蔡 爽， 韓 冰， 鄭 璐， 湯 雷， 陳雨絲， 楊 毅， 趙金有， 楊 婷， 楊 勤， 謝汝佳

(貴州醫(yī)科大學貴州省常見慢性疾病發(fā)病機制及藥物研究重點實驗室,基礎醫(yī)學院病理生理學教研室，貴州 貴陽 550025)

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是肝臟中最常見的原發(fā)性惡性腫瘤，被認為是世界上第5大常見腫瘤，也是腫瘤死亡的第3大原因。現(xiàn)今，HCC治療正朝著特定靶點的靶向治療方向發(fā)展[1]。索拉菲尼(sorafenib, SOR)是一種多靶點口服抗腫瘤藥物,于2007年被FDA批準用于治療晚期HCC。辛二酰苯胺異羥肟酸(suberoylanilide hydroxamic acid，SAHA)是一種廣譜組蛋白脫乙酰酶(histone deacetylases, HDACs)抑制劑，它以微摩爾濃度即可抑制HDAC1、HDAC2、HDAC3和HDAC6的活性并顯著提高核心組蛋白的乙?；?，從而誘導腫瘤細胞生長停滯、分化或凋亡[2]，目前主要用于臨床血液系統(tǒng)惡性腫瘤的治療。內(nèi)質網(wǎng)應激(endoplasmic reticulum stress, ERS)是近年來新發(fā)現(xiàn)的一條凋亡信號通路，區(qū)別于死亡受體和線粒體途徑介導的凋亡途徑，它通過自身信號傳導通路來誘導細胞發(fā)生凋亡。已有大量文獻報道，索拉菲尼與SAHA聯(lián)合應用時可顯著促進肝癌細胞的凋亡[3-5]，但其具體的分子機制是否與內(nèi)質網(wǎng)應激有關尚未見報道。CCAAT/增強子結合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein, CHOP)是一種多功能轉錄因子，在ERS誘導的多條凋亡信號通路中都充當了下游凋亡信號分子的角色，因此，CHOP被認為是ERS過程中一個重要的促凋亡蛋白。本研究主要探討CHOP在索拉菲尼聯(lián)合SAHA誘導人肝癌細胞MHCC97L凋亡中的作用，從而為索拉菲尼聯(lián)合SAHA治療肝癌提供新的理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 細胞

MHCC97L細胞來自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏中心上海細胞庫。細胞送上海翼和應用生物技術有限公司用Axygen的基因組抽提試劑盒提取DNA，采用21-STR擴增方案擴增，在ABI 3730XL型遺傳分析儀上對STR位點和性別基因AMELX進行檢測。本次檢測在該細胞系中未發(fā)現(xiàn)多等位基因、未與數(shù)據(jù)庫收錄的其它細胞相關STR信息發(fā)生匹配，未發(fā)現(xiàn)交叉污染，細胞系無異常。

2 實驗試劑

索拉菲尼由貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院肛腸外科詹瑋博士惠贈；SAHA(Abcam)；胎牛血清(ScienCell)；DMEM培養(yǎng)基(Gibco)；胰酶(Biological Industry)；彩虹 Marker(北京索萊寶科技有限公司)；DMSO(Sigma)；CCK-8(BBI Life Sciences)；細胞裂解液、蛋白酶抑制劑、BCA蛋白定量試劑盒、Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒和細胞周期試劑盒(江蘇凱基生物技術有限公司)；兔抗GAPDH、兔抗葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose-regulated protein 78，GRP78)、兔抗蛋白激酶R樣內(nèi)質網(wǎng)激酶(protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase，PERK)、兔抗活化轉錄因子4(activating transcription factor 4，ATF4)和兔抗CHOP(Abcam)；CHOP siRNA(上海吉瑪公司)；Lipofectamine 2000(Thermo)。

3 主要方法

3.1細胞鑒定及培養(yǎng) 首先通過短串聯(lián)重復DNA分析對MHCC97L細胞進行鑒定后進行后續(xù)實驗。MHCC97L細胞用含10%胎牛血清和1%雙抗(青霉素和鏈霉素)的DMEM培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，培養(yǎng)皿置于37 ℃、5% CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d換一次液；當細胞密度為80%～90%時，用含EDTA的胰酶消化細胞，以1 ∶2傳代，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

