劉靜靜，李新悅，吳玉梅，馬 麗，張 兵，劉志東，李佳瑋

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，現(xiàn)代中藥發(fā)現(xiàn)與制劑技術(shù)教育部工程中心，天津 301617；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津市現(xiàn)代中藥重點實驗室-省部共建國家重點實驗室培育基地，天津 301617）

丹參為唇形科植物丹參（Salvia miltiorrhiza Bge.）的干燥根和根莖，是臨床常用中藥之一，其主要功能為活血化瘀、通經(jīng)止痛、清心除煩、涼血消癰，主治胸痹心痛、脘腹脅痛、癥瘕積聚和熱痹疼痛等，為中藥中的婦科要藥。丹參酮ⅡA（TanⅡA）為丹參中提取的主要脂溶性有效成分之一，其對心血管系統(tǒng)具有較強(qiáng)的藥理作用[1-3]，臨床上得到了廣泛應(yīng)用。近幾年，TanⅡA 的抗腫瘤作用頗受關(guān)注[4-5]，有研究表明，TanⅡA 可抑制多種婦科惡性腫瘤細(xì)胞的生長，同時具有殺傷以及促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，比如：乳腺癌、宮頸癌、卵巢癌等[6-9]。但是，由于TanⅡA 水溶性極差，生物利用度低，光、熱不穩(wěn)定性等問題，極大的限制了其在臨床上的應(yīng)用。

納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體（NLC）是繼固體結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體（SLN）后發(fā)展的第二代新型脂質(zhì)納米給藥系統(tǒng)，其中液態(tài)脂質(zhì)的加入，破壞了原本規(guī)整有序的晶格結(jié)構(gòu)，避免形成完整晶格的脂質(zhì)將藥物排擠出來，使藥物有了更大的存儲空間，改善了SLN 易泄露的弊端，極大的提高了藥物的溶解性以及制劑的包封率，同時具有較高的藥物保護(hù)作用，有利于藥物的長期保存。

葉酸受體是一種單鏈跨膜糖蛋白，其在大多腫瘤細(xì)胞表面過度表達(dá)，而在正常細(xì)胞表面的表達(dá)極為保守甚至不表達(dá)[10]，這一特點使其成為腫瘤靶向遞藥系統(tǒng)領(lǐng)域的研究熱點，同時葉酸及其衍生物與葉酸受之間的高度親和力，使其兩者可特異性結(jié)合形成復(fù)合物，從而實現(xiàn)對腫瘤的主動靶向作用。

本實驗采用乳化蒸發(fā)-低溫固化法制備葉酸靶向修飾的載丹參酮ⅡA 納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體（FA-TanⅡA-NLC），增加了丹參酮ⅡA 的溶解性，采用超濾離心-HPLC 法對其包封率進(jìn)行測定，同時考察制劑的粒徑和電位，采用透射電子顯微鏡（TEM）觀察制劑外觀形態(tài)，差示掃描熱量法（DSC）以及X 射線衍射法（XRD）驗證TanⅡA 于納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體中的存在狀態(tài)。

1 材料與試劑

1.1 儀器 1260 型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；Nano ZS 型激光散射粒徑分析儀（Malvern）；EMS-8B 型磁力加熱攪拌器（天津歐諾儀器儀表有限責(zé)任公司）；BPll0S 型分析天平（德國Sartorius 公司）；XP205 型電子天平（METTLER TOLEDO）；SB-3200D型數(shù)控超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司）；臺式通用冷凍離心機(jī)（Thermo Fisher）；Milli-Q型超純水系統(tǒng)（Millipore）。

1.2 材料 丹參酮ⅡA（南京澤朗生物科技有限公司，純度＞98%）；DSPE-PEG2000-FA（上海艾韋特醫(yī)藥科技有限公司）；大豆磷脂（Lipoid S-100，上海東尚實業(yè)有限公司）；聚氧乙烯（40）硬脂酸酯（Myrj 52，南京威爾化工有限公司）；辛酸/癸酸三甘油酯（Miglyol 812，北京鳳禮精求商貿(mào)有限公司）；單硬脂酸甘油酯[GMS，博歐特（天津）化工貿(mào)易有限公司）；三氯甲烷、乙醇（分析純，天津康科德科技有限公司）；甲醇、乙腈（色譜純，天津康科德科技有限公司），去離子水自制。

