王志強，許 娟，趙志紅，曹麗娟，李希凡，李天祥

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617；2.天津市南開醫(yī)院藥學(xué)部，天津 300100；

3.天津盛實百草藥業(yè)有限公司，天津 300301）

丹參為唇形科植物丹參（Salvia miltiorrhiza Bge.）的干燥根和根莖，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》并列為上品，擁有兩千多年應(yīng)用歷史，為常用的大宗藥材[1]。本品性微寒，味苦；歸心、肝經(jīng)，具有活血祛瘀、通經(jīng)止痛、清心除煩、涼血消癰的功效[2]。臨床研究表明，丹參除在治療心腦血管疾病方面發(fā)揮重要作用外，還具有降血壓、降血脂、抗氧化、改善記憶力、抗腫瘤、抗炎、保肝、擴冠等藥理活性[3-5]。

目前，丹參野生資源銳減，無法滿足市場，市場供應(yīng)以栽培品為主。中國四川、陜西、山東、河南、河北、山西等地廣泛引種栽培[6]。當(dāng)前市場上不同產(chǎn)地的栽培品丹參廣泛流通，質(zhì)量參差不齊?，F(xiàn)行2015 版《中華人民共和國藥典》丹參項下的質(zhì)控指標(biāo)僅有丹參酮ⅡA 類（丹參酮ⅡA、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ）和丹酚酸B，但現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明丹參主要功效成分除了丹參酮ⅡA 類和丹酚酸B 外，丹酚酸A、丹參素、原兒茶醛、丹參酮ⅡB、異隱丹參酮等丹參酚酸類和丹參酮類成分[7-8]也作用明確。

為全面考察、分析不同產(chǎn)地丹參藥材的整體質(zhì)量，查閱相關(guān)文獻[9-10]，總丹參酮和總丹酚酸為丹參活血祛瘀、涼血消癰、清心除煩的主要物質(zhì)基礎(chǔ)，丹參酮ⅡA 類和丹酚酸B 是丹參通經(jīng)止痛的功效成分，其中總丹參酮表現(xiàn)出抗炎、抗腫瘤的生物活性，總丹酚酸具有抗心肌損傷的功效，丹參酮ⅡA 類可以擴張冠動脈，丹酚酸B 抗動脈粥樣硬化，總浸出物為丹參發(fā)揮整體藥效的總物質(zhì)基礎(chǔ)。因此，本研究以總丹酚酸、總丹參酮、丹酚酸B、丹參酮ⅡA 類等4 類藥效組分作為丹參品質(zhì)評價的指標(biāo)成分，總浸出物作為丹參質(zhì)量考察的整體成分，對收集的不同產(chǎn)地丹參樣品進行系統(tǒng)考察，以期闡明不同產(chǎn)地間丹參藥效組分的變化規(guī)律。

1 實驗材料

1.1 樣品來源 7 產(chǎn)區(qū)12 個產(chǎn)地的丹參樣品（見表1），經(jīng)天津中醫(yī)藥大學(xué)李天祥教授鑒定為唇形科植物丹參（Salvia miltiorrhiza Bge.）的干燥根及根莖。除去樣品的泥沙與雜質(zhì)，待樣品干燥后粉碎過3 號篩，備用。

1.2 儀器 高效液相色譜儀（配置B05 型高壓梯度泵、UV 1000 型全波段可編程紫外可見檢測器、CSChrom Plus 色譜工作站、美國Alltech 科技有限公司），UV-6100 型紫外可見分光光度計（上海美普達有限公司），遠紅外快速干燥箱（上海賀德實驗設(shè)備有限公司），二列四孔智能水浴鍋（河南省鞏義市儀器有限責(zé)任公司），調(diào)溫電熱套（山東省鄄城永興儀器廠），SB25-12DT 超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司），F(xiàn)A 2104 電子天平（200 g，上海舜宇恒平科技儀器有限公司）。

