周雅婷，劉 穎，畢亞男，袁曉美，宋 蕾，3，周 昆，3

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，天津 301617；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，呼和浩特 010018；3.天津市中藥藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 301617）

骨質(zhì)疏松癥（OP）表現(xiàn)為骨量減少、骨的微觀結(jié)構(gòu)退化，并且骨的脆性增加及易于發(fā)生骨折[1]，是最常見(jiàn)的骨骼疾病之一。近10 年來(lái)，中國(guó)患骨質(zhì)疏松的中老年人數(shù)逐年增多，約占總?cè)丝跀?shù)的23%，已居世界首位[2-3]。作為嚴(yán)重威脅中老年人健康的常見(jiàn)骨病，骨質(zhì)疏松的防治已成為社會(huì)關(guān)注和科學(xué)研究的焦點(diǎn)之一。

淫羊藿性溫，味甘、辛，具有祛風(fēng)除濕，補(bǔ)腎壯陽(yáng)的功效，主要治療腎陽(yáng)不足、風(fēng)濕痹痛和骨痿?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，淫羊藿能夠提高免疫力、增強(qiáng)性功能、抗腫瘤、降血糖、抗炎、治療骨質(zhì)疏松等[4]。淫羊藿總黃酮是淫羊藿屬植物中的主要活性成分[5]，其有效成分主要使用水提、醇提等方法提取，提取后剩余藥渣部分往往被丟棄。本研究針對(duì)淫羊藿水提后剩余藥渣部分的藥效展開(kāi)研究，并與水提物藥效進(jìn)行比較，考察水提后剩余的藥渣對(duì)于雌性大鼠骨質(zhì)疏松的療效，為淫羊藿水提取后藥渣的再利用、提高藥材利用率提供一定的實(shí)驗(yàn)研究基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí)雌性SD 大鼠60 只，體質(zhì)量190～210 g，由北京華阜康生物科技有限公司提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（京）2014-0004。動(dòng)物飼養(yǎng)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所，飼養(yǎng)溫度20～25 ℃，濕度40%～60%，自然光照，所用飼料為天津市華榮實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司生產(chǎn)全價(jià)顆粒飼料，飲用自來(lái)水。

1.2 受試藥物 淫羊藿藥材，購(gòu)自河北春開(kāi)制藥股份有限公司，批號(hào)160501423，產(chǎn)地為四川，鑒定為箭葉淫羊藿。

淫羊藿水提物及藥渣均由天津藥物研究院許浚副研究員團(tuán)隊(duì)制備提供。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，投料6 kg 淫羊藿藥材，先用11 倍水煎煮1 h、再用8 倍水煎煮1 h，水提物噴霧干燥獲得水提物粉末800 g。水提后的剩余部分曬干，獲得藥渣4.8 kg，藥渣經(jīng)粉碎后過(guò)150 目篩備用。經(jīng)測(cè)定，每克水提物中含淫羊藿苷97.28 mg、寶藿苷19.46 mg；每克藥渣中含淫羊藿苷7.45 mg、寶藿苷9.12 mg。

1.3 試劑和儀器 骨鈣素（OC）、Ⅰ型膠原N 端前肽（P1NP）、Ⅰ型前膠原交聯(lián)C 末端肽（CTX1）ELSIA試劑盒，均為USCN 產(chǎn)品；谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、血清總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）和葡萄糖（GLU）全自動(dòng)生化儀試劑盒，購(gòu)自北京中生北控生物科技股份有限公司；水合氯醛，分析純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所產(chǎn)品；注射用青霉素納，中諾藥業(yè)（石家莊）有限公司產(chǎn)品；氯化鈉注射液，安徽雙鶴藥業(yè)責(zé)任有限公司產(chǎn)品；甲醛溶液，分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司產(chǎn)品。

AE200S 電子分析天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）、Micro 17 R 高速離心機(jī)（美國(guó)，Thermo）、WK-200B 小型高速粉碎機(jī)（青州市富爾康制藥機(jī)械有限公司）、VivaCT 40 骨密度儀（瑞士，SCANCO Medical AG）、7020 全自動(dòng)生化儀（日本，Hitachi）、InfiniteM200 多 功 能 讀 板 儀（瑞 士，TECAN）。

2 方法

2.1 模型制備 雌性SD 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)30 d后，隨機(jī)選取50 只，腹腔注射10%水合氯醛溶液（0.6 mL/100 g）麻醉，行雙側(cè)卵巢摘除手術(shù)，術(shù)后消毒并連續(xù)2 d 腹腔注射8 萬(wàn)單位青霉素。

