張 巍，邵明亮，苗同國(guó)，侯桂英，戴二黑

（石家莊市第五醫(yī)院研究所，石家莊 050021）

非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD）目前是全球范圍內(nèi)重要的公共健康問(wèn)題。研究顯示，亞洲人中脂肪性肝病的發(fā)病率約為總?cè)丝跀?shù)量的四分之一[1]。中國(guó)NAFLD 的發(fā)病率逐年增高，已成為僅次于病毒性肝炎威脅人類健康的第二大肝病。過(guò)度肥胖、高脂血癥、高血壓或糖尿病，伴發(fā)其他慢性肝炎的NAFLD 患者，肝細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)脂肪堆積，可能會(huì)進(jìn)一步發(fā)展為肝纖維化，轉(zhuǎn)變?yōu)椴豢赡娴母斡不?，甚至肝癌。早期的診斷治療，生活方式干預(yù)是逆轉(zhuǎn)NAFLD 的首要選擇[2]。NAFLD 發(fā)生和發(fā)展的與營(yíng)養(yǎng)分解代謝和脂質(zhì)生物循環(huán)有關(guān)，因此在此過(guò)程中主要的代謝基因、蛋白引起重點(diǎn)關(guān)注。線粒體ATP 酶（ATPase）具有調(diào)節(jié)離子平衡功能，是線粒體呼吸鏈功能損傷的重要標(biāo)志物，ATPase 上調(diào)誘發(fā)線粒體DNA（mtDNA）異構(gòu)，為細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷中關(guān)鍵環(huán)節(jié)。磷酸肌醇3-激酶（PI3K）廣泛存在的脂質(zhì)激酶，并控制細(xì)胞存活、增殖、蛋白質(zhì)合成、運(yùn)輸?shù)男盘?hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)多種細(xì)胞過(guò)程，與細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡、遷移、代謝、腫瘤增殖等發(fā)生密切相關(guān)。ATP 以劑量和時(shí)間依賴性方式刺激PI3K 的磷酸化[3]。腺苷磷酸酶相關(guān)蛋白激酶（Ark）為腺苷單磷酸激活蛋白激酶（AMP）家族成員蛋白激酶（Akt）的下游因子，依賴Akt 的磷酸化過(guò)程而激活，為細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)缺乏條件下Akt 的底物，介導(dǎo)細(xì)胞的存活、增殖和分化。中醫(yī)藥治療脂肪性肝病所具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)已為臨床熟知，但是以分子靶向?yàn)橹笇?dǎo)的藥物治療機(jī)制還未闡明。本次研究擬探討ATPase 與hs-CRP 是否協(xié)同參與肝細(xì)胞損傷氧化應(yīng)激反應(yīng)，并對(duì)清熱利濕方調(diào)節(jié)肝細(xì)胞脂肪變作用與ATPase、hs-CRP、PI3K/Ark 信號(hào)通路表達(dá)關(guān)系進(jìn)一步探討，以期為脂肪肝的辨證施治提供基礎(chǔ)理論支持。

1 研究對(duì)象

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造模 選取SD 大鼠60 只，雌性，12 周齡，體質(zhì)量200～250 g，（許可證號(hào)150117）。隨機(jī)數(shù)字表法分為6 組，高脂模型組10 只、多烯磷脂酰膽堿組10 只、清熱利濕方（高、中、低）劑量組各10 只、正常對(duì)照組10 只適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周。

大鼠脂肪肝實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型采用高脂飼料（基礎(chǔ)飼料+2%膽固醇、10%豬油）喂養(yǎng)6 周。6 周開(kāi)始清熱利濕組灌胃，分成高、中、低劑量分別給予給予0.3 g/（100 g·d），0.1 g/（100 g·d），0.05 g/（100 g·d）。多烯組給予25 mg/（100 g·d）灌胃12 周后取材。隔夜禁食，腹腔戊巴比妥麻醉，心臟采血，低速離心制備血清。處死大鼠后取出各組肝臟，留做病理評(píng)分部分肝臟10%甲醛固定，其余置-80 ℃冰箱冷凍。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 清熱利濕方主要成分為青黛、郁金、生山楂、澤瀉、決明子、茵陳蒿等均購(gòu)自河北省樂(lè)仁堂醫(yī)藥有限公司，經(jīng)藥師鑒定后使用。將原藥加雙蒸水充分浸泡，在煎藥機(jī)中熬制，配制成41.667 g/L 的溶液備用，冀藥制字：Z20051051。超敏急性時(shí)相反應(yīng)蛋白（hs-CRP）、ATPase ELISA 試劑盒，PI3K，Ark 多克隆抗體購(gòu)自博士德生物工程有限公司。