表1 丹參樣品收集信息

1.3 試劑 硝酸鋁（分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠），氫氧化鈉（分析純，天津市江天化工技術(shù)有限公司），亞硝酸鈉（分析純，天津市江天化工技術(shù)有限公司）。丹參酮ⅡA 對照品（北京鼎國昌盛技術(shù)有限公司，MUST-1103301），丹酚酸B 對照品（北京鼎國昌盛技術(shù)有限公司，MUST-15081916）。甲酸（色譜純，天津市光復(fù)精細化工研究所），磷酸（色譜純，天津市光復(fù)精細化工研究所），甲醇（色譜純，天津市康科德科技有限公司），甲醇（分析純，天津市江天化工技術(shù)有限公司），95%乙醇（分析純，天津市江天化工技術(shù)有限公司），無水乙醇（分析純，天津市富宇精細化工有限公司），乙腈（色譜純，天津市康科德科技有限公司），娃哈哈純凈水（天津娃哈哈食品有限公司）。

2 實驗方法

2.1 供試品溶液的制備

2.1.1 總丹參酮 精密稱定0.5 g 丹參粉末于100 mL錐形瓶中，加入40 mL 甲醇后稱定質(zhì)量，用70 ℃水浴回流1 h，取下擦干瓶壁水分放冷后補足減失質(zhì)量，搖勻，濾過，精密量取0.2 mL 續(xù)濾液于10 mL 容量瓶中用甲醇定容至刻度，即得供試品溶液，然后于268 nm 處測吸光度。

2.1.2 總丹酚酸 精密稱定丹參粉末0.2 g 于100 mL錐形瓶中，加入80%甲醇溶液40 mL，于80 ℃水浴回流1 h，趁熱過濾，濾液放冷后轉(zhuǎn)移至50 mL 容量瓶中，用80%甲醇溶液定容至刻度，搖勻后取0.3 mL于10 mL 棕色容量瓶中，依次加入5%亞硝酸鈉溶液0.5 mL，振蕩搖勻，然后加入10%硝酸鋁溶液0.5 mL，振蕩搖勻，反應(yīng)5 min 中后用1 mol/L 氫氧化鈉溶液定容至刻度，搖勻后于496 nm 處測吸光度。

2.1.3 丹參酮ⅡA 類（丹參酮ⅡA、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ） 取丹參樣品粉末約0.3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率140 W，頻率42 kHz）30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4 丹酚酸B 取丹參樣品粉末0.15 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇溶液50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率140 W，頻率42 kHz）30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用80%甲醇溶液補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液1 mL，移至10 mL 容量瓶中，加80%甲醇溶液定容至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.5 總浸出物 精密稱定丹參樣品粉末2 g，置100 mL 錐形瓶中，精密加稀乙醇（50%）50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，靜置1 h 后，連接回流冷凝管，加熱至沸騰，并保持微沸1 h。放冷后，取下錐形瓶，密塞，擦干錐形瓶表面水分，再稱定質(zhì)量，用稀乙醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，用干燥濾器濾過，精密量取濾液25 mL，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，在水浴上蒸干后，于105 ℃干燥3 h，然后置干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱定質(zhì)量。以干燥品計算供試品中浸出物的含量（%）。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)對照品溶液制備

2.2.1 總丹參酮 取丹參酮ⅡA 對照品適量，精密稱定，置棕色容量瓶中，加甲醇制成0.1 mg/mL 的溶液，即得。

2.2.2 總丹酚酸 取丹酚酸B 對照品適量，精密稱定，置棕色容量瓶中，加80%甲醇溶液制成0.32 mg/mL的溶液，即得。

2.2.3 丹參酮ⅡA 類 取丹參酮ⅡA 對照品適量，精密稱定，置棕色容量瓶中，加甲醇制成0.1 mg/mL的溶液，即得。

2.2.4 丹酚酸B 取丹酚酸B 對照品適量，精密稱定，加80%甲醇溶液制成0.28 mg/mL 的溶液，即得。

2.3 色譜條件

2.3.1 丹參酮ⅡA 類色譜條件 色譜柱Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫25 ℃；進樣量10 μL；流動相：乙腈（A）-0.02%磷酸溶液（B）；流速1.0 mL/min；梯度洗脫0～6 min、61% A；6～20 min、61%～90% A；20～20.5 min、90%～61%A；20.5～25min、61%A；檢測波長270 nm。

