溶液調(diào)節(jié)pH至蛋白酶最適值,然后加入一定量的蛋白酶,在一定溫度條件下保溫酶解一段時(shí)間,酶解過(guò)程中,每隔一段時(shí)間搖一次,酶解完成后,倒出酶解液,用適量蒸餾水沖洗錐形瓶,溶液并入酶解液,100 ℃水浴滅酶10 min后于微波爐中在一定功率下進(jìn)行微波萃取一定時(shí)間,將微波輔助酶提取液在4000 r/min下離心15 min,用移液槍收集上層油脂相,得到青魚(yú)內(nèi)臟粗魚(yú)油[11-12]。

1.2.3 魚(yú)油的精制

1.2.3.1 脫膠 將經(jīng)微波輔助酶提取所得全部青魚(yú)內(nèi)臟粗魚(yú)油加熱至70 ℃,并不斷攪拌,然后按魚(yú)油量1%緩慢加入50%的磷酸,并攪拌1 min,取出魚(yú)油以4500 r/min離心10 min,用移液槍吸出上層油狀液體,即為脫膠魚(yú)油[13]。

1.2.3.2 脫酸 將經(jīng)脫膠所得全部魚(yú)油置于水浴鍋中,加熱至50 ℃,加入1.5%魚(yú)油量濃度為20%的氫氧化鈉溶液,攪拌后加熱至70 ℃下并保溫30 min,取出魚(yú)油,冷卻后4500 r/min離心10 min,去除下層固體沉淀,用50 mL熱去離子水洗去魚(yú)油中殘留皂,反復(fù)3次,4500 r/min離心10 min,用移液槍吸出上層淡黃色液體即為脫酸魚(yú)油。

1.2.3.3 脫色 將脫酸所得全部魚(yú)油水浴加熱至70 ℃,加入2%魚(yú)油量的活性炭,恒溫?cái)嚢?0 min,抽濾[14]。

1.2.3.4 脫臭 在70 ℃水浴中,利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀對(duì)所得脫色魚(yú)油真空脫臭60 min,即為脫臭魚(yú)油。

1.2.4 魚(yú)油得率計(jì)算

式(1)

式中:X為魚(yú)油得率(%);m1為提取的魚(yú)油質(zhì)量(g);m2為青魚(yú)內(nèi)臟質(zhì)量(g)[15]。

1.2.5 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.5.1 酶種類(lèi)對(duì)魚(yú)油得率的影響 分別選用胃蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶,在酶加入量2.0%,酶解溫度、pH為各種酶的最適溫度、最適pH,酶解時(shí)間2.0 h,微波功率300 W和微波處理時(shí)間10 min[15]的條件下進(jìn)行魚(yú)油提取分析,篩選出最合適的酶。

1.2.5.2 酶加入量對(duì)魚(yú)油得率的影響 利用篩選出的最合適的酶,在酶解溫度為50 ℃、酶解時(shí)間2.0 h、微波功率300 W和微波處理時(shí)間10 min的條件下,酶加入量分別為0.5%、1%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%時(shí)進(jìn)行魚(yú)油微波輔助酶提取,根據(jù)魚(yú)油得率確定酶的最佳添加量。

1.2.5.3 酶解時(shí)間對(duì)魚(yú)油得率的影響 利用篩選出的最合適的酶,在酶解溫度為 50 ℃、酶加入量2.0%、微波功率300 W和微波處理時(shí)間10 min的條件下,酶解時(shí)間分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h時(shí)進(jìn)行魚(yú)油微波輔助酶提取,根據(jù)魚(yú)油得率確定最佳酶解時(shí)間。

1.2.5.4 酶解溫度對(duì)魚(yú)油得率的影響 利用篩選出的最合適的酶,在酶加入量2.0%、酶解時(shí)間2.0 h、微波功率300 W和微波處理時(shí)間10 min的條件下,酶解溫度分別為35、40、45、50、55、60 ℃時(shí)進(jìn)行魚(yú)油微波輔助酶提取,根據(jù)魚(yú)油得率確定最佳酶解溫度。

1.2.5.5 微波處理時(shí)間對(duì)魚(yú)油得率的影響 利用篩選出的最合適的酶,在酶解溫度為50 ℃、酶加入量2.0%、酶解時(shí)間2.0 h 和微波功率300 W條件下,微波處理時(shí)間分別為5、10、15、20、25、30 min時(shí)進(jìn)行魚(yú)油微波輔助酶提取,根據(jù)魚(yú)油得率確定最佳微波輔助酶提取時(shí)間。