2.2 分組及給藥 造模12 周后，將剩余10 只未去勢(shì)雌鼠作為對(duì)照組，將50 只去勢(shì)大鼠隨機(jī)分為模型組、水提物1 g/kg 組（以生藥量計(jì)，下同）、水提物0.5 g/kg 組、藥渣1 g/kg 組、藥渣0.5 g/kg 組，每組10 只，組間大鼠體質(zhì)量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。各組大鼠按照1 mL/100 g 灌胃給藥，每日1 次，連續(xù)灌胃8 周，對(duì)照組及模型組給予相應(yīng)體積的飲用水。每日觀察大鼠的精神狀態(tài)及采食飲水等生活狀況，每周稱質(zhì)量并記錄。

2.3 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采集

2.3.1 血液樣本的收集與處理 最后1 次給藥結(jié)束后，用10%水合氯醛溶液麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取血，3 500 r/min 離心10 min，吸取血清分裝于1.5 mL離心管中，使用7020 全自動(dòng)生化儀檢測(cè)血清中AST、ALT、TC、TG 和GLU 含量，并用ELISA 試劑盒測(cè)定OC、CTX1、P1NP 含量。

2.3.2 脛骨的分離與處理 分離左側(cè)脛骨，剔凈附著于脛骨上的肌肉及結(jié)締組織，采用10%甲醛溶液固定，并置于透明離心管中備用。采用VivaCT 40 對(duì)左側(cè)脛骨進(jìn)行CT 掃描，然后利用軟件Scanco Medical version 6.0 對(duì)脛骨的總體積（TV）、骨體積（BV）、骨表面積（BS）、骨小梁數(shù)量（Tb.N）、骨小梁厚度（Tb.Th）和骨小梁分離度（Tb.Sp）進(jìn)行分析。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠體質(zhì)量、肝系數(shù)、腎系數(shù)和子宮系數(shù)的測(cè)定 與對(duì)照組相比較，模型組大鼠的體質(zhì)量、腎質(zhì)量、子宮質(zhì)量、肝系數(shù)、腎系數(shù)和子宮系數(shù)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05 或P＜0.01）。與模型組相比，水提物0.5 g/kg 組和藥渣0.5 g/kg 組的肝臟質(zhì)量有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）；水提物0.5 g/kg 組的腎臟質(zhì)量顯著降低（P＜0.05），體重、子宮質(zhì)量及臟器系數(shù)雖有變化但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），見(jiàn)表1。

3.2 血清生化的測(cè)定 模型組大鼠的血清CTX1含量較對(duì)照組顯著降低（P<0.05），給予水提物0.5 g/kg 治療后血清CTX1 顯著升高（P＜0.05）；模型組的OC 和PINP 的水平有所升高但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），淫羊藿水提物和藥渣干預(yù)后可使其水平降低，見(jiàn)表2。血清生化標(biāo)志物檢測(cè)結(jié)果顯示，相比模型組，1.0 g/kg 和0.5 g/kg 劑量水提物及1.0 g/kg 藥渣組的ALT 含量均明顯升高（P＜0.05），0.5 g/kg 藥渣組的ALT 含量有所升高，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。各給藥組的TC 與TG 含量均比模型組升高（P＜0.05或P<0.01），AST 和GLU 含量變化未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），但有升高趨勢(shì)，見(jiàn)表3。

表1 淫羊藿給藥8 周對(duì)各組大鼠體質(zhì)量、臟器及其系數(shù)的影響（）

表1 淫羊藿給藥8 周對(duì)各組大鼠體質(zhì)量、臟器及其系數(shù)的影響（）

注：與對(duì)照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別 劑量（g 生藥/kg） n 體質(zhì)量（g） 肝質(zhì)量（g） 腎質(zhì)量（g） 子宮質(zhì)量（g） 肝系數(shù) 腎系數(shù) 子宮系數(shù)對(duì)照組 — 10 344.60±35.01 8.08±0.71 2.09± 0.13 0.57±0.06 2.354±0.14 0.61±0.07 0.17±0.02模型組 — 10 401.60±37.76# 7.90±0.71 1.88±0.20# 0.23±0.20## 1.98±0.21## 0.47±0.07## 0.06±0.06##水提物 0.5 10 384.40±34.60 6.97±0.67* 1.72±0.07* 0.20±0.02 1.81±0.09 0.45±0.04 0.05±0.01水提物 1.0 10 388.92±39.98 7.31±0.88 1.78±0.15 0.22±0.10 1.88±0.16 0.46±0.05 0.06±0.03藥渣 0.5 10 387.11±23.87 6.99±0.45* 1.75±0.11 0.16±0.03 1.81±0.09 0.45±0.03 0.04±0.01藥渣 1.0 10 394.13±35.26 7.41±0.72 1.82±0.12 0.27±0.17 1.89±0.23 0.46±0.04 0.07±0.05