2.3.2 丹酚酸B 色譜條件 色譜柱Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫25 ℃；進樣量10 μL；流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B）（22：78）；檢測波長286 nm；流速1.2 mL/min。2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察 分別精密量取“2.2”項下總丹參酮、總丹酚酸、丹參酮ⅡA 類、丹酚酸B 對應(yīng)對照品溶液適量制備系列梯度對照品溶液，然后分別用紫外分光光度計測吸光度，液相色譜儀測峰面積，以吸光度或峰面積為縱坐標(biāo)，對照品濃度為橫坐標(biāo)，擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表2。

表2 丹參中4 種藥效組分的回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍

2.4.2 精密度實驗 分別精密量取各對照品溶液適量按照上述各自對應(yīng)供試品的測定條件連續(xù)測定6 次，計算得總丹參酮、總丹酚酸的吸光度RSD分別為0.13%、0.17%，丹參酮ⅡA 類、丹酚酸B 的峰面積RSD 分別為0.83%、0.65%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 重復(fù)性實驗 依據(jù)上述供試品制備方法制備四種藥效組分各自對應(yīng)的供試品溶液各6 份，按照對應(yīng)的測定方法分別進行測定，結(jié)果總丹參酮、總丹酚酸吸光度RSD 分別為2.45%、0.52%，丹參酮ⅡA 類、丹酚酸B 峰面積RSD 分別為1.04%、0.52%，表明各方法重復(fù)性良好。

2.4.4 穩(wěn)定性實驗 分別取總丹參酮和總丹酚酸的供試品溶液適量，每間隔10 min 測1 次吸光度，連續(xù)測定1 h，計算得1 h 內(nèi)總丹參酮和總丹酚酸吸光度RSD 分別為1.92%、0.93%，表明總丹參酮和總丹酚酸供試品溶液在1 h 內(nèi)基本穩(wěn)定。分別取丹參酮ⅡA、丹酚酸B 供試品溶液適量，注入液相色譜儀，分別在2、4、6、8、10、12 h 測定峰面積，結(jié)果丹參酮ⅡA、丹酚酸B 峰面積RSD 分別為1.49%、2.62%，表明丹參酮ⅡA 類、丹酚酸B 供試品溶液在12 h 內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.4.5 回收率實驗 分別精密稱定丹參樣品各6 份，加入各方法相對應(yīng)的對照品適量，按“2.1”項下各方法制備對應(yīng)供試品溶液，然后進行含量測定，計算得總丹參酮、總丹酚酸、丹參酮ⅡA 類、丹酚酸B 加樣回收率分別為97.83%、100.1%、94.38%、100.9%，RSD 分別為2.10%、1.84%、1.91%、2.86%，表明各方法可行。

2.5 丹參酮ⅡA、丹酚酸B 對照品和供試品色譜圖 丹含酮ⅡA、丹酚酸B 對照品和供試品色譜圖見圖1。

圖1 丹參對照品（A、B）和樣品（C、D）HPLC 色譜圖

2.6 樣品含量測定 取丹參樣品按“2.1”項下供試品制備及測量方法，重復(fù)3 次，結(jié)果取算術(shù)平均值，用Excel 和SPSS 軟件統(tǒng)計分析。

3 實驗結(jié)果及分析

由表3 數(shù)據(jù)可知，不同產(chǎn)地丹參各藥效組分含量有較大差異?；? 個產(chǎn)區(qū)12 個產(chǎn)地藥材各藥效組分的平均含量，山東臨沂丹參總丹參酮含量最高，除與陜西商洛、四川中江、天津北辰樣品無顯著性差異外，與其他產(chǎn)地樣品相比有顯著性差異。河南方城丹參中丹參酮ⅡA 類、四川中江丹參總丹酚酸和丹酚酸B 含量最高，與其他產(chǎn)地丹參樣品相比均有顯著性差異，且這3 個產(chǎn)地丹參的藥典指標(biāo)成分含量均高于規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)。其次，山東夏津，陜西寶雞、商洛，天津北辰、靜海所產(chǎn)丹參丹參酮ⅡA 類、丹酚酸B 含量也均符合藥典標(biāo)準(zhǔn)，質(zhì)量相對較優(yōu)?；谏鲜?，市場上認為山東臨沂、四川中江、河南方城所產(chǎn)丹參質(zhì)量較優(yōu)具有一定合理性。