2 方法與結(jié)果

2.1 TanⅡA-NLC 的制備 TanⅡA-NLC 的制備采用的是乳化蒸發(fā)-低溫固化法。精密稱定處方量的Myrj 52，溶于去離子水中，水浴74～75 ℃磁力攪拌溶解，作為水相；精密稱定處方量大豆磷脂溶于無水乙醇中，超聲溶解，丹參酮ⅡA、GMS 和Miglyol 812 溶于氯仿中，將乙醇溶液在水浴74～75 ℃中與氯仿溶液混合均勻，作為有機(jī)相。水浴74～75 ℃中，將有機(jī)相緩慢加入水相中，600 rpm 磁力攪拌至澄清后，轉(zhuǎn)速降為300 rpm，揮發(fā)有機(jī)溶劑至溶液體積為10 mL，4 ℃冷卻2 h 后，過孔徑為0.22 μm 濾膜即得TanⅡA-NLC 溶液。

2.2 FA-TanⅡA-NLC 的制備 將DSPE-PEG2000-FA 同TanⅡA、GMS 以及Miglyol 812 共同加入氯仿中溶解，按“2.1”項下方法制備FA-TanⅡA-NLC。

2.3 粒徑和Zeta 電位的測定 取適量制劑，加入去離子水稀釋至適宜濃度，使用馬爾文激光粒度測定儀測定其粒徑、PDI 和電位，結(jié)果見圖1～3，TanⅡA-NLC 粒徑為（14.21±0.24）nm，PDI 為0.199±0.02，電位為（-8.91±0.94）mV；FA-TanⅡA-NLC 粒徑為（19.14±0.43）nm，PDI 為0.424±0.01，電位為（-11.67±0.25）mV。

2.4 包封率（EE）的測定

由圖2可知，以綜合滋味得分3分(y值)為接受臨界點，確定鍍鋁袋脆口蘿卜產(chǎn)品各儲存溫度的貨架期(保質(zhì)期)：35 ℃產(chǎn)品貨架期=Qs(35)=(5-3)/0.0173=115.61天；45 ℃產(chǎn)品貨架期=Qs(45)=(5.084-3)/0.0357=58.38天；Q10value=Qs(35)/Qs(45)=115.61/58.38=1.98；推算產(chǎn)品流通貨架期為Qs(25)=Q10value×Qs(35)=1.98×115.61=228.91天，即鍍鋁袋脆口蘿卜產(chǎn)品貨架期(保質(zhì)期)為229天。

圖1 Blank-NLC 粒徑、電位

圖2 TanⅡA-NLC 粒徑、電位

圖3 FA-TanⅡA-NLC 粒徑、電位

2.4.1 色譜條件 色譜柱為Waters C18RP（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為乙腈∶水=90∶10，檢測波長為269 nm，流速為1 mL/min，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為10 μL。

2.4.2 專屬性實驗 分別取甲醇、TanⅡA 對照品以及空白NLC 進(jìn)樣，在上述色譜條件下測定。TanⅡA 出峰位置處，甲醇及空白NLC 在此處無吸收峰，由此表明溶劑及輔料對丹參酮ⅡA 的測定無影響，該方法專屬性良好。見圖4。

圖4 測定甲醇中TanⅡA 含量專屬性色譜圖

2.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密稱取TanⅡA 對照品5 mg，以甲醇溶解于50 mL 容量瓶中，配制成100 μg/mL 的TanⅡA 儲備液。分別取TanⅡA 儲備液適量用甲醇稀釋至每1 mL 含有1、2、4、10、20 和50 μg TanⅡA 的系列溶液，按“2.4.1”項下測定，以峰面積（A）對質(zhì)量濃度（C）做回歸曲線，得回歸方程為A=55.873C-6.907 7，R2=0.999 8，由結(jié)果可知TanⅡA 標(biāo)準(zhǔn)溶液在1.02～50.80 μg/mL 的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4.4 精密度實驗 取濃度分別為2、10 和20 μg/mL的高、中、低3 個濃度的TanⅡA 溶液，于1 d 內(nèi)按“2.4.1”項下測定方法測定3 次，計算日內(nèi)精密度，連續(xù)測定2 d，計算日間精密度。由結(jié)果可知，高、中、低3 個濃度的日內(nèi)精密度RSD 分別為0.14%、0.32%、0.17%，日間精密度為0.28%、0.13%、0.02%，RSD 均小于2%，表明儀器精密度符合要求，此方法用于丹參酮ⅡA 的含量測定準(zhǔn)確可靠。

