鄭桂靈 李 鵬 周 峰

1（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院 青島266109）

2（南京曉莊學(xué)院食品科學(xué)學(xué)院 南京211171）

氡是鈾（238U）衰變鏈中鐳（226Ra）的衰變產(chǎn)物，半衰期為3.82 d。由于226Ra 廣泛存在于巖石、土壤等各種地質(zhì)環(huán)境中，所以，氡（222Rn）廣泛存在于大氣中，是自然界含量最豐富的天然放射性氣體［1］。氡氣本身在人體內(nèi)駐留時間短，不會對人體健康造成很大危害。但是，氡衰變子體的性質(zhì)與氡的性質(zhì)完全不同，它們是重金屬固體微粒，很容易和空氣中的顆粒物質(zhì)結(jié)合而變成結(jié)合態(tài)氡子體。氡子體被人體吸入后，衰變時產(chǎn)生的α粒子在體內(nèi)照射，使得身體受害組織或細(xì)胞（主要是肺器官）發(fā)生電離化，破壞脫氧核糖核酸（DNA）的分子結(jié)構(gòu)，影響細(xì)胞的再生過程，并引起細(xì)胞染色體的畸變，由此引發(fā)癌病變［2］。國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）已將氡及其子體歸為I 類致癌因素，世界衛(wèi)生組織（WHO）也把氡作為19種人類致癌因子之一［3］。氡及其子體對于動物體的損傷已有很多研究。吸入氡子體后，大鼠上皮細(xì)胞的周期停滯，合成DNA 的細(xì)胞數(shù)明顯減少［4］。Nie等［5］通過氡染毒大鼠尿液、外周淋巴細(xì)胞以及肺，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，氡可以增加大鼠的氧化損傷，并抑制DNA修復(fù)酶8-羥基鳥嘌呤DNA 糖苷酶和8-羥基脫氧三磷酸鳥嘌呤核苷酶表達(dá)下降。Joster等［6］利用25.4 GBq 的流動氡氣體照射源照射中國倉鼠卵巢細(xì)胞（Chinese hamsters ovary，CHO），在52 個氡誘發(fā)突變中，48%為基因丟失，23%為基因重組或失去1 個或幾個外顯子。之后的研究進(jìn)一步表明，氡及其子體衰變產(chǎn)生的α粒子會造成一系列遺傳上的改變，包括DNA 雙鏈斷裂、基因漂變、微核產(chǎn)生以及與之相關(guān)的蛋白表達(dá)等［7-11］。

氡對植物體是否像對動物體一樣造成損傷尚罕有報道［12-13］。Villalobos-Pietrini等［14］通過實(shí)驗表明，將Tradescantia花序經(jīng)不同濃度的氡氣處理后，在花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂的四分體期觀察到了微核的產(chǎn)生。我們的實(shí)驗表明：松蘿空鳳（Tillandsiausneoides，T.usneoides）和貝可利空鳳（Tillandsiabrachycaulos，T.brachycaulos）接受72 h的氡氣薰蒸后遭受到了一定的生理損傷，如松蘿空鳳電導(dǎo)率值上升、貝可利空鳳丙二醛（MDA）含量明顯增加等；同時具有一定的抗性，如超氧化物歧化酶（SOD）含量在兩種植物中均顯著增加［15-16］。放射性物質(zhì)對生物的傷害主要在于各種射線通過電離和激發(fā)對DNA 分子發(fā)生作用，使細(xì)胞受到損傷，從而導(dǎo)致各種危害［17］，而氡氣及其子體對植物DNA分子會產(chǎn)生什么影響一直未見報道。

我們繼續(xù)以空氣鳳梨中的兩種生態(tài)類型，即單株生長的貝可利空鳳和叢生的松蘿空鳳做為實(shí)驗材料，通過標(biāo)準(zhǔn)氡室對其進(jìn)行不同氡濃度熏蒸處理后檢測植物體的DNA 變化，以圖闡明氡是否可對植物體產(chǎn)生顯著影響，植物體受氡污染后哪些指標(biāo)可反映這一影響的程度，并探討了葉表鱗片在這一過程中所發(fā)生的作用，為研究氡與植物體的輻照損傷提供更多依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 氡室設(shè)置

