李衛(wèi)玲,茹 琴,林 款,鄭小茂,李超英

(江漢大學武漢生物醫(yī)學研究院,湖北武漢 430056)

糖尿病是一種在全球范圍內(nèi)廣泛流行的體內(nèi)胰島素的相對或絕對分泌不足引起的糖類、脂質(zhì)及蛋白質(zhì)代謝紊亂的內(nèi)分泌疾病,可引起多種慢性并發(fā)癥[1]。糖尿病的致病原因是多方面的,糖尿病的發(fā)病和進展與胰島β細胞密切相關(guān),主要包括胰島β細胞數(shù)量減少和(或)β細胞功能障礙。有研究表明,細胞凋亡造成胰島β細胞數(shù)量減少、胰島結(jié)構(gòu)破壞和功能受損是糖尿病發(fā)病的重要原因,線粒體內(nèi)的氧化應(yīng)激毒性是β細胞凋亡的直接原因[2]。

近年有臨床報道,蓼科蓼屬虎杖(PolygonumCuspidatumSieb. et Zucc)可以作為治療糖尿病主藥,并且療效較好[3]?；⒄溶?Polydatin)是從虎杖干燥根莖中提取的主要生物活性成分之一,是白藜蘆醇配糖體,又叫白藜蘆醇苷,屬于芪類化合物,即羥基二苯乙烯類化合物,化學名稱為3,4,5-三羥基芪-3-單-D-葡萄糖苷?；⒄溶帐翘烊坏目寡趸瘎?可在體內(nèi)代謝產(chǎn)生白藜蘆醇,因此與白藜蘆醇有相似的藥理學作用,可通過促進自噬、抑制凋亡、抗氧化等機制,發(fā)揮內(nèi)臟保護、神經(jīng)保護、免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤活性等多種藥理學作用[4-5]。研究表明,虎杖苷對于鏈脲菌素致糖尿病大鼠模型具有明顯的降糖作用。Hao等[6]研究發(fā)現(xiàn),虎杖苷能增加胰島素受體底物磷酸化水平,激活A(yù)kt信號通路,顯著降低糖尿病大鼠模型的糖脂代謝。有研究報道,在糖尿病模型中虎杖苷能夠調(diào)控Nrf2-ARE抗氧化通路,促進Nrf2表達,轉(zhuǎn)錄活性,及與ARE結(jié)合,促進下游HO-1和SOD1表達[7]。研究表明,白藜蘆醇具有保護胰島β細胞的作用[8-10],而虎杖苷對胰島細胞的作用暫未見報道。

本研究采用體外培養(yǎng)INS-1細胞為研究對象,采用特異性胰島β細胞毒劑四氧嘧啶建立損傷模型,研究虎杖苷對胰島細胞活性和功能的影響及對四氧嘧啶致胰島細胞損傷的保護作用,初步探討其對胰島β細胞氧化應(yīng)激與凋亡的保護作用的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大鼠胰島素瘤細胞INS-1細胞 上海博谷生物科技有限公司,細胞均用RPMI 1640完全培養(yǎng)基(含10% 胎牛血清、100 U/mL青霉素及100 μg/mL鏈霉素),于37 ℃、5% CO2培養(yǎng);RPMI-1640完全培養(yǎng)基、胎牛血清、青鏈霉素、克-林重碳酸鹽緩沖液(KRB)、磷酸鹽緩沖液(PBS)和0.25%胰蛋白酶 均購自Gibco公司;四氧嘧啶(Alloxan)、3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、DCFH-DA探針 均購自Sigma公司;虎杖苷(純度≥98%) 購自北京儀化通標科技有限公司;一氧化氮(NO)檢測試劑盒、Caspase-3和Caspase-9活性檢測試劑盒 碧云天生物技術(shù)公司;乳酸脫氫酶(LDH)、還原型谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)檢測試劑盒 南京建成生物科技有限公司;BCA蛋白濃度測定試劑盒 博士德生物工程有限公司;大鼠胰島素檢測試劑盒 上海酶聯(lián)生物有限公司;其余試劑 均為國產(chǎn)分析純。