1.2.5.6 微波功率對(duì)魚(yú)油得率的影響 利用篩選出的最合適的酶,酶解溫度為50 ℃、酶加入量2.0%、酶解時(shí)間2.0 h和微波處理時(shí)間10 min的條件下,微波功率分別為100、200、300、400、500、600 W時(shí)進(jìn)行魚(yú)油微波輔助酶提取,根據(jù)魚(yú)油得率確定最佳微波輔助酶提取功率。

1.2.6 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，固定中性蛋白酶為酶解酶，微波功率為400 W，選取酶加入量、酶解時(shí)間、酶解溫度、微波處理時(shí)間為考察因素,采用Box-Behnken模型,利用統(tǒng)計(jì)軟件Design Expert 8.0.6.1進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)與數(shù)據(jù)分析,以魚(yú)油得率為響應(yīng)值,設(shè)計(jì)四因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1[16-17]。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素及水平表Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.2.7 脂肪酸組成測(cè)定 參照GB 5009.168-2016《食品中脂肪酸的測(cè)定》[18],采用氣相色譜法(GC)對(duì)樣品進(jìn)行脂肪酸組成分析。

1.2.7.1 油脂的甲酯化 稱(chēng)取10 g左右魚(yú)油,加入油重10%無(wú)水硫酸鈉,攪拌12 h干燥過(guò)夜,過(guò)濾即得干燥油脂。

取2滴約60 mg干燥后的油脂精確至0.1 mg,于10 mL具塞試管中,加入4 mL異辛烷溶解試樣,必要時(shí)可以微熱使試樣。溶解后加入200 μL 2 mol/L氫氧化鉀甲醇溶液,蓋上玻璃塞猛烈振搖30 s后靜置至澄清。加入約1 g硫酸氫鈉,猛烈振搖,中和氫氧化鉀。待鹽沉淀后,將上清液移至樣品瓶中,供GC分析。

1.2.7.2 脂肪酸的氣相色譜分析條件 色譜條件:色譜柱采用HP-5MS毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm),載氣為氦氣(He),進(jìn)樣溫度 270 ℃,柱流量1 mL/min,分流比100∶1,進(jìn)樣量1.0 μL,柱溫箱溫度程序?yàn)槌跏紲囟?00 ℃,保持13 min,以10 ℃/min速率升溫至180 ℃,保持6 min,再以1 ℃/min速率升溫至200 ℃,保持20 min,然后以4 ℃/min速率升溫至230 ℃,保持10.5 min[19-21]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,所有實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn),取其平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 酶種類(lèi)對(duì)魚(yú)油得率的影響 由表2可以看出,中性蛋白酶的酶解效果最佳,堿性蛋白酶的提油率最差,胰蛋白酶酶解效果比中性蛋白酶略差,提出的魚(yú)油易凝固,故采用中性蛋白酶進(jìn)行魚(yú)油的提取。

表2 不同種類(lèi)酶對(duì)魚(yú)油得率的影響Table 2 Effect of different kinds of enzyme on yield of fish oil

2.1.2 酶加入量對(duì)魚(yú)油得率的影響 從圖1可知,魚(yú)油得率隨著酶加入量的增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì),這可能是由于當(dāng)魚(yú)油全部與酶結(jié)合后,魚(yú)油得率達(dá)到最大值,隨后,再增加酶的用量,魚(yú)油得率不再提高,酶添加量過(guò)多對(duì)酶本身也有一定的水解作用,導(dǎo)致酶活力下降,從而影響魚(yú)油得率[22]。因此酶的適宜加入量為2%。

圖1 酶加入量對(duì)魚(yú)油得率的影響Fig.1 Effect of amount of enzyme on yield of fish oil

2.1.3 酶解時(shí)間對(duì)魚(yú)油得率的影響 從圖2可以看出,魚(yú)油得率隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)而上升,當(dāng)酶解時(shí)間為2～3 h時(shí),得率變化不大。這主要是由于酶解時(shí)間越長(zhǎng),酶與底物結(jié)合得越充分,破壞脂肪和蛋白質(zhì)的結(jié)合就越徹底,從而使脂肪游離出來(lái)[23]。但考慮到時(shí)間過(guò)長(zhǎng)(3 h),會(huì)使魚(yú)油中的多不飽和脂肪酸氧化程度加強(qiáng),而使魚(yú)油品質(zhì)下降。綜合考慮得率和魚(yú)油品質(zhì),選擇酶解時(shí)間2.5 h較佳。