3.2CCK-8法檢測細胞活力 取對數(shù)生長期的MHCC97L細胞，以每孔1×104個細胞的密度接種于96孔板，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞貼壁后，加入不同濃度的索拉菲尼(0.5、1、3、6、12、25和50 μmol/L)、SAHA(0.5、1、3、6、12、25和50 μmol/L)及索拉菲尼聯(lián)合SAHA (劑量同前)處理細胞，同時設置陰性對照組和空白對照組，每個濃度均設5個復孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，每孔加入CCK-8工作液 10 μL，37 ℃ 孵育2 h后在酶聯(lián)免疫檢測儀450 nm處測定各孔的吸光度(A)值，計算各組細胞活力并繪制生長曲線。細胞活力(%)=(實驗組A值-空白組A值)/(對照組A值-空白組A值)×100%。

3.3流式細胞術檢測細胞周期 取對數(shù)生長期的MHCC97L細胞，隨機分為對照(control)組、索拉菲尼(12 μmol/L)組、SAHA(6 μmol/L)組以及索拉菲尼聯(lián)合SAHA組。給藥48 h后收集細胞，經(jīng)過75%乙醇4 ℃固定過夜，PBS洗滌后加入500 μL的PI/RNase A(9 ∶1)染色工作液，室溫避光30～60 min后用流式細胞儀進行檢測。

3.4流式細胞術檢測細胞凋亡 細胞分組同3.3，給藥48 h后，使用不含EDTA的胰酶消化各組細胞，用PBS洗滌細胞2次，2 000 r/min離心5 min后，加入500 μL的binding buffer懸浮細胞，每組細胞中加入5 μL Annexin V-FITC混勻后，再加入5 μL PI混勻，室溫避光反應15 min后用流式細胞儀進行檢測。

3.5Western blot法檢測GRP78、PERK、p-PERK、ATF4和CHOP蛋白水平的變化 收集對照組和藥物處理48 h后的實驗組細胞，PBS洗滌3次，加入適量蛋白裂解液提取細胞總蛋白，使用 BCA 蛋白定量試劑盒進行蛋白定量。取40 μg總蛋白上樣，10 % SDS-PAGE分離蛋白，電泳結束后濕轉蛋白至PVDF膜上，用5 %脫脂奶粉封閉90 min，用TBST洗膜3次后，加入相應Ⅰ抗4 ℃孵育過夜。第2天用TBST洗膜3次后加入Ⅱ抗，室溫孵育90 min，TBST洗膜3次，ECL發(fā)光成像，Bio-Rad 凝膠成像系統(tǒng)獲取圖像。用Image Lab圖像分析軟件對每個條帶進行定量分析。

3.6采用 CHOP siRNA沉默CHOP后，檢測索拉菲尼聯(lián)合SAHA對MHCC97L細胞凋亡的影響 取對數(shù)生長期的MHCC97L細胞，以每孔1×105個細胞密度接種于6孔板中。隨機將細胞分為3組：SAHA+SOR組、control siRNA+SAHA+SOR組和CHOP siRNA+SAHA+SOR組。當細胞密度達到30 %～50 %時，根據(jù) Lipofectamine 2000 說明書開始轉染。轉染48 h后，棄去含轉染試劑的培養(yǎng)基，改用含索拉菲尼(12 μmol/L)聯(lián)合SAHA(6 μmol/L)的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)細胞48 h。經(jīng)AnnexinV-FITC/PI雙染色后，采用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。所用CHOP siRNA序列見表1。

表1 人CHOP siRNA序列

4 統(tǒng)計學處理

以上實驗重復至少3次。實驗數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，使用GraphPad Prism 5統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 索拉菲尼聯(lián)合SAHA對MHCC97L細胞活力的影響

CCK-8法結果顯示,與對照組比較，不同濃度的索拉菲尼和SAHA均能明顯抑制肝癌細胞MHCC97L的活力，且呈明顯的劑量依賴性。與單獨的索拉菲尼和SAHA組比較，索拉菲尼聯(lián)合SAHA對肝癌細胞活力的抑制作用更為顯著 (P<0.05)，見圖1。根據(jù)CCK-8實驗結果，后續(xù)實驗中選擇12 μmol/L索拉菲尼、6 μmol/L SAHA以及12 μmol/L索拉菲尼聯(lián)合6 μmol/L SAHA處理細胞。

Figure 1. The changes of the viability of MHCC97L cells treated with SOR or/and SAHA. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μmol/L group;#P<0.05vsSOR group;&P<0.05vsSAHA group.

圖1 SOR、SAHA及兩藥聯(lián)合對MHCC97L細胞活力的影響

2 索拉菲尼聯(lián)合SAHA對MHCC97L細胞周期的影響

與對照組比較，12 μmol/L索拉菲尼、6 μmol/L SAHA 以及兩藥聯(lián)合組的細胞周期分布均發(fā)生了明顯的變化，細胞周期均被阻滯在 G1期，S期與G2/M期的細胞減少，其中以聯(lián)合用藥組變化最為顯著，見圖2、表2。

Figure 2. The effects of SOR, SAHA and their combination on the cycle distribution of MHCC97L cells anayzed by flow cytometry.