表2 淫羊藿給藥8 周后各組大鼠血清中OC、CTX1、P1NP含量（）

表2 淫羊藿給藥8 周后各組大鼠血清中OC、CTX1、P1NP含量（）

注：與對(duì)照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別 劑量（g 生藥/kg） n OC（pg/mL）CTX1（pg/mL）P1NP（pg/mL）對(duì)照組 — 10 78.3±3.1 1092.2±53.0 1296.4±232.4模型組 — 10 90.9±7.8 839.1±98.8# 1306.6±187.9水提物 0.5 10 86.6±4.1 1241.1±61.8* 1296.5±426.1水提物 1.0 10 83.8±3.1 931.9±54.8 948.2±168.2藥渣 0.5 10 88.9±4.6 867.1±57.8 944.0± 77.4藥渣 1.0 10 88.1±5.3 900.7±66.3 918.8±162.8

3.3 脛骨骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)的測(cè)定 圖1 可見(jiàn)，模型組的TV、BV、BS 和Tb.N 較對(duì)照組顯著降低（P＜0.05 或P＜0.01），同時(shí)Tb.Th 和Tb.Sp 顯著升高（P＜0.01）。給予不同劑量的水提物和藥渣后，各給藥組的TV、BS 均比模型組顯著升高（P＜0.05 或P＜0.01），且BS 的分析結(jié)果顯示，0.5 g/kg 藥渣的改善效果優(yōu)于0.5 g/kg 水提物組（P＜0.01）。1.0 g/kg 劑量水提物及1.0 g/kg 和0.5 g/kg 劑量藥渣可明顯升高Tb.N 同時(shí)降低Tb.Th（P<0.05 或P<0.01），且0.5 g/kg 藥渣的效果優(yōu)于0.5 g/kg 水提物組（P<0.01）。此外，1.0 g/kg藥渣可顯著升高BV 值同時(shí)降低Tb.Sp 值（P<0.05）。

表3 淫羊藿給藥8 周后各組大鼠血清ALT、AST、TC、TG 和GLU 含量（）

表3 淫羊藿給藥8 周后各組大鼠血清ALT、AST、TC、TG 和GLU 含量（）

注：與對(duì)照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別 劑量（g 生藥/kg） n ALT（pg/mL） AST（pg/mL） TC（pg/mL） TG（pg/mL） GLU（pg/mL）對(duì)照組 — 10 15.90±9.64 77.90±14.63 1.22±0.24 0.52±0.23 7.18±1.69模型組 — 10 13.44±9.32 78.33±19.33 1.11±0.36 0.36±0.09 5.86±1.01水提物 0.5 10 25.20±7.68* 87.40±23.95 1.91±0.48** 0.51±0.13* 5.57±0.81水提物 1.0 10 22.00±6.35* 94.09±12.63 1.82±0.28** 0.49±0.09** 6.75±1.14藥渣 0.5 10 21.67±9.96 92.56±16.70 1.68±0.19** 0.48±0.09* 6.14±1.02藥渣 1.0 10 20.93±7.10* 85.20±18.89 1.54±0.44* 0.55±0.17** 6.25±1.66

圖1 淫羊藿給藥8 周對(duì)各組大鼠脛骨骨微結(jié)構(gòu)的影響

4 討論

本研究采用的去勢(shì)法是應(yīng)用廣泛的模擬絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松骨代謝的動(dòng)物模型[6]，相較于對(duì)照組，造模后去勢(shì)雌鼠的子宮指數(shù)有顯著的下降，其原因在于去勢(shì)后大鼠的雌激素水平降低導(dǎo)致子宮產(chǎn)生萎縮，該現(xiàn)象與文獻(xiàn)報(bào)道相符[7]，淫羊藿給藥各組子宮系數(shù)并未見(jiàn)明顯恢復(fù)，提示淫羊藿對(duì)骨質(zhì)疏松的治療作用也許并不依賴于雌激素樣作用。

