李 鵬， 李曉華， 蘇 秦 ， 白 靜， 郝 雷△

(1內蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院兒科， 內蒙古 呼和浩特 010050; 2內蒙古醫(yī)科大學病理生理學教研室， 內蒙古 呼和浩特 010059)

缺氧缺血性腦病(hypoxic ischemic encephalopathy，HIE)是引起新生兒腦功能障礙的重要因素，40%左右的HIE可以引起永久的腦損傷，甚至殘疾，例如驚厥、癲癇、腦癱及智力缺陷等。盡管目前人們對HIE有較全面的研究，但HIE仍然是引起新生兒高死亡率的重要原因。因此，進一步探討HIE的發(fā)病機制，探尋減少缺氧缺血引起的新生兒腦部損傷的可能方法具有重要的研究意義。

新生兒HIE的特點是細胞死亡、炎癥和氧化應激[1-2]。在氧化應激刺激下，常常出現(xiàn)線粒體的功能受損，并誘發(fā)神經(jīng)元凋亡的出現(xiàn)[3-4]。自噬是組織細胞的另一種死亡方式，大多數(shù)情況下具有一定的保護意義。那么在HIE時，是否會出現(xiàn)神經(jīng)元自噬現(xiàn)象以及其與神經(jīng)元線粒體功能變化的關系如何？基于以上，本研究探討了自噬對新生大鼠HIE模型中神經(jīng)元線粒體功能障礙誘導的影響，以期更深入地探討HIE的發(fā)生機制，從而為臨床上HIE的治療提供新的研究方向。

材 料 和 方 法

1 動物

10日齡SPF級SD大鼠共30只，體重15～20 g，雌雄各半，購自內蒙古醫(yī)科大學實驗動物中心[SCXK(蒙)2015-0001]，屏障環(huán)境標準條件飼養(yǎng)，分為假手術組(sham組，15只)及模型組(HIE組，15只)。

2 主要試劑

兔抗鼠caspase-3抗體、谷氨酰胺和成纖維細胞生長因子購自Sigma-Aldrich；兔抗鼠LC3B抗體和山羊抗兔 II 抗購自Abcam；SABC免疫組化試劑盒購自武漢博士徳生物公司；DMEM培養(yǎng)基和Neuroba-sal-A培養(yǎng)基購自Gibco;脂質體 2000、MitoSOXTMRed及5-(6)-氯甲基-2,7′-二氯二氫熒光素二乙酸酯購自Invitrogen；其它生化試劑均為進口分裝或國產(chǎn)分析純。

3 主要方法

3.1HIE模型復制 在30%O2/70% N2混合空氣中加入2%異氟烷作為麻醉劑，吸入麻醉。切開頸部皮膚，HIE組大鼠使用6-0手術絲線結扎左側頸總動脈，縫合切口， 將幼鼠置于37 ℃恒溫箱中45 min后，進入低氧室(8% O2/92% N2)內2 h(氧流量2 L/min)，之后送回母鼠籠飼養(yǎng)24 h，之后處死取材。sham組幼鼠僅麻醉后暴露一側頸動脈，但不結扎,除未進入低氧室外，其余飼養(yǎng)條件及操作同HIE組。

3.2HE染色及免疫組織化學檢測活化型caspase-3及LC3B-II 實驗終點時，各組幼鼠麻醉下用4%甲醛溶液心臟灌注，開顱取出腦組織、沿矢狀線切開，取一部分腦組織(其余部分待用)，4%多聚甲醛固定后進行常規(guī)HE染色。根據(jù)以下程序進行免疫組織化學染色： 在85 ℃ PBS(pH 6.0)的中洗滌10 min修復幼鼠腦組織中的抗原，滴加活化型caspase-3的兔抗鼠I抗(1 ∶300)及LC3B-II兔抗鼠 I 抗(1 ∶200)，37 ℃孵育1 h。然后加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔II抗，4 ℃、孵育1 h，DAB顯色，蘇木素復染。每次孵育前均用加入Tween-20的PBS(PBST)緩沖液洗滌3次。

3.3神經(jīng)元的體外培養(yǎng) 用眼科剪將另一部分腦皮質組織剪成薄片，置于DMEM培養(yǎng)基中，并加入0.125%胰蛋白酶和10 mg/L DNA酶，37 ℃孵育15 min制備單細胞懸液。將細胞重懸并用加入2% B-27的DMEM洗滌，800×g離心5 min。然后將細胞培養(yǎng)在含有2% B-27的DMEM、0.5 mmol/L谷氨酰胺、1.0×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的Neurobasal-A培養(yǎng)基中，濃度為3×108/L，并由聚L-賴氨酸覆蓋。培養(yǎng)基在第24小時更新，然后在傳代中更新4次，并在培養(yǎng)基中加入成纖維細胞生長因子(5 μg/L)，原代神經(jīng)元傳代6～7代后備用。將傳代后取得的神經(jīng)元置于含有5% CO2和2% O2的缺氧培養(yǎng)箱中孵育，連續(xù)監(jiān)測和調節(jié)。