在北京大學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)氡室中進(jìn)行植物的氡氣薰蒸處理。氡室由主腔室、氡源（226Ra）、測量系統(tǒng)（RAD7測氡儀，美國DURRIDGE公司）和其他配套設(shè)備組成；其容積約為1 m3，設(shè)有連接氡源（226Ra）的一條充氡氣路，以及連接測氡儀的一條測量氣路。氡室內(nèi)配有小型風(fēng)扇使腔室內(nèi)氡濃度均勻。

1.2 植物氡氣薰蒸

對單株生長的貝可利空鳳，選取生長健康、大小相似的40株，將其隨機(jī)分為4組。其中1組做為對照，置于正常室內(nèi)環(huán)境中（氡平均濃度約為20 Bq/m3）；1組人工去除其葉表鱗片后接受氡氣的熏蒸，初始氡濃度為2 560 Bq/m3；另2組不去除葉表鱗片，直接接受氡氣的熏蒸，初始氡濃度分別為2 879 Bq/m3和4 525 Bq/m3。

對于叢生的松蘿空鳳，稱取3叢生長健康的松蘿，每叢200 g，將其分為對照組和2 個實(shí)驗組。對照組置于正常室內(nèi)環(huán)境中，實(shí)驗組初始暴露濃度分別為2530 Bq/m3和3 910 Bq/m3。

為減少植物的自身生長狀態(tài)對實(shí)驗結(jié)果的影響，實(shí)驗前將植株浸泡于去離子水中20 min，使其吸水飽和，后在相同條件下統(tǒng)一晾30 min，以細(xì)線均勻懸掛于氡室中固定位置（圖1）。封閉氡室后調(diào)節(jié)氡室起始氡濃度，對植物持續(xù)熏蒸72 h 后測其遺傳指標(biāo)。

圖1 氡室中的空氣鳳梨:(a)貝可利空鳳；(b)松蘿空鳳Fig.1 Tillandsia plants in the radon chamber:(a)T.brachycaulos;(b)T.usneoides

1.3 彗星實(shí)驗

采用單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)（Single cell gel electrophoresis，SCGE），又稱彗星實(shí)驗（Comet assay）來檢測氡氣熏蒸后的植物DNA 損傷情況。由于該方法具有敏感、簡便、快速、低耗、重復(fù)性好等獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)，并可直接觀察單個細(xì)胞內(nèi)的DNA 損傷，從Ostling 等［18］采用SCGE 技術(shù)檢測DNA 的雙鏈斷裂開始，該方法迅速成為近年常用的DNA損傷檢測方法。

1.3.1 植物細(xì)胞核的提取

植物樣品用雙蒸水沖洗后剪碎，加入2%纖維素酶和果膠酶混合液，混勻后于4 ℃靜置2 h，梯度離心收獲，鏡下觀察細(xì)胞核形態(tài)完整，磷酸緩沖鹽溶液（PBS）重復(fù)洗滌細(xì)胞2次，將細(xì)胞懸于PBS，調(diào)整細(xì)胞濃度至2×104mL?1，置于4 ℃冰箱備用。

1.3.2 堿性單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗

（1）鋪膠：0.75%正常熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠煮沸后取100 μL迅速均勻鋪于自制微電泳槽內(nèi)，置于4 ℃冰箱1 min 使凝膠固化，取制好的細(xì)胞懸液25 μL 與75 μL 0.75%低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠混勻后均勻鋪于第一層凝膠上面，置于4 ℃冰箱固化1 min。（2）裂解：將微電泳槽置于新鮮配制的堿性裂解液中，于4 ℃冰箱中裂解2 h。（3）裂解后取出微電泳槽，用雙蒸水漂洗去掉多余的鹽分，置于提前加入4 ℃堿性電泳液的水平電泳儀中靜置20 min，然后在20 V，200 mA 電泳條件下電泳20 min。（4）染色和觀察：2 μg/mL溴化乙錠（EB）染色，雙蒸水漂洗，去掉多余染液，先在熒光顯微鏡（Axioskop 2 mot plus，Carl Zeiss，德國）低倍鏡下觀察彗星，然后在高倍鏡下，用圖像采集系統(tǒng)隨機(jī)抓取彗星圖像，每份樣品拍攝200個彗星細(xì)胞。