血清中生化指標(biāo)可較為靈敏地反映骨質(zhì)疏松癥骨代謝情況，并先于骨密度的變化[8]，本研究中與對(duì)照組相比，血清PINP 和OC 水平有升高趨勢(shì)、但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而骨吸收標(biāo)志物CTX1 明顯降低，與通常認(rèn)為絕經(jīng)后雌激素缺乏導(dǎo)致女性骨轉(zhuǎn)換加速、骨吸收超過(guò)骨形成而導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的觀點(diǎn)有所不同，這也可能與動(dòng)物本身個(gè)體差異以及其所處骨質(zhì)疏松階段的不同有關(guān)，同時(shí)也有一些研究顯示大鼠血清相關(guān)指標(biāo)未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[9-10]。但總的來(lái)說(shuō)，淫羊藿水提物/藥渣可使去勢(shì)動(dòng)物血清OC、P1NP、CTX1 向?qū)φ战M動(dòng)物的正常水平進(jìn)行調(diào)節(jié)。

骨形態(tài)計(jì)量學(xué)指標(biāo)既能直觀反應(yīng)骨組織結(jié)構(gòu)的好壞，又能客觀反應(yīng)骨代謝情況的變化[11]，本研究主要檢測(cè)脛骨的TV、BV、BS、Tb.N、Tb.Th 和Tb.Sp。骨形態(tài)計(jì)量學(xué)數(shù)據(jù)顯示雙側(cè)卵巢切除后12 周，與對(duì)照組比較，模型組脛骨的TV、BV、BS 和Tb.N 均顯著下降，同時(shí)Tb.Th 和Tb.Sp 均顯著上升，證實(shí)造模成功。給藥后各項(xiàng)指標(biāo)均有所改善，表明淫羊藿水提物和藥渣可明顯改善骨微結(jié)構(gòu)；且就BS、Tb.N、Tb.Th 和Tb.Sp 的改善效果來(lái)看，0.5 g/kg 藥渣的效果優(yōu)于0.5 g/kg 水提物。

鑒于近年來(lái)對(duì)中藥安全性的關(guān)注，同時(shí)也因?yàn)橛形墨I(xiàn)提及淫羊藿的肝毒性問(wèn)題[12]，本實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行了更多的血清生化指標(biāo)檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)去勢(shì)雌性大鼠連續(xù)使用淫羊藿水提物/藥渣2 個(gè)月后，ALT 和AST 均有所升高，且在1.0 g/kg 和0.5 g/kg 劑量水提物以及1.0 g/kg 藥渣干預(yù)下ALT 水平變化顯著，而在雄性去勢(shì)動(dòng)物上并未發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象[13]，提示長(zhǎng)期使用淫羊藿可能對(duì)雌激素缺乏大鼠的肝功能造成影響，但ALT 和AST 升高幅度并不高、而肝臟系數(shù)也未見(jiàn)明顯升高或降低，因此這種ALT 水平的升高是否與淫羊藿引起肝臟損害有關(guān)，尚待進(jìn)一步研究確認(rèn)。

由于醇提取對(duì)各種成分的轉(zhuǎn)移率明顯高于水提取，本研究提示在中成藥生產(chǎn)工藝中，可以考慮更多的采用醇提代替水提，可能更有利于發(fā)揮藥效。藥渣是中藥及中成藥經(jīng)過(guò)既定提取方式提取后的剩余物，按照常規(guī)會(huì)作為廢棄物進(jìn)行處理。近年來(lái)，中藥渣的循環(huán)再利用引起了重視，相關(guān)研究主要集中在中藥渣堆肥育苗、栽培食用菌、做動(dòng)物飼料、生產(chǎn)沼氣等方面[14]。實(shí)際上，在實(shí)際提取中，由于提取工藝和有效成分轉(zhuǎn)移效率的原因，藥渣也可能具有藥效作用。藥典中淫羊藿藥材推薦用量為6～10 g，折合大鼠用量約為0.54～0.90 g/kg，本研究結(jié)果證明了淫羊藿藥渣1.0 g/kg 和0.5 g/kg 劑量對(duì)去勢(shì)造成的雌性大鼠骨質(zhì)疏松有一定療效，總體治療效果不低于水提物，且對(duì)BS、Tb.N、Tb.Th 和Tb.Sp 的改善效果優(yōu)于同等劑量水提物組。這提示，常規(guī)水提取后的藥渣有再利用價(jià)值，不應(yīng)直接作為工業(yè)廢棄物處理，應(yīng)進(jìn)一步研究其作用和再利用方式，例如，從淫羊藿藥渣中提取單體活性成分等。