2 研究方法

2.1 脂肪肝組織病理判斷標(biāo)準(zhǔn) 取肝左葉同一部位組織修整后固定、脫水、包埋、制作病理切片。NAFLD 的病理學(xué)診斷按照NAFLD 活動(dòng)度積分（NAS）評(píng)分。1）NAS 為半定量評(píng)分系統(tǒng)規(guī)定，肝細(xì)胞脂肪變（F）：0 分（＜5%）；1 分（5%～33%）；2 分（34%～66%）；3 分（＞66%）。2）小葉內(nèi)炎癥（20 倍鏡計(jì)數(shù)壞死灶）：0 分，無(wú)；1 分（＜2 個(gè)）；2 分（2～4 個(gè)）；3 分（＞4 個(gè)）。3）肝細(xì)胞氣球樣變：0 分，無(wú)；1 分，少見(jiàn)；2 分，多見(jiàn)。

2.2 血清hs-CRP，ATPase 表達(dá)觀察 取離心后血清1 mL，觀察各實(shí)驗(yàn)組大鼠血清hs-CRP 及ATPase活性，按ELISA 試劑盒說(shuō)明分別檢測(cè)。各實(shí)驗(yàn)組血脂、肝功能比較采用自動(dòng)化分析儀檢測(cè)甘油三脂（TG），膽固醇（TC）及肝功能（ALT/AST/GGT）判斷脂肪肝細(xì)胞炎癥活動(dòng)程度。

2.3 Western blot 檢測(cè)脂肪肝細(xì)胞PI3K/Ark 取肝組織5 g 加入磷酸鹽緩沖溶液（PBS）漂洗勻漿迅速碾磨。加入組織裂解液RIPA 約500 μL，冰上作用20～30 min，4 ℃離心，12 000 r/min 離心15 min。吸取2 μL 的上清，測(cè)定蛋白濃度。其余上清與蛋白（4∶1 的比例）加入緩沖液，瞬時(shí)離心放入-20 ℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

SDS-聚丙烯酰胺凝膠加入20 μg 蛋白樣品，濃縮膠電泳（恒流28 mA，約1 h）。分離膠電泳15 V/cm（100/120 V）指示劑至分離膠底部時(shí)完畢。在轉(zhuǎn)膜緩沖液中將裁下的凝膠、NC 膜浸泡10 min，從負(fù)極到正極按照順序?qū)⒗w維帕、3 塊濾紙、PAGE 膠、膜、3 塊濾紙逐層鋪好，并且加轉(zhuǎn)膜緩沖液，轉(zhuǎn)膜（100 V/200 mA）1 h。封閉液封閉1 h。一抗（PI3K）/Ark）4 ℃過(guò)夜。滴加1×三乙醇胺緩沖溶液（TBS）稀釋的HRP 二抗（1∶800），37 ℃，1 h 后ECL 發(fā)光顯色。

數(shù)據(jù)處理通過(guò)伯樂(lè)凝膠成像系統(tǒng)Gel Doc XR+Image tool 圖像分析軟件讀取目的條帶上測(cè)得的激光光密度掃描值，以各組β-actin 條帶的掃描值標(biāo)化其相應(yīng)蛋白表達(dá)量。

3 統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件統(tǒng)計(jì)處理。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間兩兩比較若方差齊采用LSD 法，若方差齊采用Duunett's T3 法。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 常規(guī)病理檢查結(jié)果比較 12 周模型組常規(guī)蘇森精-伊紅（HE）染色，低倍光鏡下觀察以脂變細(xì)胞占肝小葉的1/2～2/3 或2/3 以上，細(xì)胞增大或腫脹，胞漿內(nèi)充滿脂滴空泡，肝竇狹窄、極度狹窄甚至閉塞，為造模成功。從低倍鏡下模型組觀察發(fā)現(xiàn)，高脂模型組肝細(xì)胞呈現(xiàn)腫脹，氣球樣變，伴有中度脂肪變性，呈現(xiàn)脂肪變改變。按照脂肪肝程度評(píng)分（F），高脂模型組（5.30±0.14）分，對(duì)照組0 分，多烯磷脂酰膽堿組（2.51±0.13）分，清熱利濕低劑量組（4.30±0.51）分，清熱利濕中劑量組（3.61±0.73）分，清熱利濕高劑量組（2.17±0.15）分。經(jīng)多烯磷脂酰膽堿、清熱利濕方治療，脂肪性變性程度下降，肝細(xì)胞脂肪變?cè)u(píng)分明顯改善，見(jiàn)圖1。