圖2 酶解時(shí)間對(duì)魚(yú)油得率的影響Fig.2 Effect of enzymolysis time on yield of fish oil

2.1.4 酶解溫度對(duì)魚(yú)油得率的影響 從圖3可以看出,魚(yú)油得率隨酶解溫度的升高,先升高后降低,溫度為50 ℃ 時(shí),魚(yú)油得率達(dá)到最大值。這可能是因?yàn)闇囟葘?duì)酶促反應(yīng)具有雙重影響,一方面,酶解溫度升高使分子的熱運(yùn)動(dòng)加快,有利于魚(yú)油得率的增加。但溫度過(guò)高會(huì)使酶蛋白發(fā)生熱變性,從而降低酶的活性甚至使酶喪失活性?？紤]到經(jīng)濟(jì)成本選取40、45、50 ℃3個(gè)水平進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

圖3 酶解溫度對(duì)魚(yú)油得率的影響Fig.3 Effect of enzymolysis temperature on yield of fish oil

2.1.5 微波處理時(shí)間對(duì)魚(yú)油得率的影響 由圖4可知,起初魚(yú)油得率隨著微波處理時(shí)間的增加而增加,當(dāng)微波處理時(shí)間達(dá)到15 min時(shí),魚(yú)油得率達(dá)到最大值。此后隨著微波處理時(shí)間的繼續(xù)延長(zhǎng),魚(yú)油得率變化不明顯。這是因?yàn)槲⒉ㄌ幚頃r(shí)間較短時(shí),微波不能充分提高青魚(yú)內(nèi)臟內(nèi)部的溫度和壓力,而導(dǎo)致魚(yú)油得率不高,隨著微波處理時(shí)間的延長(zhǎng),細(xì)胞中的油脂與提取溶液逐漸達(dá)到了相對(duì)平衡。當(dāng)微波處理時(shí)間大于15 min以后,魚(yú)油得率變化緩慢,考慮到微波處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致溫度升高,油會(huì)分解或揮發(fā),因此,確定魚(yú)油的最佳微波處理時(shí)間為15 min。

圖4 微波處理時(shí)間對(duì)魚(yú)油得率的影響Fig.4 Effect of microwave treatment time on yield of fish oil

2.1.6 微波功率對(duì)魚(yú)油得率的影響 由圖5可知,當(dāng)微波功率在400 W內(nèi),魚(yú)油得率隨微波功率的增加呈上升趨勢(shì),當(dāng)微波功率達(dá)400 W時(shí),魚(yú)油得率最大。這是因?yàn)槲⒉üβ试酱?熱效應(yīng)越激烈,對(duì)青魚(yú)內(nèi)臟蛋白質(zhì)與魚(yú)油結(jié)合的部分破壞就越充分,使得魚(yú)油得率增大。而當(dāng)微波功率大于400 W時(shí),會(huì)導(dǎo)致溫度升高,溶劑沸騰,造成低沸點(diǎn)揮發(fā)油損失,導(dǎo)致魚(yú)油得率下降,所以確定微波功率為400 W。

圖5 微波功率對(duì)魚(yú)油得率的影響Fig.5 Effect of microwave power on yield of fish oil

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果及方差分析 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,利用Design Expert 8.0.6.1軟件中的Box-Behnken程序進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì),結(jié)果見(jiàn)表3,方差分析結(jié)果見(jiàn)表4。

表3 Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 Box-Behnken response surface design and experimental results

利用統(tǒng)計(jì)軟件Design-Expert.8.0.6.1對(duì)表3數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析,得出響應(yīng)面回歸方程為:Y=26.17-0.43A-0.62B+1.37C-1.83D-0.075AB+0.13AC-0.47AD-0.28BC+0.85BD+1.18CD-3.08A2-3.07B2-0.96C2-1.70D2。

表4 回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis for the established model