基于藥典指標(biāo)成分丹參酮ⅡA 類（不低于0.25%）和丹酚酸B（不低于3.0%）的含量，焦作、安國、運城3 個產(chǎn)地丹參中丹參酮ⅡA 類含量低于藥典限量水平。綿陽1 個產(chǎn)地丹參中丹參酮ⅡA 類和丹酚酸B 含量均不合格。不合格品占所收集樣品的1/3，其中丹參酮ⅡA 類含量不達標(biāo)為藥材不合格的主要原因。各產(chǎn)地樣品丹參酮ⅡA 類的含量在0.037%-0.65%之間，最高者是最低者17 倍以上，波動較大。丹酚酸B 含量在2.99%～8.95%之間，最高者約是最低者3 倍。說明當(dāng)前市場上丹參質(zhì)量參差不齊，并存在一定量的不合格藥材。

基于總丹參酮含量，各樣品在0.92%～2.20%之間波動，最高者是最低者2 倍以上，各產(chǎn)地間差異相對較小?；诳偟し铀岷浚鳂悠吩?.90%～9.57%之間波動，各產(chǎn)地間波動明顯。從總浸出物含量來看，山西運城最高，為68.32%，陜西商洛最低，為54.39%，其含量差異達13.91%，各產(chǎn)地間丹參代謝物質(zhì)積累量存在一定差異。說明產(chǎn)地不同，丹參功效物質(zhì)含量不同。

4 結(jié)論

不同產(chǎn)地丹參藥效組分含量存在較大差異，其中指標(biāo)成分丹參酮ⅡA 類含量波動尤為明顯，是導(dǎo)致丹參質(zhì)量不合格的主要原因。河北、河南、山西、四川的部分產(chǎn)地有不合格品存在，均為指標(biāo)成分丹參酮ⅡA 類含量低于藥典標(biāo)準(zhǔn)。河南方城、山東臨沂、陜西商洛、四川中江作為丹參的道地產(chǎn)區(qū)，所產(chǎn)丹參質(zhì)量相對較優(yōu)。丹參生態(tài)適應(yīng)性很強，可廣泛引種，由于不同產(chǎn)地的大氣環(huán)境、土壤因子、水熱條件等存在差異，研究發(fā)現(xiàn)，非道地產(chǎn)區(qū)引種栽培后的質(zhì)量存在不合格問題，因此，丹參非道地產(chǎn)區(qū)引種的合理性應(yīng)值得高度關(guān)注。

5 討論

5.1 優(yōu)質(zhì)丹參產(chǎn)區(qū)確立依據(jù)及丹參藥效組分特點 歷代本草中記載的丹參產(chǎn)地有“桐柏山川谷及泰山、河?xùn)|州郡及隨州”，對相關(guān)地名進行考證即為當(dāng)今的河南方城、山東臨沂、陜西商洛、湖北隨縣等地，可認為這些地區(qū)是丹參古時的優(yōu)質(zhì)產(chǎn)區(qū)，以野生資源為主?，F(xiàn)今丹參野生資源急劇減少，供應(yīng)以栽培為主，山東、山西、陜西、四川、河南、河北等地均規(guī)模種植，全國銷售。其中，山東臨沂、陜西商洛、河南方城從古至今一直是丹參的主要分布區(qū)，被認為是優(yōu)質(zhì)丹參產(chǎn)區(qū)。四川中江丹參引種歷史最長，現(xiàn)今也作為優(yōu)質(zhì)丹參產(chǎn)區(qū)之一。實驗結(jié)果表明，山東臨沂、陜西商洛、四川中江、河南方城丹參作為當(dāng)今比較公認的優(yōu)質(zhì)丹參資源，表現(xiàn)為其總浸出物含量均超過50%，其總丹參酮含量遠高于其他產(chǎn)地丹參，丹參酮ⅡA 類、總丹酚酸和丹酚酸B 均處于較高水平。