3308型CO2培養(yǎng)箱、Multiskan Go全波長讀數(shù)儀、Fluoroskan Ascent FL熒光和化學發(fā)光檢測儀 Thermo公司;BX51倒置顯微鏡及成像系統(tǒng) 奧林巴斯公司;UP-250手持式超聲細胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及分組 INS-1細胞用完全培養(yǎng)基培養(yǎng),倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況,細胞融合度達到約90%時,PBS漂洗,0.25%胰酶消化,細胞計數(shù)后分板培養(yǎng)。四氧嘧啶造模濃度選擇實驗中,INS-1細胞分7組,分別加入不同濃度的四氧嘧啶(0、5、10、15、20、25、30 mmol/L),確定后續(xù)實驗中四氧嘧啶給藥濃度?；⒄溶諠舛冗x擇實驗中,INS-1細胞分8組,分別加入不同濃度的虎杖苷(0、5、10、25、50、100、200、400 μg/mL),細胞增殖實驗檢測細胞存活率,確定后續(xù)實驗中虎杖苷給藥濃度?；⒄溶毡Ｗo實驗中,INS-1細胞分4組,分別為空白組(完全培養(yǎng)基)、模型組(18 mmol/L四氧嘧啶)和不同濃度虎杖苷保護組(分別給予25、50 μg/mL虎杖苷,同時給予18 mmol/L四氧嘧啶),分別檢測細胞存活率、LDH釋放、葡萄糖刺激胰島素分泌量、Caspase-3和Caspase-9活性、活性氧(ROS)、NO、SOD、GSH和MDA的含量。

1.2.2 細胞活性的測定 采用MTT法測定細胞存活率[11]。INS-1細胞接種于96孔板中,細胞密度為5×104個/孔,37 ℃培養(yǎng)過夜。按照1.2.1處理,每個濃度設(shè)6個平行孔,37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h。倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)并拍照,每孔加入10 μL MTT溶液(5 mg/mL),繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄上清,每孔加入150 μL DMSO,酶標儀檢測570 nm吸光度值(A),按下面公式計算細胞存活率(%):

細胞存活率(%)=A處理組/A空白組×100

1.2.3 LDH釋放的測定 INS-1細胞接種于96孔板中,細胞密度為5×104個/孔,37 ℃培養(yǎng)過夜。按照1.2.1處理,每個濃度設(shè)6個平行孔,37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h。細胞上清50 μL/孔,根據(jù)LDH檢測試劑盒說明書測定,分析各組間的細胞毒性作用。

1.2.4 胰島素分泌量的測定 INS-1細胞接種于96孔板中,細胞密度為5×104個/孔,37 ℃培養(yǎng)過夜。按照1.2.1處理,每個濃度設(shè)6個平行孔,37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h。吸棄上清,PBS漂洗2次,加入含3.3 mmol/L葡萄糖的KRB緩沖液,37 ℃預(yù)孵育30 min,棄上清,加入低糖(3.3 mmol/L)或高糖(16.7 mmol/L)葡萄糖的KBB緩沖液孵育1 h,吸取上清100 μL保存于-20 ℃待測。胰島素測定采用酶聯(lián)免疫吸附試驗法(ELISA),按照試劑盒說明書進行操作。

1.2.5 Caspase-3和Caspase-9活性的測定 INS-1細胞接種于6孔板中,細胞密度為1×106個/孔,37 ℃培養(yǎng)過夜。按照1.2.1處理,每個濃度設(shè)3個平行孔,37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h。收集細胞,按照試劑盒操作,檢測Caspase-3和Caspase-9活性。

1.2.6 細胞氧化應(yīng)激指標的測定 INS-1細胞接種于24孔板中,細胞密度為1×105個/孔,37 ℃培養(yǎng)過夜。按照1.2.1處理,每個濃度設(shè)3個平行孔,37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.2.6.1 NO含量的測定 收集細胞上清部分,1000 r/min 離心6 min,取上清各50 μL,按照試劑盒說明書操作檢測NO水平。

1.2.6.2 MDA、SOD及GSH含量的測定 細胞經(jīng)0.25%胰酶消化后,離心收集細胞沉淀,200 μL PBS重懸后超聲破碎,功率300 W,每5 s超聲一次,間隔10 s,BCA法測定細胞蛋白含量,據(jù)試劑盒說明書進行操作分別檢測每毫克蛋白中MDA、GSH的濃度及SOD活性。