2.4.5 重復(fù)性實驗 按“2.1”項下方法制備TanⅡA-NLC，取0.5 mL 制劑，加入甲醇及1%氯化鈉超聲破乳后，過孔徑為0.22 μm 的濾膜，平行制備6 份樣品，續(xù)濾液按“2.4.1”項下測定方法進(jìn)行測定得峰面積，計算RSD。TanⅡA 重復(fù)性RSD 為1.25%，說明樣品測定方法符合要求，重復(fù)性良好。

2.4.6 穩(wěn)定性實驗 按“2.1”項下方法制備TanⅡA-NLC 樣品溶液0.5 mL，加入甲醇及1%氯化鈉超聲破乳后，過孔徑為0.22 μm 的濾膜，取續(xù)濾液按“2.4.1”項下測定方法分別在0、2、4、6、8、12 和24 h進(jìn)行測定，通過測得的峰面積，計算RSD。結(jié)果穩(wěn)定性RSD 為1.19%，表明樣品在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.7 TanⅡA-NLC 包封率的測定 本實驗采用超濾離心-HPLC 法測定制劑包封率。取制劑0.5 mL加去離子水稀釋至3 mL 于50 KD 超濾離心管中，5 000 rpm/min 離心20 min 后取外管溶液過孔徑0.22 μm 濾膜后，樣品按“2.4.1”項下測定方法進(jìn)行測定，結(jié)果記為W 游離。另取制劑0.5 mL 于10 mL容量瓶內(nèi)，加甲醇及1%氯化鈉超聲40 min 破乳后定容，過0.22 μm 濾膜后，樣品按“2.4.1”項下測定方法進(jìn)行測定，結(jié)果記為W總。

包封率E%=（1-W總/W游離）×100%

根據(jù)公式得TanⅡA-NLC 中TanⅡA 的包封率為99%以上。

2.5 FA-TanⅡA-NLC 理化表征

2.5.1 透射電鏡檢測（TEM） 分別取TanⅡANLC、FA-TanⅡA-NLC 適量置于銅網(wǎng)上，2%磷鎢酸染色后自然干燥。利用TEM 對制劑形態(tài)進(jìn)行觀察并拍照。結(jié)果如圖5 所示，制劑多呈圓球狀，外觀完整，分散均勻。

圖5 TanⅡA-NLC（a）和FA-TanⅡA-NLC（b）透射電鏡圖

2.5.2 差示掃描量熱法（DSC） 分別取TanⅡA 對照品、空白NLC 凍干粉、TanⅡA-NLC 凍干粉、FATanⅡA-NLC 凍干粉、TanⅡA 對照品與空白NLC凍干粉的物理混合物（2∶1）適量于坩堝中進(jìn)行DSC檢測。以空白鋁鍋作為對照，設(shè)置儀器參數(shù)如下：加熱速率為10 ℃/min，掃描范圍30 ℃～300 ℃，記錄數(shù)據(jù)與圖譜。

根據(jù)圖中各樣品的DSC 圖譜可初步判斷藥物在制劑中的存在形式。見圖6a 為TanⅡA 對照品，可見其在218.44°C 處出現(xiàn)一個吸熱峰；b 為空白NLC 凍干粉，其吸熱峰出現(xiàn)在47.61°C 處；e 為取TanⅡA 對照品與空白NLC 凍干粉的物理混合物，均存在上述單標(biāo)的特征吸熱峰；c、d 分別為TanⅡA-NLC 凍干粉和FA-TanⅡA-NLC 凍干粉，其圖譜中只存在制劑特征吸熱峰，而無TanⅡA 藥物峰出現(xiàn)，說明TanⅡA 以分子形式被包裹于制劑中，而不是以晶體形式存在。

圖6 TanⅡA（a），Blank-NLC（b），TanⅡA-NLC（c），F(xiàn)ATanⅡA-NLC（d）與物理混合物（e）的差示掃描量熱圖

2.5.3 X 射線衍射法（XRD） 精密稱取TanⅡA 對照品，Blank-NLC 凍干粉，TanⅡA-NLC 凍干粉，F(xiàn)A-TanⅡA-NLC 凍干粉及物理混合物（丹參酮IIA對照品：空白納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體凍干粉=2∶1）進(jìn)行測定。