4.2 清熱利濕方對(duì)各組肝功能/血脂調(diào)節(jié)效果 從圖2 可見(jiàn)模型組轉(zhuǎn)氨酶（ALT）TC 的改變具有相關(guān)性（Y=0.026 4X+1.699 4），谷氨酰轉(zhuǎn)移酶（GGT）與TG 具有相關(guān)性（Y=0.102X-1.351 2）。表1 可見(jiàn)，清熱利濕可以有效減低ALT、TC、TG 水平，顯著改善肝功能。其中清熱利濕高劑量組與高脂模型組ALT、TC、TG 比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。清熱利濕中劑量組與模型組谷氨酰轉(zhuǎn)移酶（GGT）、TG比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

4.3 肝細(xì)胞脂肪變性與血清hs-CRP，ATP 水平 從表2 中可以發(fā)現(xiàn)，高脂模型組hs-CRP 明顯升高，ATP 顯著下降，hs-CRP 與ATP 水平具有負(fù)相關(guān)（Y=-2.528 7X+29.347）見(jiàn)圖3。高脂模型組hs-CRP與清熱利濕高劑量組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。清熱利濕高劑量組ATP 與高脂模型組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其他組別兩兩比較無(wú)顯著差異。

4.4 清熱利濕方對(duì)各實(shí)驗(yàn)組脂肪肝細(xì)胞PI3K/Ark表達(dá)比較 根據(jù)血清檢測(cè)結(jié)果，選用模型組、多烯組、清熱利濕高劑量組、清熱利濕中劑量組、清熱利濕低劑量組、進(jìn)一步進(jìn)行表達(dá)蛋白印跡實(shí)驗(yàn)。圖4，表3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，對(duì)照組PI3K，Ark 表達(dá)較低，模型組PI3K，Ark 表達(dá)量較高，高劑量組與模型組比較PI3K，Ark 表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 清熱利濕方對(duì)各組脂肪肝細(xì)胞作用觀察（低倍鏡100×）

圖2 脂肪肝大鼠血清肝功能與血脂水平相關(guān)性觀察

表1 清熱利濕方對(duì)各組肝功能/血脂調(diào)節(jié)效果比較（）

表1 清熱利濕方對(duì)各組肝功能/血脂調(diào)節(jié)效果比較（）

注：與模型組比較，*P＜0.05。

組別 n ALT（U/L） AST（U/L） GGT（U/L） TC（mmol/L） TG（mmol/L）清熱利濕低劑量組 10 110.74±5.82 74.60±5.60 56.60±1.00 5.52±0.26 4.69±0.69清熱利濕中劑量組 10 55.00±9.30 68.13±3.55 33.80±0.70* 3.09±0.83 2.23±0.73*清熱利濕高劑量組 10 48.00±5.70* 64.03±3.77 34.70±1.30 2.67±0.93* 1.89±0.46*對(duì)照組 10 34.10±2.15 36.00±1.02 24.15±0.85 2.65±0.93 1.15±0.71模型組 10 164.73±13.58 82.90±5.30 63.50±3.80 5.59±0.91 4.94±0.83多烯組 10 64.12±4.02 72.01±3.12 33.54±0.74 3.25±0.84 2.11±0.51

表2 清熱利濕方對(duì)肝細(xì)胞CRP，ATP 表達(dá)比較（）

表2 清熱利濕方對(duì)肝細(xì)胞CRP，ATP 表達(dá)比較（）

注：與模型組比較，*P＜0.05。

組別 n hs-CRP（mg/L） ATP（mg/L）對(duì)照組 10 3.11±0.10 9.10±1.56清熱利濕低劑量組 10 17.99±1.14 5.40±1.91清熱利濕中劑量組 10 16.10±1.03 6.10±0.73清熱利濕高劑量組 10 10.01±1.02* 8.13±0.92*多烯組 10 16.27±0.73 5.06±1.43模型組 10 21.57±1.44* 2.21±0.49*

圖3 脂肪肝大鼠血清hs-CRP 與ATP 相關(guān)性

圖4 清熱利濕方對(duì)各實(shí)驗(yàn)組PI3K/Ark 表達(dá)比較

表3 清熱利濕方對(duì)各實(shí)驗(yàn)組PI3K/Ark 光密度比較（）

表3 清熱利濕方對(duì)各實(shí)驗(yàn)組PI3K/Ark 光密度比較（）

注：與模型組比較，*P<0.05。

組別 n PI3K/actin Ark/actin多烯組 10 0.306±0.01 0.412±0.01清熱利濕高劑量 10 0.288±0.02* 0.301±0.01*清熱利濕中劑量 10 0.574±0.04 0.433±0.02清熱利濕低劑量 10 0.642±0.01 0.451±0.04模型組 10 0.713±0.01 0.501±0.01對(duì)照組 10 0.212±0.01 0.204±0.01