1.2.6.3 細胞中ROS含量的測定 采用DCFH-DA熒光探針法檢測ROS[12],藥物處理24 h的細胞,棄上清,加入PBS漂洗1次;加終濃度為10 μmol/L DCFH-DA探針,繼續(xù)培養(yǎng)30 min。PBS漂洗3次,用細胞刮收集細胞,熒光酶標儀檢測,激發(fā)波長485 nm,發(fā)射波長538 nm,熒光強度反映細胞內(nèi)ROS水平。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用統(tǒng)計軟件SPSS 16.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析,實驗所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準誤(x±s)表示,各組之間進行單因素方差分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 四氧嘧啶對INS-1細胞增殖的影響

四氧嘧啶對INS-1細胞增殖的影響見表1,與空白組比較,10～15 mmol/L四氧嘧啶處理細胞存活率顯著降低(P<0.05),20～30 mmol/L四氧嘧啶處理組細胞存活率極顯著降低(P<0.01),表明四氧嘧啶能顯著抑制INS-1細胞增殖。由直線回歸分析計算四氧嘧啶IC50值為16.5 mmol/L。為了確保后續(xù)實驗造模成功,選擇濃度為18 mmol/L的四氧嘧啶損傷胰島細胞,建立體外糖尿病細胞模型。

表1 四氧嘧啶對INS-1細胞增殖的影響(x±s)Table 1 Effect of alloxan treatment in different concentrations on the cell viability of INS-1 cells(x±s)

注:與空白組比較,#P<0.05,##P<0.01。

2.2 虎杖苷對INS-1細胞增殖的影響

實驗結(jié)果如表2所示,虎杖苷濃度在5～100 μg/mL范圍內(nèi),對INS-1細胞增殖無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。其中25、50 μg/mL虎杖苷效果相對較好。200～400 μg/mL虎杖苷能極顯著抑制INS-1增殖(P<0.01)。選取25、50 μg/mL虎杖苷用于后續(xù)四氧嘧啶誘導(dǎo)損傷模型。

表2 虎杖苷對INS-1細胞增殖的影響(x±s)Table 2 Effect of polydatin treatment in different concentrations on the cell viability of INS-1 cells(x±s)

注:與空白組比較,##P<0.01。

2.3 虎杖苷對四氧嘧啶誘導(dǎo)損傷INS-1細胞存活率的影響

與空白組比較,模型組細胞存活率極顯著降低(P<0.01),說明四氧嘧啶體外損傷建模成功;與模型組比較,25 μg/mL虎杖苷組INS-1 細胞存活率極顯著升高(P<0.01);50 μg/mL虎杖苷組INS-1細胞增殖率顯著升高(P<0.05),其中虎杖苷劑量組間無顯著差異,結(jié)果見表3。后續(xù)我們進一步研究25、50 μg/mL虎杖苷對四氧嘧啶誘導(dǎo)的細胞損傷保護的作用。

表3 虎杖苷對四氧嘧啶誘導(dǎo)損傷 INS-1細胞增殖的影響(x±s)Table 3 Effects of polydatin treatment on the cell viability of alloxan-induced INS-1 cells(x±s)

注:與空白組比較,##P<0.01;與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01。

2.4 虎杖苷對四氧嘧啶誘導(dǎo)損傷INS-1細胞形態(tài)的影響

倒置顯微鏡觀察結(jié)果見圖1。由圖1可知,空白組INS-1細胞呈不規(guī)則、多角貼壁生長,排列緊密,邊界清楚。模型組細胞數(shù)目明顯減少,排列稀疏,多見細胞變圓。25、50 μg/mL虎杖苷保護組細胞數(shù)目較模型組增多,貼壁情況也有明顯好轉(zhuǎn),與上文中虎杖苷對四氧嘧啶誘導(dǎo)損傷INS-1細胞存活率的結(jié)果一致。

圖1 虎杖苷對四氧嘧啶誘導(dǎo)損傷 INS-1細胞形態(tài)的影響(100×)Fig.1 Effects of polydatin on morphological characteristics of alloxan-induced INS-1 cells(100×) 注:a.空白組;b.模型組;c.四氧嘧啶+25 μg/mL 虎杖苷;d. 四氧嘧啶+50 μg/mL虎杖苷。

