連 輝， 周 立， 張毅敏， 宋海巖， 王志勇△

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院 1人體解剖學(xué)教研室, 2人體解剖學(xué)實(shí)驗(yàn)室, 3新鄉(xiāng)市分子神經(jīng)病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 河南 新鄉(xiāng) 453003)

體重減輕是帕金森(Parkinson disease，PD)患者常見的非運(yùn)動癥狀之一[1]，它嚴(yán)重影響PD患者的生活質(zhì)量，并增加患者的死亡率[2]。研究表明，脂肪含量的減少和重新分布是PD病人體重下降的重要因素[3-4]。腹膜后白色脂肪組織(retroperitoneal white adipose tissue，rWAT)是體內(nèi)白色脂肪組織的一種，主要功能是把多余的能量以甘油三酯的形式儲存起來，以供機(jī)體在需要的時候使用[5]。脂肪分解和合成是2個作用相反的過程，兩者之間的動態(tài)平衡是體內(nèi)脂肪含量穩(wěn)定的重要因素。作為脂肪合成和分解過程中的關(guān)鍵酶，脂肪酸合成酶(fatty acid synthase，F(xiàn)AS)和磷酸化激素敏感性脂肪酶(phosphory-lated hormone-sensitive lipase，p-HSL)的變化可能會影響體內(nèi)脂肪含量，從而引起體重改變。本實(shí)驗(yàn)利用6-羥基多巴胺(6-hydroxydopamine，6-OHDA)損傷大鼠雙側(cè)黑質(zhì)(substantia nigra，SN)建立PD模型，并對模型大鼠的體重、rWAT重量/大鼠體重比、rWAT中脂肪細(xì)胞直徑以及FAS和p-HSL蛋白水平變化進(jìn)行檢測，期望為PD患者體重減輕的發(fā)生機(jī)制提供依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 動物及分組

本研究共使用健康雄性SD大鼠23只大鼠，體重210～240 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供，編號為11400700256933。將大鼠隨機(jī)分為對照組10只，全部成活，納入統(tǒng)計(jì)的n=10；PD模型組13只，其中1只死亡，2只根據(jù)病理學(xué)和行為學(xué)檢驗(yàn)?zāi)Ｐ椭苽洳怀晒?，沒有納入統(tǒng)計(jì)，最終納入統(tǒng)計(jì)的n=10只。所有手術(shù)均在10%水合氯醛(ip, 0.4 g/kg)麻醉下進(jìn)行。所有動物在12 h∶12 h光循環(huán)中自由飲食飲水，環(huán)境溫度保持在26 ℃左右。

2 主要方法

2.1PD模型大鼠的制備 將麻醉好的大鼠固定在腦立體定位儀上，頭頂備皮，暴露顱骨并雙側(cè)打孔(前囟尾側(cè)5.6 mm, 矢狀縫兩側(cè)2.0 mm)，每側(cè)SN所在的區(qū)域(硬膜下7.5 mm)用10 μL的Hamilton微量注射器注射2 μL 6-OHDA(2 g/L溶解在含0.05%的抗壞血酸的0.9%生理鹽水中)，對照組SN內(nèi)注射同體積含0.05%抗壞血酸的生理鹽水)。所有大鼠在手術(shù)后每日測量進(jìn)食量，手術(shù)后6周稱體重，并進(jìn)行轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)。

2.2組織切片 6周后，對照組和PD模型組的大鼠各5只，麻醉后開胸暴露心臟，經(jīng)左心室灌注固定取材，收集腦和rWAT，4%多聚甲醛后固定24 h，腦在蔗糖梯度溶液中脫水。根據(jù)大鼠腦圖譜粗略確定SN的位置，并用冰凍切片機(jī)(Leica CM1850)20 μm連續(xù)冰凍冠狀切片，放入-80 ℃的冰箱保存。rWAT進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋，用石蠟切片機(jī)(Leica RM2235)將石蠟塊切成5 μm厚的切片。

2.3rWAT的HE染色 rWAT的石蠟切片依次置入二甲苯1和2中浸泡10 min，以脫掉組織中的蠟，切片在100%乙醇I、Ⅱ中分別浸泡5 min，95%、90%、80%和70%乙醇中分別浸泡2 min，PBS漂洗3次，每次3 min,置蒸餾水中漂洗1 min，蘇木素復(fù)染1 min，0.5%的鹽酸酒精分化30 s，自來水返藍(lán)15 min， 蒸餾水漂洗2次每次30 s，然后用5%的伊紅染液染5 min，梯度酒精脫水至二甲苯，中性樹膠封固，光學(xué)顯微鏡下觀察rWAT形態(tài)。

2.4SN的免疫組織化學(xué)染色 切片復(fù)溫30 min后，用微波輻射法抗原修復(fù)3次每次5 min，自然冷卻至室溫，用3%的H2O2孵育3 min，5%的山羊血清封閉30 min后，滴加小鼠抗酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase，TH)單克隆抗體(1∶5 000，Sigma，T1299)，4 ℃冰箱過夜，滴加HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠的IgG(1∶500，ZSGB-BIO，A0216)，室溫孵育30 min，DAB染色1 min，蘇木精染色細(xì)胞核，依次脫水、透明、封片，光學(xué)顯微鏡下觀察SN中的TH。