1.4 數(shù)據(jù)分析

每個彗星圖像均采用波蘭大學(xué)提供的CASP系統(tǒng)自動分析，測定彗星拖尾長度（Tail length）、彗星尾部DNA 相對含量（Tail DNA）、尾動量（TM）和Olive 尾動量（OTM）。對不同氡濃度處理后所測的遺傳指標(biāo)間的差異，采用SPSS 20.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，p＜0.05 視為差異有顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 氡對貝可利空鳳葉片DNA 的輻射損傷

不同濃度氡處理后，貝可利空鳳葉片細(xì)胞核電泳后獲得彗星圖像如圖2 所示。由圖2 可以看出，隨著氡濃度增加，彗星尾部逐漸增長，表明DNA 遷移量增加。且尾部DNA 的含量隨之增加。當(dāng)氡濃度增加到4 525 Bq/m3時，從彗星圖像上看仍然有明顯的頭部，但是DNA 遷移量明顯增加（圖2（d））。

以CASP 統(tǒng)計后，得到DNA 損傷程度的各種參數(shù)見表1。由表1 可以看出，與對照相比，被3種濃度的氡處理后，頭部DNA 相對含量顯著減少（p＜0.05）。這一趨勢在表征DNA 損傷程度的其他5個參數(shù)中更為明顯，隨著氡濃度增加，彗星長度、尾長、尾部DNA 相對含量、TM和OTM均顯著增加（p＜0.05），而且存在一定的劑量?效應(yīng)關(guān)系，說明氡引起了貝可利空鳳的DNA 損傷。

對去除葉表鱗片的植株而言（表1），雖然所施加的最初氡濃度較低（2 560 Bq/m3），但從彗星圖像上可以看出，與對照相比，彗星尾部明顯增長，DNA 遷移量明顯增加（圖2（c））。其DNA損傷指標(biāo)值（表1）與不去除鱗片植物經(jīng)高濃度（4 525 Bq/m3）氡處理后相近（p＞0.05），遠(yuǎn)大于不去除鱗片植物經(jīng)低濃度（2 879 Bq/m3）氡處理后的指標(biāo)（p＜0.05）。這說明沒有葉表鱗片時，植株DNA 輻射損傷程度更高，而葉表鱗片的存在對氡的輻射起到了一定的防護(hù)作用。

圖2 貝可利空鳳葉片經(jīng)氡處理后的彗星圖像：(a)對照；(b)植物未去除鱗片，氡初始濃度為2 879 Bq?m?3；(c)植物去除鱗片，氡初始濃度為2 560 Bq?m?3；(d)植物未去除鱗片，氡初始濃度為4 525 Bq?m?3Fig.2 Comet images for DNA damages in leaves of T.brachycaulos induced by radon:(a)control;(b)plants with foliar trichomes exposed to radon at initial concentration of 2 879 Bq?m?3;(c)plants without foliar trichomes exposed to radon at initial concentration of 2 560 Bq?m?3;(d)plants with foliar trichomes exposed to radon at initial concentration of 4 525 Bq?m?3

表1 貝可利空鳳經(jīng)氡處理后的SCGE分析Table 1 SCGE analysis of T.brachycaulos exposed to radon

2.2 氡對松蘿空鳳葉片DNA 的輻射損傷

經(jīng)過不同濃度氡處理后，松蘿空鳳葉片DNA損傷狀況與貝可利空鳳類似。隨著氡濃度增加，彗星尾部逐漸增長，表明DNA 遷移量逐漸增加（圖3）。以CASP 統(tǒng)計表明，頭部DNA相對含量明顯減少，尾部DNA相對含量明顯增加，彗星長度、尾長、TM 和OTM 的值也隨之顯著增加（p＜0.05），這說明氡也引起了松蘿空鳳DNA 損傷并存在一定的劑量?效應(yīng)關(guān)系（表2）。

圖3 松蘿空鳳經(jīng)氡處理后的彗星圖像：(a)對照；(b)氡初始濃度為2 530 Bq?m?3；(c)氡初始濃度為3 910 Bq?m?3Fig.3 Comet images for DNA damages in T.usneoides induced by radon:(a)control;(b)treated at initial concentration of 2 530 Bq?m?3of radon;(c)treated at initial concentration of 3 910 Bq?m?3of radon