圖2 流式細胞術檢測SOR、SAHA及兩藥聯(lián)合對MHCC97L細胞周期分布的影響

表2 SOR、SAHA與聯(lián)合用藥對MHCC97L細胞周期分布的影響

Table 2. The effects of SOR, SAHA and their combination on the cell cycle distribution of MHCC97L cells (%. Mean±SD.n=3)

GroupG1SG2/MControl46.32±6.1232.86±5.2320.35±0.77 SOR70.49±2.82*24.89±0.344.91±2.80SAHA70.19±9.09*22.14±12.287.64±3.62SOR+SAHA74.01±2.63*20.53±4.671.25±0.20

*P<0.05vscontrol group.

3 索拉菲尼聯(lián)合SAHA對MHCC97L細胞凋亡的影響

經(jīng)流式細胞術檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，12 μmol/L索拉菲尼、6 μmol/L SAHA 以及兩藥聯(lián)合均能明顯誘導MHCC97L細胞發(fā)生凋亡(P<0.05)，凋亡率分別為(12.18±1.84)%、(13.18±1.08)%和(37.88±7.68)%，其中以聯(lián)合用藥組凋亡率最高，與索拉菲尼和SAHA單藥組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖3。

4 索拉菲尼聯(lián)合SAHA對MHCC97L細胞中GRP78、PERK、p-PERK、ATF4和CHOP蛋白水平的影響

與對照組比較，12 μmol/L索拉菲尼和6 μmol/L SAHA 可在一定程度上調(diào)GRP78、p-PERK、ATF4和CHOP蛋白的水平，兩藥聯(lián)合上述效應更加顯著(P<0.05)，見圖4。索拉菲尼、SAHA及兩藥聯(lián)合對PERK蛋白的水平無明顯影響。

5 CHOP siRNA轉染MHCC97L細胞后對CHOP表達的影響

采用CHOP siRNA-1、CHOP siRNA-2及CHOP siRNA-3分別轉染MHCC97L細胞后，Western blot檢測結果顯示， CHOP siRNA-3組的CHOP表達下降最顯著(P<0.05)，見圖5。故后續(xù)實驗選用CHOP siRNA-3進行轉染。

6 CHOP siRNA沉默CHOP基因后，索拉菲尼聯(lián)合SAHA對MHCC97L細胞凋亡的影響

經(jīng)流式細胞術檢測細胞凋亡發(fā)現(xiàn)，SOR+SAHA組、control siRNA+SOR+SAHA組和CHOP siRNA+SOR+SAHA組的凋亡率分別為(35.50±2.52)%、(36.10±6.15)%和(18.93±1.37)%，CHOP siRNA+SOR+SAHA組的凋亡率顯著下降(P<0.05)，見圖6。

討 論

內(nèi)質網(wǎng)廣泛存在于真核生物細胞中，主要進行蛋白質合成、折疊、聚集和轉運，也是細胞內(nèi)Ca2+的主要儲存場所。在一些病理性因素作用下，如缺血、缺氧、毒素刺激和氧化應激等都可導致內(nèi)質網(wǎng)應激的發(fā)生[6]。ERS早期可通過未折疊蛋白反應(unfolded protein response，UPR)緩解應激對細胞造成的損傷，對細胞發(fā)揮保護作用。目前認為ERS主要涉及3種內(nèi)質網(wǎng)跨膜效應蛋白：肌醇需求酶1(inositol-requiring enzyme 1，IRE1)、PERK和活化轉錄因子6(activating transcription factor 6，ATF6)。在正常情況下，這3種ERS受體蛋白均與內(nèi)質網(wǎng)伴侶GRP78結合而處于無活性狀態(tài)。當發(fā)生ERS時，由于內(nèi)質網(wǎng)腔中有大量未折疊蛋白或錯誤蛋白堆積，GRP78與IRE1、PERK和ATF6解離，轉而與未折疊蛋白或錯誤蛋白結合，并幫助這些蛋白質進行正確折疊[7]。此外，與GRP78解離后的PERK、IRE1和ATF6也可通過各自的途徑被激活，從而降低未折疊/錯誤折疊蛋白在內(nèi)質網(wǎng)腔的聚集，例如PERK與GRP78解離后可通過自身二聚化和磷酸化被激活，被激活的PERK進一步磷酸化其下游的真核翻譯起始因子2α(eukaryotic translation initiation factor 2α，eIF2α)的Ser51位點，從而抑制蛋白質的合成，減輕內(nèi)質網(wǎng)的負荷。雖然ERS狀態(tài)下細胞能夠啟動UPR來促進細胞的存活，但如果當ERS持續(xù)或嚴重得不到緩解時，內(nèi)質網(wǎng)無法恢復自身穩(wěn)態(tài)，則會通過ERS誘導的凋亡通路而觸發(fā)細胞凋亡[8]。因此，通過激活ERS凋亡通路促使腫瘤細胞發(fā)生凋亡，有望成為腫瘤治療的新方法、新靶點[6]。本研究發(fā)現(xiàn)，索拉菲尼聯(lián)合SAHA能顯著抑制MHCC97L細胞的活力，且細胞生長被阻滯在G1期；流式細胞術檢測結果表明兩藥聯(lián)合能顯著促進肝癌細胞凋亡，說明兩藥聯(lián)合在抑制肝癌細胞增殖的同時還促進了肝癌細胞凋亡，成為其抗癌的重要機制，上述結果與Park等[4]的研究結果一致。為進一步深入闡明兩藥聯(lián)合促進肝癌細胞凋亡的機制，本研究通過Western blot檢測發(fā)現(xiàn)索拉菲尼組、SAHA組和聯(lián)合用藥組的GRP78、p-PERK和ATF4的蛋白水平均較對照組顯著上調(diào)，且索拉菲尼聯(lián)合SAHA能進一步促進上述蛋白水平的增加，說明索拉菲尼、SAHA均可激活ERS信號通路，且兩藥聯(lián)合有一定的協(xié)同作用。