2.5Western blot檢測 其余大鼠在麻醉好后，開腹取出兩側(cè)的rWAT并稱重，然后斷頭快速取出大鼠SN區(qū)域的腦組織。常規(guī)提取組織中的蛋白質(zhì)，考馬斯亮藍(lán)法檢測蛋白濃度。取2組大鼠rWAT和SN的蛋白質(zhì)樣品各30 μg進(jìn)行10% SDS-PAGE，電轉(zhuǎn)移至NC膜，裁剪目的條帶。用5%脫脂奶粉封閉2 h，小鼠抗TH單克隆抗體(1∶5 000，Sigma，T1299)加至SN的目的條帶，兔抗FAS多克隆抗體(1∶1 000，Abcam，ab22759)、兔抗HSL多克隆抗體(1∶1 000，Abcam，ab45422)和兔抗p-HSL多克隆抗體(1∶1 000，CST，4126)加至rWAT的目的條帶，4 ℃孵育過夜，HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠的IgG(1∶500，ZSGB-BIO，A0216)加至SN的目的條帶，HRP標(biāo)記的山羊抗兔的IgG(1∶500，ZSGB-BIO，A0239)分別加至rWAT相應(yīng)的目的條帶，室溫孵育1 h，ECL顯色。用Fluorchem 2.0系統(tǒng)進(jìn)行光密度測定，以目的條帶與內(nèi)參照GAPDH的平均吸光度比值表示相對蛋白水平，進(jìn)行分析。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad Prism軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 PD大鼠模型的鑒定

TH是兒茶酚胺合成過程中的限速酶，是確定兒茶酚胺能神經(jīng)元的標(biāo)志。SN內(nèi)TH陽性的神經(jīng)元大部分是多巴胺(dopamine，DA)能的，因此SN中TH的蛋白表達(dá)水平可以反映SN中DA的表達(dá)水平。6周后，與對照組比較，PD模型組大鼠SN中TH陽性神經(jīng)元明顯減少，見圖1A；TH的蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.01)，見圖1B。PD模型組大鼠在轉(zhuǎn)棒上停留的時間明顯縮短(P<0.01)，見圖2。說明PD模型組大鼠的運(yùn)動協(xié)調(diào)能力降低。以上結(jié)果說明PD模型制備成功。

Figure 1. The protein expression of TH in SN of rats in control group and PD group was detected by immunohistochemical staining (A) and Western blot (B). The scale bar=50 μm. Mean±SD.n=5.**P<0.01vscontrol group.

圖1 2組大鼠SN內(nèi)TH的免疫組織化學(xué)染色和蛋白表達(dá)結(jié)果

Figure 2. Comparison of the time of the rats staying on rotating rod between control group and PD group. Mean±SD.n=10.**P<0.01vscontrol group.

圖2 2組大鼠在轉(zhuǎn)棒上停留的時間比較

2 大鼠進(jìn)食量、體重、rWAT重量/體重和脂肪細(xì)胞直徑的變化

對大鼠每日進(jìn)食量和手術(shù)后6周時體重的測量發(fā)現(xiàn)，二者差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性; 但是PD模型組大鼠rWAT重量/體重的比值明顯降低(P<0.05)，見圖3。HE染色發(fā)現(xiàn)，rWAT脂肪細(xì)胞的細(xì)胞核位于細(xì)胞邊緣，細(xì)胞膜的邊界清晰，用ImageJ軟件測量細(xì)胞直徑，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞直徑明顯變小(P<0.01)，見圖4。

Figure 3. Measurement results of food intake, body weight and rWAT weight/body weight in control group and PD group. Mean±SD.n=10.*P<0.05vscontrol group.

圖3 2組大鼠進(jìn)食量、體重和rWAT重量/體重的比值

3 rWAT中FAS、HSL和p-HSL蛋白水平的變化

Western blot的檢測結(jié)果顯示，PD模型組大鼠的rWAT中FAS蛋白的表達(dá)水平明顯降低(P<0.01)，p-HSL的蛋白水平明顯升高(P<0.05)，HSL的蛋白表達(dá)水平無明顯變化，p-HSL/HSL明顯升高(P<0.05)，見圖5。這提示SN多巴胺參與rWAT的合成與分解，破壞SN能引起rWAT的合成減少和分解增加。

Figure 4. Measurement results of adipocyte diameter in the rWAT between control group and PD group. The scale ber=50 μm. Mean±SD.n=5.**P<0.01vscontrol group.