測定條件：Ni-濾液器，Cu-Kɑ 射線，波長為1.540 56d魡，40 kW 電壓和400 mA 電流，在5°～80°的2θ 范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，分別繪制X 射線衍射圖。見圖7。結(jié)果如圖所示，Tan IIA（a）在7.04°～14.25°有特征峰，而Tan IIA-NLC 凍干粉（c）以及FA-TanⅡA-NLC 凍干粉（d）中無此特征峰，這與DSC 結(jié)果一致，即Tan IIA 以分子狀態(tài)被包裹于納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體中，而不是以晶體狀態(tài)存在。

圖7 TanⅡA（a），Blank-NLC（b），TanⅡA-NLC（c），F(xiàn)ATanⅡA-NLC（d）與物理混合物（e）的X 射線衍射圖

3 討論

本實驗選擇丹參酮IIA 作為治療藥物，但是丹參酮IIA 水溶性極差，對于藥物本身而言，良好的溶解性是其發(fā)揮藥效作用的基礎(chǔ)。因此研究丹參酮IIA 新劑型，改善其溶解度使其更好的發(fā)揮藥理作用是目前開發(fā)丹參酮IIA 抗腫瘤藥物所面臨的一大問題。

隨著對納米藥物載體的不斷深入研究，利用載體包載藥物使其進(jìn)入體內(nèi)為丹參酮IIA 新劑型的研發(fā)提供了新思路。納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體中的脂質(zhì)材料具有良好的生物相容性及生物可降解性，可提高藥物的生物利用度，具有良好的緩釋效果，其滲透滯留效應(yīng)可使藥物高濃度聚集分布在腫瘤部位，同時通過連接配體，可實現(xiàn)藥物制劑的腫瘤主動靶向性，為臨床抗腫瘤藥物劑型提供了又一重要選擇。本實驗筆者選用納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體包載丹參酮IIA，改善丹參酮IIA 的溶解性，同時在制劑表面修飾含有葉酸的PEG 鏈配體，利用葉酸與腫瘤細(xì)胞表面高度表達(dá)的葉酸受體之間的高度親和力，實現(xiàn)藥物制劑的主動腫瘤靶向作用。

在制劑制備過程中，筆者對其處方進(jìn)行了篩選，以制劑狀態(tài)、粒徑、電位、穩(wěn)定性等為指標(biāo)，選出最優(yōu)處方。對固態(tài)脂質(zhì)種類[山崳酸甘油酯（Com pritol(R) 888 ATO）、單硬脂酸甘油酯（GMS）]、液態(tài)脂質(zhì)種類[辛酸/癸酸甘油酯（Miglyol 812）、大豆油、花生油]、固液脂質(zhì)比（1∶2、1∶1、2∶1）、投藥量（2、2.5、3 mg）、溫度（70、75、80 ℃）等進(jìn)行了考察，最終確定最優(yōu)處方為：選用固態(tài)脂質(zhì)GMS，液態(tài)脂質(zhì)Miglyol 812，固液脂質(zhì)比1∶1，投藥量2.5 mg，溫度75 ℃。以最優(yōu)處方制備的制劑，外觀澄清透明，粒徑均一，分散較好，于4 ℃環(huán)境下保存，制劑較為穩(wěn)定。

另外在包封率的測定過程中，由于制備的制劑粒徑較小，葡聚糖凝膠色譜法以及高速離心法無法實現(xiàn)游離藥物以及制劑的有效分離，因此，筆者選用超濾離心法，通過低溫高速離心，將制劑截留于超濾內(nèi)管中，游離藥物被超濾到外管中，直接檢測游離藥物濃度，此方法方便可行，具有良好的重現(xiàn)性。同時采用傳統(tǒng)的甲醇超聲破乳方法，無法使制劑中的藥物完全游離出來，因此，筆者對破乳試劑進(jìn)行了考察，分別測定加入甲醇、乙醇、甲醇+1%氯化鈉后超聲破乳的制劑藥物濃度，最終選擇甲醇+1%氯化鈉作為破乳試劑，在此方法下，制劑破乳完全。

后期實驗中，筆者將進(jìn)一步考察TanⅡA-NLC、FA-TanⅡA-NLC 制劑對腫瘤細(xì)胞的體外抑制作用，并深入考察TanⅡA-NLC、FA-Tan ⅡA-NLC 制劑的體內(nèi)抗腫瘤藥效作用以及生物組織分布研究，為后期TanⅡA-NLC、FA-TanⅡA-NLC 抗腫瘤作用的臨床應(yīng)用提供全面可靠的實驗依據(jù)。