Figure 3. The effect of treatment with SOR or SAHA alone, or their combination for 48 h on the apoptosis of MHCC97L cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsSOR group;&P<0.05vsSAHA group.

圖3 SOR、SAHA及兩藥聯(lián)合對人肝癌MHCC97L細胞凋亡的影響

Figure 4. The protein levels of GRP78, PERK, p-PERK, ATF4 and CHOP in the MHCC97L cells exposed to SAHA or SOR alone, or their combination for 48 h. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsSOR group;&P<0.05vsSAHA group.

圖4 SOR、SAHA及兩藥聯(lián)合處理MHCC97L細胞48 h后GRP78、PERK、p-PERK、ATF4和CHOP的蛋白水平

Figure 5. The change of CHOP expression after transfection of CHOP siRNA detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖5 Western blot檢測轉染CHOP siRNA后CHOP表達的變化

Figure 6. The effects of sorafenib combined with SAHA on the apoptosis of MHCC97L cells afterCHOPexpression was knocked-down. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsSOR+SAHA group;#P<0.05vscontrol siRNA +SOR+SAHA.

圖6 CHOP沉默后，索拉菲尼聯(lián)合SAHA對MHCC97L細胞凋亡的影響

CHOP屬于C/EBP轉錄因子家族，是內(nèi)質網(wǎng)應激特異性的轉錄因子。在正常情況下，細胞質內(nèi)CHOP的表達較低；當發(fā)生ERS時，PERK介導其下游的eIF2α發(fā)生磷酸化，p-eIF2α進一步激活下游的ATF4及CHOP的表達[9-11]。本研究顯示，經(jīng)索拉菲尼、SAHA及兩藥聯(lián)合處理細胞后，MHCC97L細胞中CHOP的蛋白水平顯著升高。有研究發(fā)現(xiàn)CHOP在調(diào)控ERS引起的細胞凋亡中扮演重要角色，它能下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達[12-13]，而且還可以通過促進內(nèi)質網(wǎng)應激相關蛋白的合成和誘導氧化應激導致細胞凋亡[14]，故CHOP被認為是ERS過程中一個由抗凋亡走向促凋亡的關鍵信號分子。最近Lei等[15]的研究表明，在內(nèi)質網(wǎng)應激條件下，特異性敲除CHOP基因后，可顯著降低ERS誘導的細胞凋亡。為進一步明確CHOP在索拉菲尼聯(lián)合SAHA誘導肝癌細胞凋亡中的作用，我們采用CHOP siRNA敲減MHCC97L細胞中CHOP的表達，觀察CHOP表達下調(diào)對索拉菲尼聯(lián)合SAHA誘導的肝癌細胞凋亡的影響，結果發(fā)現(xiàn)，CHOP表達下調(diào)能顯著抑制索拉菲尼聯(lián)合SAHA誘導的肝癌細胞凋亡，這說明CHOP參與了索拉菲尼聯(lián)合SAHA誘導肝癌細胞發(fā)生凋亡的過程。

綜上所述，索拉菲尼聯(lián)合SAHA能夠通過激活內(nèi)質網(wǎng)應激凋亡通路促進肝癌細胞MHCC97L發(fā)生凋亡，且CHOP在此過程中發(fā)揮著關鍵性作用。