楊宇虹 李 娜

1（永州職業(yè)技術學院醫(yī)學院公共基礎學部 永州425100）

2（湖南醫(yī)藥學院第一附屬醫(yī)院病理科 懷化418000）

3（湖南醫(yī)藥學院侗醫(yī)藥研究湖南省重點實驗室 懷化418000）

肺癌是當前全世界范圍內發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，且其發(fā)病率仍呈逐年上升趨勢，嚴重危害人們的身心健康［1］。肺癌的早期癥狀不明顯，因此，臨床上大部分患者在確診時往往已是中晚期，放化療成為治療的主要手段［2-3］。放療是利用各種不同能量的射線照射腫瘤，以抑制和殺滅癌細胞的一種治療方法，是腫瘤綜合治療的重要組成部分，可以明顯提高癌癥的治愈率［4］，但往往會產生組織損傷、骨髓抑制等毒副反應，并且有較高的復發(fā)率。因此，探討電離輻射的毒理機制具有重要的臨床意義。腫瘤的生長、轉移和復發(fā)與其所處的微環(huán)境密切相關，而腫瘤相關成纖維細胞（Tumor-associated fibroblasts，TAF）是腫瘤微環(huán)境的主要成員，在大多數腫瘤類型的基質組織中分布較多，是腫瘤進展和轉移的關鍵因素［5-6］。放射治療對腫瘤微環(huán)境的毒副作用目前研究較少，放療后患者體內腫瘤浸潤性成纖維細胞的改變尚不明確。鑒于放療在腫瘤治療中的廣泛應用以及TAF 在癌癥發(fā)生發(fā)展中的重要作用，本研究探討放療對TAF 基因表達的影響，通過對Gene Expression Omnibus（GEO）數據庫中電離輻射輻照肺癌患者體內分離的腫瘤浸潤性成纖維細胞的芯片數據進行深度分析，鑒定輻照前后腫瘤浸潤性成纖維細胞中的差異表達基因及關鍵信號通路，以期為肺癌放射治療提供新的依據。

1 材料與方法

1.1 獲取芯片數據

從GEO 數據庫中下載輻射處理腫瘤浸潤性成纖維細胞基因表達數據集GSE37318用于篩選差異表達基因，該組芯片采用GPL10191 平臺，包含8組細胞。從非小細胞肺癌患者體內分離腫瘤浸潤性成纖維細胞，進行18 Gy的單劑量輻照，24 h后提取細胞總RNA進行全基因轉錄組分析。

1.2 鑒定差異表達基因

利用GEO數據庫自帶軟件包GEO2R對芯片數據GSE37318 進行處理，以默認的Benjamini-Hochberg 方法進行統(tǒng)計學分析，以|log2FC|＞1 且adj.p＜0.05 作為篩選標準（FC 為基因表達差異倍數，adj.p為校正后的p值）；利用R 軟件中的ggplot2包繪制火山圖。

1.3 GO分析和KEGG途徑分析

將篩選到的差異表達基因導入DAVID［7］在線工具包進行重注釋，并對差異表達基因進行GO和KEGG途徑富集分析。

1.4 構建蛋白質相互作用網絡

利用STRING 數據庫［8］分析差異表達基因的相互作用，利用Cytoscape 3.5.0軟件構建蛋白質相互作用網絡，并通過插件MCODE篩選和獲取核心子模塊網絡，利用cytoHubba 插件篩選核心基因，以p＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

1.5 預后價值分析

利用GEPIA［9］在線工具對篩選到的核心基因在肺癌中的預后價值進行LogRank 檢驗，計算預后相關的風險比（Hazard ratio，HR），以p＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 輻照后腫瘤浸潤性成纖維細胞中的差異表達基因

以|log2FC|＞1 且adj.p＜0.05 作為篩選標準，獲得輻照后腫瘤浸潤性成纖維細胞表達增加的基因144個（圖1），其表達值前10位的基因為CYFIP2、VWCE、NRG1、CES3、TAF7L、BLNK、KCNN4、FDXR、PIDD1和CLCA2。獲得表達降低的基因54個（圖1），其表達值前10 位的基因為MKI67、DLGAP5、KIFC1、GTSE1、HJURP、CENPA、KNL1、DTL、FAM111B和MCM10。