3.4GFP-LC3定量分析 將攜帶GFP-LC3 reporter質粒的脂質體2000轉染至上述經(jīng)處理的神經(jīng)細胞，24 h后觀察細胞的GFP陽性的囊泡，在熒光顯微鏡下計數(shù)自噬囊泡，每個樣品至少計數(shù)100個細胞，并以每個細胞中5個GFP-LC3點狀聚集物作為陽性對照，使用Fluoview 5.0軟件分析。

3.5Western blot檢測蛋白水平 將上述處理的神經(jīng)元細胞中加入200 μmol/L H2O2混合6 h，再滴入冰凍細胞裂解劑，然后補充蛋白酶抑制劑。BCA測定每個樣品的蛋白濃度，8%～12% SDS-PAGE凝膠分離，然后將分離的蛋白轉移至PVDF膜，分別加入兔抗鼠LC3B-I、LC3B-II和GAPDH多克隆抗體(I 抗)，以及辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG(II 抗)孵育。ECL顯影成像系統(tǒng)檢測每種靶蛋白與其抗體的特異性結合，計算各條帶積分吸光度與GAPDH的百分比。

3.6細胞內活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)和線粒體超氧化物的測定 用ROS敏感熒光基團5-(6)-氯甲基-2,7′-二氯二氫熒光素二乙酸酯的氧化來定量檢測細胞內活性氧簇。在6孔板中的融合神經(jīng)元細胞(每孔5×105)上加入5 μmol/L探針，再加入5-(6)-氯甲基-2,7′-二氯二氫熒光素二乙酸酯，37 ℃、5% CO2在Hanks平衡鹽溶液(Hanks′ balanced salt solution, HBSS)中孵育30 min。去除探針后用HBSS沖洗細胞，使用具有488 nm的激發(fā)源和530 nm發(fā)射波長的光譜儀測定2,7′-二氯熒光素(2,7′-dichlorofluorescein, DCF)熒光。線粒體超氧化物水平應用MitoSOXTMRed檢測。將各種處理后的細胞與5 μmol/L MitoSOXTMRed在37 ℃下孵育20 min，洗滌細胞，檢測MitoSOXTMRed熒光。

3.7線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，MMP)的測定 使用TMRE-線粒體膜電位測定試劑盒。TMRE是一種紅橙色帶正電荷的細胞滲透性染料，容易積聚在帶負電荷的活性線粒體膜內。去極化或無活性的線粒體膜電位降低，不能螯合TMRE。上述處理后的1×105個神經(jīng)元細胞在37 ℃、5%CO2下用MMP敏感性熒光染料TMRE溫育20 min(在TMRE之前10 min向陽性對照細胞加入1 μmol/L FCCP)。孵育后，加入胰蛋白酶，離心，在0.4 mL含0.2%BSA的DPBS中進行細胞微粒重懸，通過流式細胞術分析TMRE熒光，其中TMRE的激發(fā)/發(fā)射熒光波長為為549 nm/575 nm。

4 統(tǒng)計學處理

用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，計量資料組間比較采用Student’st檢驗，計數(shù)資料采用卡方檢驗。以P<0.05 為有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 病理變化及及免疫組織化學檢測自噬/凋亡相關生物標志物

HE染色結果表明，與假手術組大鼠相比，經(jīng)歷缺氧缺血的大鼠腦組織病理表現(xiàn)為腦組織萎縮、腦室擴大，見圖1。

Figure 1. Pathological changes of rat brain tissues in sham and model group (HE staining，×200).

圖1 HIE組和sham組大鼠腦組織的病理變化

免疫組織化學檢測顯示，在HIE組大鼠腦組織中活化型caspase-3染色陽性比sham組明顯增多；此外，在自噬體形成中起重要作用的LC3B-II，HIE組大鼠腦組織中染色比sham組也明顯加深，見圖2。HIE組的活化型caspase-3和LC3B-II的表達率均顯著高于sham組(P<0.01)，見表1。

Figure 2. Immunohistochemical staining for cleaved caspase-3 (A) and LC3B-II (B) in sham and model groups.

圖2 HIE組和sham組大鼠活化型caspase-3和LC3B-II免疫組織化學染色結果

表1 HIE組和sham組大鼠活化型caspase-3和LC3B-II免疫組織化學染色結果及GFP陽性酸性囊泡細胞器計數(shù)的比較

Table 1. Immunohistochemical staining for cleaved caspase-3 and LC3B-II and counting of the GFP-positive acidic vesicular organelles (AVOs) in sham and model groups (%. Mean±SD.n=15)

GroupCleaved caspase-3LC3B-IIAVOssham23.70±3.7214.44±2.521.9±1.2HIE75.25±4.44** 54.53±3.23**7.7±1.5**