表2 松蘿空鳳經(jīng)氡處理后的DNA損傷Table 2 DNA damage of T.usneoides exposed to radon

3 討論

我們之前的研究已表明，空氣鳳梨可通過表面吸附、葉片吸收等作用有效吸收氡室中的氡，意味著氡可對植物進(jìn)行體外輻照或內(nèi)部輻照［19］。彗星實(shí)驗所展示出來的DNA 指標(biāo)（表1、2）表明，貝可利空鳳和松蘿空鳳葉片DNA 確實(shí)不可避免地遭受了輻射損傷。在動物中，SCGE技術(shù)早已表明，隨著大鼠暴露氡及其子體劑量的增加，外周血淋巴細(xì)胞、單個核細(xì)胞、肺細(xì)胞、支氣管肺泡灌洗液細(xì)胞的DNA 遷移長度均逐漸增大，且有一定的劑量?效應(yīng)關(guān)系［8-10］。植物在遭受輻照后也會產(chǎn)生類似情況，Saghirzadeh等［20］通過彗星實(shí)驗發(fā)現(xiàn)高濃度的226Ra 對Alliumcepa的根細(xì)胞有巨大的影響。濃度1 000 μmol/L 的鈾會導(dǎo)致Phaseolus根 細(xì) 胞DNA 幾 乎 完 全 斷 裂、 彌 散［21］。 當(dāng)Tradescantia花粉母細(xì)胞經(jīng)氡處理后，在其細(xì)胞分裂的四分體階段出現(xiàn)了明顯的微核現(xiàn)象［14］。因此，當(dāng)空氣鳳梨葉片經(jīng)氡處理后，其尾部DNA、尾長、TM 和OTM 的值隨著氡濃度的增大而增加，且有明顯的劑量?效應(yīng)關(guān)系。這些指標(biāo)也可以作為反映氡對植物損傷的敏感指標(biāo)。

貝可利空鳳去除鱗片實(shí)驗也表明，空氣鳳梨對氡具有一定的抗性，而葉表鱗片在其中起著重要作用。因為在相近濃度氡脅迫下，人工去除鱗片的貝可利空鳳DNA 損傷程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于不去除鱗片的植株（表1）。實(shí)際上，做為常用的積累型指示植物，一個基本條件是必須具備的，即對污染物具有較強(qiáng)的抗性，不會受污染后很快致死?？諝怿P梨可以做為積累型指示植物的類群，已被廣泛應(yīng)用于Hg、Cu、Fe、Ni、Mn、Pb、V、Cs、Sr、Zn、PCB（多氯聯(lián)苯）、PAH（多環(huán)芳烴）等多種大氣重金屬、核素和有機(jī)污染物的監(jiān)測，其對各種污染物的較強(qiáng)抗性廣為人知［22-26］?？諝怿P梨葉片表面覆蓋有厚厚的鱗片，利用SEM 技術(shù)對松蘿空鳳吸收Hg、Pb、Cs、Sr 等重金屬粒子的研究表明，絕大部分重金屬顆粒被葉表鱗片所吸附［27］。也就是說，鱗片做為葉片最外層的保護(hù)結(jié)構(gòu)，能有效防止污染物進(jìn)入植物體內(nèi)對植物產(chǎn)生傷害。雖然氡是一種輻射性氣體，但其對生物體的影響除氣態(tài)的222Rn 外，主要是其各種粒子態(tài)的子體，如釙218（218Po）、鉛210（210Pb）、鉍210（210Bi）、釙210（210Po）等，它們均主要以類似重金屬的形式存在。因此，空氣鳳梨對氡也具有一定的抗性是不難理解的。

另外，即使有少量氡能進(jìn)入植物內(nèi)部，抗氧化酶系統(tǒng)的存在也能進(jìn)一步減輕氡對植物的傷害?？寡趸甘侵参锘钚匝踝杂苫宄齽?dāng)植物受到逆境脅迫時，這些保護(hù)酶的活性會增強(qiáng)，從而可以有效清除體內(nèi)的自由基，使膜系統(tǒng)減輕因自由基而引發(fā)的過氧化作用傷害，保持膜結(jié)構(gòu)及功能的穩(wěn)定［28-29］。之前的實(shí)驗已表明，貝可利空鳳和松蘿空鳳的SOD活性隨著氡濃度的增加顯著升高，說明在氡脅迫下，松蘿體內(nèi)活性氧清除體系開始發(fā)揮作用，這在一定程度上能減輕氡對植物的傷害，增強(qiáng)空氣鳳梨對氡的抗性［15-16］。