圖1 198個差異表達基因的火山圖（彩色見網絡版）Fig.1 Volcano plot of 198 differentially expressed genes(color online)

2.2 GO和KEGG途徑富集分析

將篩選到的差異表達基因導入DAVID 數據庫中進行重注釋，并進行GO 和KEGG 途徑富集分析。結果表明：下調表達基因主要富集在DNA 復制、鏈移位、DNA 復制起始和有絲分裂細胞周期的G1/S 轉換等生物過程，細胞質、細胞核和染色體著絲粒區(qū)域等細胞組份，單鏈DNA結合、DNA結合和ATP 結合等分子功能，范可尼貧血途徑、同源重組和p53等信號通路（圖2）；上調表達基因主要富集在DNA 損傷反應、p53 介導細胞周期停滯、細胞增殖正向調控和GTP 酶活性的正向調節(jié)等生物學過程，核小體、細胞連接和細胞質等細胞組份，生長因子活動、受體結合和蛋白質異二聚化活性等分子功能，p53信號通路、酗酒、慢性粒細胞白血病、軸突引導和ErbB 信號通路等功能途徑（圖3）。

圖2 下調差異表達基因的GO和KEGG途徑分析Fig.2 Gene ontology and KEGG pathway analysis results of down-regulated differentially expressed genes

圖3 上調差異表達基因的GO和KEGG分析Fig.3 Gene ontology and KEGG pathway analysis results of up-regulated differentially expressed genes

2.3 蛋白質相互作用網絡

將差異表達基因導入STRING數據庫分析蛋白質之間的相互作用（Protein-protein interaction，PPI），并利用Cytoscape 3.5.0軟件對結果進行可視化，構建了PPI網絡，其中包含有103個節(jié)點，376條邊，如圖4所示。

2.4 模塊分析

利用Cytoscape 軟件的MODE 插件對PPI 網絡進行模塊分析，篩選核心2 模塊，根據打分高低，獲得前3個核心模塊。模塊一包含46個節(jié)點和286條邊（圖5（a）），節(jié)點基因對應蛋白分別為HIST1H1C、OGG1、GTSE1、HELLS、MDM2、AEN、 KIAA1524、 MTFR2、 RAD51、 HELB、BRCA2、MCM10、CDC6、SESN1、PCNA、LIG1、HJURP、TCF19、CENPA、HSPA4、BLM、ANAPC2、FBXO5、 HIST1H2AC、 HIST1H2BK、 TMPO、HIST1H2BD、FANCI、DTL、PLK3、CCNE2、NCAPG、 DLGAP5、 KIF15、 BCL2L1、 BRIP1、KIFC1、 CASC5、 MKI67、 PMCH、 DDB2、HIST1H3H、LIN9、CHAF1B、HRAS 和KIF21A。功能主要富集在DNA復制啟動、細胞對DNA損傷刺激的反應、基于微管的運動、p53信號途徑、同源重組、細胞周期和癌癥途徑等信號通路（表1）。模塊二包含7個節(jié)點和11條邊（圖5（b）），節(jié)點基因對應蛋白分別為HIST1H1C、 GREB1、HIST1H3H、SYNE1、HIST1H2AC、HIST1H2BK和HIST1H2BD，功能主要富集在核小體組裝、粘膜中先天免疫反應和抗菌體液應答等生物途徑（表2）。模塊三有11 個節(jié)點和23 條邊組成（圖5（c）），節(jié)點基因分別為GAMT、PIDD1、PLK3、CYFIP2、HRAS、SESN1、TP53I3、BBC3、BCL2L1、MDM2和AEN。功能主要富集在有絲分裂細胞周期檢查點、細胞對氨基酸刺激的反應、神經細胞凋亡過程的負調節(jié)、p53 信號途徑和FoxO信號途徑（表3）。