2.5 虎杖苷對四氧嘧啶誘導(dǎo)損傷INS-1細胞LDH釋放的影響

LDH作為存在于機體所有組織細胞胞質(zhì)內(nèi)的酶,細胞損傷后膜通透性改變,LDH滲出細胞外,LDH增加可反映細胞膜的損傷,其外漏的程度也可間接反映細胞受損程度。

試劑盒檢測得知,空白組、模型組LDH釋放量分別為(106.4±11.6)和(199.5±9.7) U/L。與空白組比較,模型組細胞培養(yǎng)上清液中LDH釋放量極顯著升高(P<0.01)。25和50 μg/mL虎杖苷保護組LDH活性降低,統(tǒng)計學分析結(jié)果均具有顯著性差異(P<0.05)(表4),說明虎杖苷可以抑制四氧嘧啶對INS-1細胞的損傷。

表5 虎杖苷對四氧嘧啶誘導(dǎo)損傷INS-1細胞胰島素分泌的影響(x±s)Table 5 Effects of polydatin on alloxan-induced insulin secretion in INS-1 cells(x±s)

注:與空白組比較,#P<0.05,##P<0.01;與模型組比較,*P<0.05,**P<0.05。

表4 虎杖苷對四氧嘧啶誘導(dǎo)損傷 INS-1細胞LDH活性的影響(x±s)Table 4 Effects of polydatin on alloxan-induced LDH release in INS-1 cells(x±s)

注:與空白組比較,##P<0.01;與模型組比較,*P<0.05。

2.6 虎杖苷對四氧嘧啶誘導(dǎo)損傷INS-1細胞胰島素分泌量的影響

與空白組比較,模型組細胞低糖誘導(dǎo)胰島素分泌量極顯著降低(P<0.01),高糖誘導(dǎo)胰島素分泌量明顯減少(P<0.05),表明胰島細胞功能受損。與模型組比較,結(jié)果顯示低糖誘導(dǎo)和高糖誘導(dǎo),虎杖苷共處理后低糖誘導(dǎo)胰島素分泌量極顯著升高,高糖誘導(dǎo)胰島素分泌量增加也有統(tǒng)計學意義(P<0.05),其中50 μg/mL虎杖苷保護組胰島素分泌量最高,結(jié)果詳見表5。

2.7 虎杖苷對四氧嘧啶誘導(dǎo)損傷INS-1細胞Caspase-3、Caspase-9活性的影響

細胞發(fā)生凋亡時,活化的Caspase-9進一步激活效應(yīng)性Caspase蛋白(Caspase-3,Caspase-6,Caspase-7),其中Caspase-3是細胞凋亡的主要執(zhí)行者,最終細胞核破裂,核膜斷裂。通過檢測Caspase-3、Caspase-9活性能夠間接地的反映胰島細胞凋亡的狀態(tài)。

實驗結(jié)果顯示,與空白組Caspase-3(0.57±0.08)、Caspase-9(4.49±0.05)比較,模型組凋亡相關(guān)的Caspase-3(6.96±0.35),Caspase-9(12.02±0.02),活性極顯著升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與模型組比較,25和50 μg/mL虎杖苷可以極顯著降低Caspase-3和Caspase-9的活性(P<0.01),其中50 μg/mL虎杖苷抑制Caspase-3活性較好,結(jié)果詳見圖2。

2.8 虎杖苷對四氧嘧啶誘導(dǎo)損傷INS-1細胞氧化應(yīng)激及抗氧化指標的影響

氧化應(yīng)激是指細胞內(nèi)活性氧和活性氮自由基產(chǎn)生増加,引起細胞脂質(zhì)過氧化。ROS和NO可以反映細胞氧化應(yīng)激水平,MDA是機體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物。檢測上述指標能夠反映細胞受自由基攻擊的損傷程度。

如圖3所示,與空白組比較,18 mmol/L的四氧嘧啶處理INS-1細胞24 h后,細胞出現(xiàn)氧化損傷,表現(xiàn)為培養(yǎng)液中的NO 和細胞內(nèi)的ROS、MDA含量極顯著升高(P<0.01),而25和50 μg/mL虎杖苷對四氧嘧啶造成的氧化應(yīng)激有明顯抑制作用,氧化應(yīng)激指標NO、ROS和MDA含量均顯著降低(P<0.05)。