表3 不同產(chǎn)地丹參各藥效組分含量測定結(jié)果mg/g

5.2 產(chǎn)地生態(tài)因素對藥材外觀品相和丹參藥效組分變化有一定影響 不同產(chǎn)地丹參藥效組分的變化特點體現(xiàn)了中藥內(nèi)在品質(zhì)形成與產(chǎn)地生態(tài)因素的相關(guān)性。山西運城丹參總浸出物含量較高，但各藥效組分含量較低，可能是樣品受當(dāng)?shù)囟竞渖傺杭練鉁囟嘧?、干燥，夏季高溫高濕，秋季多陰雨的氣候條件影響。河北安國、河南焦作兩產(chǎn)地樣品丹酚酸類成分含量較高，但丹參酮ⅡA 類成分含量低于藥典標(biāo)準(zhǔn)，與兩地樣品均為春季采收可能不是丹參的最佳采收期有關(guān)。四川綿陽所產(chǎn)丹參質(zhì)量不符合藥典標(biāo)準(zhǔn)，可能是樣品產(chǎn)地受北亞熱帶山地濕潤季風(fēng)氣候影響（溫濕適宜、降雨充沛）。此外，綿陽樣品與中江樣品外觀形態(tài)明顯不同，推測與栽培管理及引種品種相關(guān)。

結(jié)合藥材外觀性狀來看，丹參藥效組分含量可能與丹參藥材外觀性狀有一定關(guān)聯(lián)性，具體表現(xiàn)為：1）丹參根條越少或主根越粗（河南焦作、河北安國、四川中江、山西運城丹參樣品）丹參酚酸類成分含量較高；丹參根條越多或主根越細（山東臨沂、陜西商洛、山東夏津、河南方城、陜西寶雞、天津靜海、天津北辰丹參樣品）丹參酮ⅡA 類成分含量較高；2）丹參根條表面越紅（山東臨沂、陜西商洛、河南方城丹參）丹參酮ⅡA 類成分含量較高。丹參根部從上至下水溶性成分含量呈降低趨勢，脂溶性成分含量呈升高趨勢，水溶性成分上部含量較高，脂溶性成分下部含量較高。丹參根部越紅其藥效組分含量越高，顏色變化對丹參脂溶性成分含量變化的影響遠大于水溶性成分。分析其原因，丹參酚酸類和丹參酮類可能是丹參生長受到脅迫后而產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，其對丹參維持細胞穩(wěn)態(tài)、對抗環(huán)境變化具有重要意義。丹參酚酸類作為水溶性成分在導(dǎo)管中轉(zhuǎn)運，所以木質(zhì)部中含量較高，而丹參酮類作為脂溶性成分，在韌皮部中輸送較多，并向表皮細胞轉(zhuǎn)移，增加細胞質(zhì)的濃度來對抗干旱、鹽脅迫等造成的水分散失，結(jié)果皮部含量較高。對于粗壯、分支少的丹參其木質(zhì)部占比較大，丹參酚酸類成分含量較高，而分支多的丹參其根條相對較細，皮部占比大，導(dǎo)致丹參酮類成分含量較高。

5.3 丹參異地引種栽培具可行性，但品質(zhì)形成機制有待進一步研究 除山東臨沂、陜西商洛、四川中江、河南方城丹參各藥效組分累積量較高外，陜西寶雞、山東夏津、天津北辰及靜海丹參也具有了優(yōu)質(zhì)丹參的一些特點，其丹參酮ⅡA 類、丹酚酸B 含量均高于藥典標(biāo)準(zhǔn)，說明丹參異地栽培具有可行性。丹參品質(zhì)形成除了與產(chǎn)地氣候環(huán)境相關(guān)，種源、栽培管理、初加工也是重要影響因素，關(guān)于丹參內(nèi)在品質(zhì)形成機制還有待深入研究。

丹參在中國分布較廣，引種地區(qū)較多，本研究收集樣品因產(chǎn)地及批次有限，考察結(jié)果存在一定的局限性，有待今后進一步補充、完善。