圖4 蛋白質相互作用網絡:紅色圓形為上調表達基因編碼蛋白；綠色圓形為下調表達基因編碼蛋白；線條的粗細表示相互作用強度)(彩色見網絡版)Fig.4 Protein-protein interaction network:Red circle：up-regulated proteins；green circle：down-regulated proteins；and the line thickness represents the interaction strength（color online）

表1 模塊1的功能富集分析Table 1 Function enrichment analysis of genes in Module 1

圖5 蛋白質相互作用網絡核心模塊分析：（a）模塊1；（b）模塊2；（c）模塊3紅色圓圈為上調基因編碼蛋白；綠色圓圈為下調基因編碼蛋白；連線顏色深淺表示基相互作用的強弱（彩色見網絡版）Fig.5 Module analysis of PPI network:（a）module 1;（b）module 2;（c）module 3.Red circle:up-regulated proteins;green circle:down-regulated proteins;the color depth of the line represents the strength of the interaction among genes（color online）

表2 模塊2的功能富集分析Table 2 Function enrichment analysis of genes in Module 2

表3 模塊3的功能富集分析Table 3 Function enrichment analysis of genes in Module 3

2.5 Hub基因

利用插件CytoHubba 進一步分析構建的PPI 網絡，篩選前20 個差異表達的hub 基因，基因間的相互作用網絡如圖6所示。

圖6 蛋白質相互作用網絡中的前20個核心蛋白Fig.6 Protein-protein interaction network of the top 20 hub genes

篩選的前20 個基因為NCAPG、MCM10、DTL、DLGAP5、RAD51、CENPA、MKI67、CDC6、FANCI、FBXO5、KIF15、HELLS、HJURP、PCNA、GTSE1、CASC5、CCNE2、CHAF1B、BLM和KIFC1。包含20 個節(jié)點和53 條邊。這些基因中，僅有PCNA輻照后表達上調，其余基因均表達下調。

2.6 預后價值分析

為了進一步探討篩選到的核心基因對肺癌的預后價值，我們利用GEPIA 軟件結合TCGA 中的數據進行預后價值分析，如圖7 所示。前10 個核心 基 因 中 的MCM10（HR=1.5，p=0.005）、DLGAP5（HR=1.5，p＜0.001）、FANCI（HR=1.4，p=0.043）、CENPA（HR=1.6，p=0.002）、CDC6（HR=1.5，p=0.005）、FBXO5（HR=1.6，p=0.003）、NCAPG（HR=1.3，p=0.017）和DTL（HR=1.2，p=0.031）的表達水平均與肺癌的生存時間呈負相關（圖7（a）～（h））。

圖7 9個核心基因在肺癌病人中的預后價值Fig.7 Prognostic values of 9 genes in lung cancer patients

而輻照處理后這些基因的表達水平均降低，提示輻照可以抑制肺癌發(fā)生相關基因的表達，有利于患者的生存。此外，唯一在輻照后高表達的核心基因PCNA的表達水平與肺癌患者的預后呈負相關（HR=1.6，p=0.004）（圖7（i）），提示輻照也可在一定程度上促進腫瘤細胞的增殖。

3 討論

隨著核技術、醫(yī)學影像技術和計算機技術的不斷發(fā)展，放射治療技術取得了很大的進步，已成為當前腫瘤綜合治療的主要手段。臨床上65%～75%的癌癥患者在治療過程中需要接受放射治療，約40%的癌癥治愈患者將放療作為其病程管理的重要部分［10］。電離輻射作用于腫瘤細胞：一方面會導致蛋白質、DNA 和RNA 等生物大分子損傷，降低相關基因的表達，促進細胞凋亡、壞死、自噬和衰老，發(fā)揮腫瘤殺傷功能；另一方面，腫瘤細胞發(fā)生輻射損傷后會啟動自身的修復系統(tǒng)，通過調控某些基因的表達，應對輻射損傷，介導腫瘤輻射抵抗，促進腫瘤的復發(fā)和轉移［11-12］。對這些輻射后的差異表達基因進行分析，既有助于我們理解腫瘤放療的毒副反應，也可為腫瘤放療效果、病人預后以及復發(fā)轉移風險評估提供新的生物標記。