注:***:差異極顯著,P<0.001;**:差異高度顯著,P<0.01;*:差異顯著,P<0.05。

從表4可以看出,研究模型P<0.0001,表明模型極顯著,失擬項(xiàng)(P=0.063>0.05)不顯著,模型的相關(guān)系數(shù)達(dá)到了0.9532,說(shuō)明模型對(duì)本實(shí)驗(yàn)擬合程度較好,結(jié)果真實(shí)準(zhǔn)確。一次項(xiàng)C、D對(duì)魚(yú)油得率的影響均達(dá)到了極顯著水平(P<0.001),B為高度顯著(P<0.01),A為顯著(P<0.05);交互項(xiàng)CD高度顯著(P<0.05),BD顯著(P<0.05)。同時(shí)從F值可以看出,各因素對(duì)魚(yú)油得率影響大小依次為D>C>B>A,即影響因素微波處理時(shí)間>酶解溫度>酶解時(shí)間>酶加入量。

2.2.2 響應(yīng)面交互作用分析 由圖6可知,酶解時(shí)間和微波處理時(shí)間交互作用及酶解溫度與微波處理時(shí)間的交互作用均顯著,表現(xiàn)為響應(yīng)面圖較陡,響應(yīng)面分析結(jié)果與前面回歸模型方差分析顯著性檢驗(yàn)結(jié)果一致。

圖6 各因素交互作用對(duì)魚(yú)油得率影響的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface map of the interaction of various factors on yield of fish oil

根據(jù)回歸模型,采用Design-Expert 8.0.6.1軟件對(duì)各因素進(jìn)行優(yōu)化,得出微波輔助提取青魚(yú)內(nèi)臟魚(yú)油的最佳工藝為酶加入量1.98%、酶解時(shí)間2.32 h、酶解溫度45.49 ℃、微波處理時(shí)間14.59 min,在此工藝條件下,得到魚(yú)油得率的預(yù)測(cè)值為26.94%。為了便于操作,將工藝條件修正為酶加入量2.0%、酶解時(shí)間2.5 h、酶解溫度45 ℃、微波處理時(shí)間15 min,在此條件下進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn),魚(yú)油得率為26.26%±0.13%,實(shí)際值與預(yù)測(cè)值基本相符,偏差較小,說(shuō)明模型對(duì)青魚(yú)內(nèi)臟魚(yú)油提取工藝條件參數(shù)優(yōu)化是可靠可行的。

2.3 魚(yú)油中脂肪酸組成

對(duì)精制后的青魚(yú)內(nèi)臟魚(yú)油脂肪酸成分進(jìn)行GC分析,計(jì)算脂肪酸含量[9,24-26]。青魚(yú)內(nèi)臟魚(yú)油的脂肪酸中飽和脂肪酸有3種,占總脂肪酸含量的22.39%,其中以棕櫚酸、硬脂酸為主。單不飽和脂肪酸有3種,占總脂肪酸含量的40.42%,主要為油酸和棕櫚油酸。多不飽和脂肪酸有8種,占總脂肪酸含量的37.19%,主要為亞油酸,還含有少量的亞麻酸、二十碳二烯酸、二十碳三烯酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、二十碳六烯酸等。

3 結(jié)論

采用響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)回歸的方法,得出微波輔助提取青魚(yú)內(nèi)臟魚(yú)油的回歸模型方程為:Y=26.17-0.43A-0.62B+1.37C-1.83D-0.075AB+0.13AC-0.47AD-0.28BC+0.85BD+1.18CD-3.08A2-3.07B2-0.96C2-1.70D2。通過(guò)對(duì)各因素進(jìn)行方差分析表明:酶解溫度、微波處理時(shí)間對(duì)魚(yú)油得率為極顯著(P<0.001),酶解時(shí)間對(duì)魚(yú)油得率高度顯著(P<0.01),酶加入量對(duì)魚(yú)油得率顯著(P<0.05)。各因素對(duì)魚(yú)油得率影響大小依次為微波處理時(shí)間>酶解溫度>酶解時(shí)間>酶加入量。微波輔助提取青魚(yú)內(nèi)臟魚(yú)油的最佳工藝為酶加入量2.0%、酶解時(shí)間2.5 h、酶解溫度45 ℃、微波處理時(shí)間15 min,在此條件下魚(yú)油得率為26.26%±0.13%。

采用GC法對(duì)脂肪酸成分分析,青魚(yú)內(nèi)臟魚(yú)油的脂肪酸中飽和脂肪酸有3種,占總脂肪酸含量的22.39%,主要為棕櫚酸和硬脂酸。單不飽和脂肪酸3種,占總脂肪酸含量的40.42%,主要為油酸和棕櫚油酸。多不飽和脂肪酸8種,占總脂肪酸含量的37.19%,主要為亞油酸。