圖4 2組大鼠rWAT脂肪細(xì)胞直徑的測量結(jié)果

Figure 5. The protein levels of FAS, HSL, and p-HSL in the rWAT between the 2 group determined by Western blot. Mean±SD.n=5.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖5 Western blot檢測2組大鼠rWAT FAS、HSL和p-HSL蛋白水平

討 論

PD是一種以SN中DA能神經(jīng)元的退行性變?yōu)樘卣鞯纳窠?jīng)退行性疾病[6]。6-OHDA是可以選擇性作用于兒茶酚胺能神經(jīng)元的神經(jīng)毒素，在腦內(nèi)可由DA能神經(jīng)元末梢的多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體攝取，通過氧化應(yīng)激等機(jī)制逆行性損毀DA能神經(jīng)元[7]。SN中注射6-OHDA制備的PD模型是目前常用的PD模型之一[8-9]。

本實(shí)驗(yàn)用6-OHDA注入雙側(cè)SN制作PD大鼠模型，發(fā)現(xiàn)大鼠的進(jìn)食量未發(fā)生明顯改變，rWAT重量/體重的比值降低，說明rWAT的重量/體重的比值降低與大鼠的進(jìn)食量之間沒有明顯聯(lián)系。實(shí)驗(yàn)中，與對照組比較，PD模型大鼠的體重未發(fā)生明顯改變，這與預(yù)期的結(jié)果并不相符。推測本實(shí)驗(yàn)中PD模型大鼠的體重未發(fā)生改變的原因可能有三：第一，人與大鼠之間的種屬差異；第二，實(shí)驗(yàn)大鼠飼養(yǎng)的時間短(6周)，PD相關(guān)的體重減輕癥狀可能還未出現(xiàn)；第三，并不是所有的PD患者都伴隨體重減輕的癥狀。然而，本研究與以前的一些實(shí)驗(yàn)結(jié)果是一致的。Zheng等[10]把6-OHDA注射入雙側(cè)的SN，實(shí)驗(yàn)期間大鼠的體重和進(jìn)食量均未發(fā)生明顯變化。Meng等[11]用6-OHDA損傷投射到SN纖維組成的內(nèi)側(cè)前腦束制備的PD模型，也沒有觀察到體重或食物攝入的顯著變化。但是體重減輕在PD患者中很常見，并且在PD癥狀增加和認(rèn)知功能下降的患者中最明顯[12]，這可能是SN中DA能神經(jīng)元變性更嚴(yán)重的表現(xiàn)。

HSL是脂肪分解的限速酶，在脂肪的動員中起決定性作用。其活化形式為磷酸化形式，可以在腎上腺素和胰高血糖素等激素的作用下發(fā)生磷酸化，也稱為p-HSL，可直接作用于脂肪，使甘油三酯分解為甘油二酯。因此，脂肪組織中p-HSL蛋白水平的變化比HSL更能直接反映其分解狀態(tài)。由于FAS和p-HSL在脂肪形成過程中所起的作用正好相反，F(xiàn)AS和p-HSL同時減少或同時升高可能并不會影響甘油三酯在脂肪組織中的沉積。因此本實(shí)驗(yàn)同時檢測了FAS和p-HSL在PD模型大鼠rWAT中的蛋白水平，發(fā)現(xiàn)FAS的蛋白水平減少，p-HSL的蛋白水平增多，表明rWAT中同時存在脂肪的合成減少和分解增加，這與脂肪細(xì)胞的直徑減小和rWAT重量/體重降低的結(jié)果是一致的，說明rWAT可能對PD病人體重減輕的發(fā)生起著重要作用。

脂肪的代謝受交感神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)控。交感神經(jīng)中的兒茶酚胺，如腎上腺素和去甲腎上腺素與脂肪細(xì)胞表面的β-腎上腺素能受體結(jié)合，并通過細(xì)胞內(nèi)的級聯(lián)反應(yīng)使脂肪發(fā)生水解[13]。神經(jīng)示蹤的研究表明，下丘腦室旁核(paraventricular nucleus，PVN)和下丘腦外側(cè)區(qū)(lateral area of hypothalamus，LH)可以支配rWAT，并參與交感神經(jīng)對脂肪代謝的調(diào)控[14]。PD患者可見PVN中催產(chǎn)素能神經(jīng)元和LH的食欲素A能神經(jīng)存在明顯減少[15-16]，說明PVN和LH可能是PD患者調(diào)節(jié)脂肪代謝的2個關(guān)鍵區(qū)域。我們以前神經(jīng)示蹤的實(shí)驗(yàn)研究表明，SN與PVN和LH之間有直接的纖維聯(lián)系[17]，因此我們推測，SN可能通過PVN或LH間接影響交感神經(jīng)的功能，從而使脂肪代謝發(fā)生改變，這可能也是本實(shí)驗(yàn)中脂肪的合成和分解狀態(tài)發(fā)生改變的原因，其具體機(jī)制尚需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)雙側(cè)黑質(zhì)破壞后的PD模型大鼠rWAT的FAS表達(dá)減少伴p-HSL的表達(dá)增加，且rWAT與大鼠體重比值顯著降低。這些結(jié)果提示SN的DA參與調(diào)控大鼠rWAT的合成與分解。SN破壞引起的rWAT代謝改變可能與PD病人體重下降具有一定的相關(guān)性。