**P<0.01vssham group.

2 定量GFP-LC3分析

體外實驗中，在熒光顯微鏡下通過GFP-LC3觀察細胞自噬特異性酸性囊泡細胞器(acidic vesicular organelles，AVOs)的變化，結果顯示，與在常氧條件下的神經(jīng)元相比，缺氧時神經(jīng)元中存在GFP陽性AVOs明顯增多(P<0.01)，見圖3和表1。

3 Western blot分析結果

Western blot結果顯示,缺氧時神經(jīng)元中LC3B-I向LC3B-II的轉化率更高，見圖4。

4 線粒體功能的測定

熒光顯微鏡下，sham組可觀察到少量DCF陽性(綠色熒光)神經(jīng)元，然而，HIE組出現(xiàn)較多的DCF陽性神經(jīng)元，相對DCF熒光強度兩組相比差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見圖5和表2。對活細胞滲透劑及線粒體定位因子MitoSOXTMRed的檢測結果顯示，與sham組相比，HIE組大鼠神經(jīng)元中線粒體超氧化物水平明顯上調(P<0.01);MMP檢測結果顯示，HIE組神經(jīng)元的MMP顯著降低(P<0.01)，見表2。

Figure 3. Autopahgy induction in the rat neurons under normoxia and hypoxia (×400).

圖3 常氧和缺氧下大鼠神經(jīng)元自噬的觀察

Figure 4. The relative expression of LC3B-II/LC3B-I in the rat neurons of normoxia and hypoxia groups. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsnomoxia group.

圖4 Western blot檢測常氧和缺氧下LC3-A 向LC3B-II 的轉化

討 論

新生兒缺血缺氧性腦病是導致新生兒大腦損傷的重要因素，其主要機制是大量氧化因子增加導致的神經(jīng)功能損傷。因此如何抑制氧化因子的作用成為保護缺血缺氧性腦病的關鍵。HIE可干擾未成熟大腦發(fā)育過程中的多種信號傳導途徑。新生兒大腦對各種有害因素更敏感，更容易激活細胞凋亡級聯(lián)反應[5]，因此，細胞凋亡在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)展中是常見的。在氧化應激刺激下，功能受損的線粒體引起細胞色素C的釋放，易導致發(fā)育中的腦內前凋亡蛋白含量升高，如caspase-9及caspase-3[6]。

Figure 5. DCF staining for mitochondrial reactive oxygen species (ROS) in the neurons of normoxia and hypoxia groups (×400).

圖5 通過DCFH-DA檢測常氧和缺氧下線粒體內ROS的生成

表2 HIE組和正常大鼠神經(jīng)元中線粒體相對DCF熒光強度、超氧化物水平及MMP測定

Table 2. Quantification of DCF-positive neurons, mitochondrial superoxide and mitochondrial membrane potential (MMP) in the rat neurons of each group (Mean±SD.n=15)

GroupRelative DCF Superoxide (%)MMP (%)Sham1.00100.00100.00HIE1.98±0.21** 200.60±5.56**69.47±3.62 **

**P<0.01vssham group

自噬是一種針對出現(xiàn)不利條件時(如生長因子減少、營養(yǎng)缺乏、缺氧和其他損傷性刺激)細胞的自我保護方式[7-8]。在腦創(chuàng)傷，退行性腦病如阿爾茨海默病中以及在腦組織缺氧/缺血或在氧化應激損傷時自噬常常被激活[9-10]。新生兒大腦通常比成人大腦更脆弱。與成年大腦相比，新生兒腦中有不同形式的細胞死亡[6]。在本研究中，我們探討了缺氧缺血導致的大鼠腦細胞凋亡以及自噬現(xiàn)象。新生大鼠腦中觀察到大量活化型caspase-3和在自噬體形成中起重要作用的LC3B-II蛋白表達，這意味著缺氧缺血可誘導大鼠腦細胞凋亡和自噬。體外實驗結果證實上述結論。

線粒體功能障礙是神經(jīng)退行性疾病中主要的由缺氧誘導的異常變化[11-12]。本實驗中，缺氧缺血引起了大鼠神經(jīng)元中線粒體功能障礙，相比于假手術組，缺氧組大鼠神經(jīng)元內ROS增多，線粒體超氧化物上調以及線粒體膜電位水平下降。

腦缺氧缺血過程經(jīng)常發(fā)生氧化應激反應，觸發(fā)氧和氮激活，神經(jīng)元中產(chǎn)生大量自由基和其他細胞毒性因子的釋放。線粒體是細胞的能量發(fā)源地，產(chǎn)生ATP、調節(jié)細胞內Ca2+水平和ROS產(chǎn)生。線粒體氧化應激下出現(xiàn)ROS爆發(fā)，導致線粒體功能障礙，并最終誘導神經(jīng)元凋亡。 ROS還可啟動各種類型的細胞的自噬過程，包括在神經(jīng)元中[13]。我們的研究表明缺氧誘導的大鼠神經(jīng)元線粒體功能障礙和凋亡與自噬現(xiàn)象同時出現(xiàn)，因此，推測大鼠神經(jīng)元的自噬及凋亡參與了誘導HIE過程中線粒體功能的障礙。