圖2 虎杖苷對四氧嘧啶誘導(dǎo)損傷INS-1細胞Caspase-3、Caspase-9活性的影響Fig.2 Effects of polydatin on alloxan-induced caspase-3 and caspase-9 activation in INS-1 cells 注:與空白組比較,##P<0.01;與模型組比較,**P<0.01。

圖3 虎杖苷對四氧嘧啶誘導(dǎo)損傷INS-1 細胞上清NO、胞內(nèi)ROS及MDA水平的影響Fig.3 Effects of polydatin on alloxan-induced NO, intracellular ROS and MDA levels in INS-1 cells 注:與空白組比較,##P<0.01; 與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01。

SOD能夠促進氧自由基的還原,并通過GSH-Px的催化,將氧自由基分解成水和氧氣,維持細胞內(nèi)氧化和抗氧化平衡,SOD活力的高低反映的是機體抗氧化應(yīng)激的能力。GSH是機體內(nèi)最重要的非酶性抗氧化物,具有清除自由基的重要生理功能,GSH的含量可以作為衡量細胞抗氧化水平的一個重要指標。檢測上述指標能夠反映細胞對于自由基的清除能力。

如圖4所示,與空白組比較,18 mmol/L的四氧嘧啶處理INS-1細胞24 h后,細胞抗氧化相關(guān)SOD活性和GSH含量極顯著降低(P<0.01)。而25和50 μg/mL虎杖苷能提高INS-1細胞抗氧化能力,SOD酶活力升高極顯著(P<0.01),GSH水平升高也有統(tǒng)計學差異(P<0.05),結(jié)果詳見圖4。

圖4 虎杖苷對四氧嘧啶誘導(dǎo)損傷INS-1 細胞SOD活力和GSH含量的影響Fig.4 Effects of polydatin on alloxan-induced SOD activities and GSH content in INS-1 cells 注:與空白組比較,##P<0.01; 與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01。

3 討論與結(jié)論

有研究表明,氧化應(yīng)激是2型糖尿病發(fā)生發(fā)展的重要原因,與機體其他組織細胞相比,胰島β細胞清除自由基的酶的含量及活性相對較低,最易受到自由基損傷[13]。氧化應(yīng)激會導(dǎo)致胰島β細胞功能損傷及外周胰島素抵抗,誘發(fā)糖尿病及多種并發(fā)癥的形成。糖尿病的抗氧化治療作為一種輔助療法,已經(jīng)應(yīng)用于臨床[14]。目前植物提取物的抗氧化活性的研究大多集中在中草藥、水果、蔬菜、谷物等,天然植物提取物具有作用溫和持久、無毒副作用等優(yōu)勢?；⒄溶帐菑膫鹘y(tǒng)中藥虎杖中提取的有效成分,現(xiàn)代藥理學研究表明,虎杖苷具有抗氧化作用[15];同時也具有良好的降血糖效果和改善糖尿病心肌肥厚、糖尿病腎病并發(fā)癥作用[16-17]。

本研究結(jié)果顯示,虎杖苷可顯著增加由四氧嘧啶損傷細胞存活率(P<0.05);降低細胞毒性LDH水平(P<0.05);改善細胞形態(tài);提高低糖和高糖誘導(dǎo)的胰島素分泌量(P<0.05)。通過檢測細胞內(nèi)Caspase-3、Caspase-9活性可知,虎杖苷極顯著抑制四氧嘧啶誘導(dǎo)的細胞凋亡(P<0.01)。25、50 μg/mL虎杖苷組NO和ROS水平極顯著下降(P<0.01),MDA含量顯著降低(P<0.05),說明了虎杖苷能夠顯著降低自由基引發(fā)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。此外,25、50 μg/mL虎杖苷與四氧嘧啶共處理后,INS-1細胞的SOD活性和GSH含量顯著升高(P<0.05),說明虎杖苷能夠顯著提高INS-1細胞的抗氧化能力。因此,推論虎杖苷可以有效緩解由四氧嘧啶引起的凋亡和氧化應(yīng)激從而對胰島β細胞損傷具有保護作用。綜上,虎杖苷可能通過增強胰島細胞清除自由基能力、降低氧化應(yīng)激損傷及抑制胰島β細胞凋亡保護四氧嘧啶損傷,具體分子機制仍需進一步研究。