5 討論

NAFLD 的發(fā)病基礎(chǔ)非常復(fù)雜，主要包括遺傳因素、飲食因素、胰島素抵抗、脂肪因子及炎癥因子參與和腸道激素的改變等因素[4-5]。脂肪肝按照傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)辨證屬于“肥氣”“積證”“痞滿”“脅痛”，本病的主要病機(jī)為本虛標(biāo)實(shí)。本虛主要是肝陰不足，脾腎氣虛；標(biāo)實(shí)主要為痰濁內(nèi)蘊(yùn)夾瘀，致使痰瘀互結(jié)而發(fā)病[6]。誘因往往起于“過(guò)食肥甘厚味”導(dǎo)致慢性營(yíng)養(yǎng)過(guò)剩，久坐不動(dòng)的生活方式促進(jìn)新陳代謝失衡。脾虛濕滯，脾虛則運(yùn)化功能失調(diào)，出現(xiàn)以脾胃健運(yùn)失衡，飲食腐熟不及，脾之清氣不升，胃之濁氣不降，久則損脾礙胃，脾胃之腐熟、運(yùn)化功能進(jìn)一步受損[7]。肝疏泄功能失職，情志亦會(huì)隨之發(fā)生變化，水谷精微輸布失調(diào)，內(nèi)生痰濕，“痰證”“痰濁”“痰癖”痰濕瘀阻互結(jié)，痹阻肝臟脈絡(luò)而形成脂肪肝，壅塞于肝，形成痰血阻滯，日久生熱，濕熱內(nèi)蘊(yùn)，阻滯氣機(jī)運(yùn)行，肝失調(diào)達(dá)，痰濁聚于肝，日久加重則成肝癖，終致“肝壅”“脅痛”等癥[8-9]。

臨床脂肪肝的治療主要是降脂，增加維生素的攝入量和控制飲食脂肪肝的治療還需要兼顧肝臟病變、血脂異常、肥胖、胰島素抵抗以及糖尿病。本院在臨床治療中強(qiáng)調(diào)審證求因，辨證論治，重視去除根本患病因素，研制出清熱利濕方治療脂肪肝。清熱利濕方中選用青黛、茵陳蒿利膽清熱健脾，柴胡疏肝理氣，郁金活血行氣解郁，涼血利膽，茯苓、澤瀉燥濕化痰，各方相互配伍具有清熱祛濕消痰，健脾消積降脂，發(fā)揮益氣活血、祛瘀消痰之功。經(jīng)過(guò)近5 年臨床應(yīng)用觀察，取得肯定的治療效果。

藥理學(xué)研究證實(shí)，青黛粉治療實(shí)驗(yàn)性高脂動(dòng)物，可降低肝中52%TG。青黛所含的豐富的磷脂酰膽堿促進(jìn)肝中脂肪的氧化作用，顯著降TG，阻止TC在肝內(nèi)沉積，降低肝內(nèi)脂質(zhì)含量，發(fā)揮對(duì)實(shí)驗(yàn)性動(dòng)脈粥樣硬化模型性有降脂作用[10]。何首烏主要成分二苯乙烯苷對(duì)過(guò)氧化玉米所致大鼠脂肪肝動(dòng)物模型有效，明顯對(duì)抗肝功能損害，肝中過(guò)氧化脂質(zhì)含量。決明子蛋白質(zhì)和蒽酯苷成分，降低高脂血癥大鼠的TC、TG 和低密度脂蛋白膽固醇（LDL－C）[11]。澤瀉影響內(nèi)源性膽固醇代謝及抑制肝內(nèi)TG 的合成，影響與TC 有關(guān)的酶選擇性抑制外源性TG、TC 的吸收而抑制脂肪肝。由于中醫(yī)病機(jī)把握準(zhǔn)確，治法嚴(yán)謹(jǐn)，遣方用藥合理，臨床觀察中發(fā)現(xiàn)清熱利濕方能促進(jìn)肝臟循環(huán)，抑制外源性膽固醇的吸收，改善肝臟脂肪代謝，達(dá)到治療脂肪肝的目的[12]。