腫瘤微環(huán)境是指腫瘤細胞和相鄰正常組織之間的區(qū)域，其組成主要包括細胞外基質、可溶性分子和腫瘤基質細胞，在腫瘤的細胞免疫逃逸、腫瘤的生長、復發(fā)和轉移等過程中起著重要作用［13］。TAF 是腫瘤微環(huán)境的主要成員，在肺癌等多種腫瘤的進展和轉移過程中起著關鍵作用［14］。鑒于當前放射治療的大背景下，電離輻射對腫瘤支持性微環(huán)境的影響人們知之甚少，本研究利用生物信息學方法，探討電離輻射處理后TAF 中的差異表達基因及其介導的關鍵途徑，獲得了輻照后TAF中的上調表達基因144個，下調表達基因54個。GO和KEGG的分析結果表明，上調表達基因主要富集在DNA 損傷反應、p53 介導細胞周期停滯、細胞增殖正向調控、p53信號通路、慢性粒細胞白血病和ErbB 信號通路等功能途徑，而下調表達基因主要富集在DNA 復制、鏈移位、有絲分裂細胞周期的G1/S 轉換、范可尼貧血途徑、同源重組、p53等信號通路。電離輻射作用于機體，導致DNA 等生物大分子發(fā)生損傷，機體會通過調控一系列基因的表達來啟動損傷修復反應，誘導細胞周期停滯，促進DNA 修復，調控細胞增殖［15-16］。當然，高劑量的電離輻射會嚴重破壞細胞的組織結構，抑制許多功能基因的表達，導致細胞DNA復制及修復缺陷、細胞周期轉換障礙和細胞成熟障礙等［17-18］。然而，我們也發(fā)現高表達基因所富集的途徑也與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關，如ErbB信號通路的激活與肺癌等腫瘤的侵襲和轉移密切相關［19-20］，低表達基因富集的p53信號通路為經典的抑癌通路［21-22］，這些通路的改變很可能是放療后腫瘤發(fā)生復發(fā)與轉移的重要原因。

我們從PPI網絡中獲取了Top 20基因，分別為NCAPG、MCM10、DTL、DLGAP5、RAD51、CENPA、MKI67、CDC6、FANCI、FBXO5、KIF15、HELLS、HJURP、PCNA、GTSE1、CASC5、CCNE2、CHAF1B、BLM和KIFC1。這些基因基本都在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用，NCAPG在前列腺癌和肝癌病人中高表達，并參與促進腫瘤細胞的增殖和遷移，而下調NCAPG的表達可以抑制腫瘤細胞的生長［23-24］。MCM10是介導DNA 復制的重要蛋白，在多種腫瘤細胞和組織中高表達，參與促進腫瘤細胞的增殖［25-26］。DTL是E3 泛素蛋白連接酶的同源物，在肝癌腫瘤組織中高表達，下調DTL的表達可以誘導細胞周期停滯和衰老，抑制肝癌細胞生長和集落形成［27］。PCNA是這Top 20基因中唯一在輻照后表達增高的基因，是DNA聚合酶δ的輔助因子，肺癌等腫瘤中PCNA的表達顯著增加，促進腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲［28-29］。此外，這些樞紐基因與腫瘤的預后不良相關，與我們的預后分析結果基本一致，如NCAPG的表達與前列腺癌和肝癌生存期顯著負相關［23-24］；MCM10的表達與乳腺癌和前列腺癌患者的不良預后顯著相關［25-26］；DTL的表達與乳腺癌和肺癌的預后情況負相關［30］。這些研究結果提示，輻照處理后下調表達的腫瘤相關基因決定了腫瘤放射治療的效果，而上調表達的基因很可能在后續(xù)腫瘤的復發(fā)過程中起重要作用。

我們的研究結果表明，電離輻射處理后TAF中的基因表達和生物學途徑發(fā)生了改變，主要涉及細胞應激、DNA 損傷、細胞周期、衰老、細胞凋亡、氧化應激和基質重塑。電離輻射對TAF 既產生了抗腫瘤效應，也誘導了促腫瘤作用，其具體的作用機制值得我們通過體內實驗進一步探討。