線粒體的能量代謝體系是脂肪性肝病的靶點(diǎn)之一。細(xì)胞內(nèi)線粒體功能是依據(jù)獨(dú)立的DNA 編碼多肽，合成脂類氧化磷酸化系統(tǒng)所需成分，以及細(xì)胞活動(dòng)必須的能量ATP。線粒體對(duì)DNA 損傷的修復(fù)能力弱，很容易被氧化應(yīng)激損傷[13]。NAFLD 模型出現(xiàn)肝細(xì)胞線粒體脂質(zhì)過(guò)氧化和細(xì)胞能量失衡，釋放大量的hs-CRP 及自由基，引起PI3K/Ark 信號(hào)途徑激活，引發(fā)肝臟的細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步激活肝臟星狀細(xì)胞，從而產(chǎn)生肝細(xì)胞的炎癥、壞死、纖維化、氧化應(yīng)激游離原子團(tuán)產(chǎn)生，以至聚集氧化產(chǎn)物清除失衡。肝細(xì)胞中線粒體內(nèi)氧化反應(yīng)率的提高，引起活性氧數(shù)量增加直接導(dǎo)致ATP 酶形態(tài)學(xué)改變，脂肪動(dòng)員障礙，發(fā)生代謝紊亂。脂肪性肝病細(xì)胞中存在巨型線粒體通過(guò)電鏡檢查得以證實(shí)。ATPase 基因編碼ATP 合成酶，ATP 酶復(fù)合物的重要組成部分。細(xì)胞的損害和參與反應(yīng)的活性氧增加導(dǎo)致ATP 的消耗。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示隨著對(duì)大鼠肝細(xì)胞的損傷逐漸加重，大鼠肝細(xì)胞線粒體ATPase 減低。清熱高劑量組與模型組大鼠肝細(xì)胞ATP 表達(dá)存在明顯差異，清熱利濕方治療后，明顯提高表達(dá)水平，說(shuō)明清熱利濕方可以調(diào)節(jié)肝細(xì)胞脂質(zhì)氧化損傷，減低肝細(xì)胞炎癥程度，ATP 合成增強(qiáng)。同時(shí)脂肪肝模型大鼠血清中CRP 呈現(xiàn)異常升高，清熱利濕方治療后炎癥過(guò)氧化損傷明顯緩解。結(jié)果提示清熱利濕方通過(guò)降低過(guò)氧化損傷因子以及提高抗氧化損傷雙向調(diào)節(jié)脂肪肝細(xì)胞的病理狀態(tài)，具有治療作用。

PI3K 信號(hào)通路（胰島素受體底物/磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B，IRS/PI3K/Akt）是胰島素信號(hào)通路中的經(jīng)典通路。已有大量研究表明該信號(hào)通路調(diào)控機(jī)體的營(yíng)養(yǎng)代謝活動(dòng)，促使機(jī)體糖原、脂肪和蛋白質(zhì)的合成[14]。隨著脂肪酸β-氧化的減少脂肪生成增加導(dǎo)致肝細(xì)胞中TG 的積累，其與活性氧水平的增加相結(jié)合，導(dǎo)致脂肪性肝炎患者的胰島素抵抗。線粒體應(yīng)激和損傷促進(jìn)細(xì)胞死亡，肝纖維化，炎癥和對(duì)病毒感染的先天免疫反應(yīng)。肝組織中觀察到超微結(jié)構(gòu)線粒體損傷，線粒體動(dòng)力學(xué)改變，呼吸鏈復(fù)合物活性降低以及合成三磷酸腺苷的能力受損。PI3K/Ark 信號(hào)途徑激活在脂類異常、氧化代謝導(dǎo)致?lián)p傷中發(fā)揮重要作用。PI3K 通路激活引起磷酸化，可以激活線粒體ATP 鉀通道開(kāi)放，減少鈣離子通道開(kāi)放，抑制線粒體Caspase-3 的活化二者協(xié)同作用抑制肝細(xì)胞的凋亡[15]。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，模型組及實(shí)驗(yàn)各組呈現(xiàn)不同程度PI3K/Ark 表達(dá)升高，清熱利濕方治療可以有效改善PI3K/Ark 表達(dá)，抑制肝細(xì)胞炎癥活動(dòng)，與線粒體功能相關(guān)聯(lián)。清熱利濕方通過(guò)調(diào)節(jié)肝細(xì)胞線粒體功能，改善肝細(xì)胞PI3K/Ark 由于脂類代謝異常形成的過(guò)氧化損傷，降低炎性介質(zhì)CRP，促進(jìn)肝細(xì)胞功能的恢復(fù)，具備一定的治療效果。筆者將進(jìn)一步分析清熱利濕方中的有效成分，深入的研究其治療作用機(jī)制，促進(jìn)臨床的應(yīng)用推廣。