李麗瑋 于建 李興龍 鐘寧 嚴賽 楊燕 嚴錢勤 丁在咸 李志強

隨著獸醫(yī)學和實驗動物學的發(fā)展，犬類長期受人類馴化，生長環(huán)境和人類較為相近，加上其體型合適，已成為多種疾病的實驗動物模型廣泛用于生命醫(yī)學研究[1-4]。使用實驗動物模型進行相關研究時，經常會出現(xiàn)因血小板數量或/和功能減少導致的出血，為了延長實驗動物模型觀察期往往需要輸注血小板。由于受到諸多因素限制，實驗犬間即刻輸注新鮮血小板有時很難實現(xiàn)，能否在緊急情況下輸注深低溫保存血小板從而延長實驗犬生存期、以及實驗犬血小板深低溫保存前后相關參數的變化等研究國內外報道甚少。因此，為了明確實驗犬血小板深低溫保存前后變化，筆者選擇比格犬作為實驗動物對象，進行不同濃度二甲亞砜實驗犬血小板深低溫保存前后相關參數變化研究，旨在為實驗犬安全、及時和有效的輸血提供實驗依據。

資料與方法

1 動物來源 雄性比格犬購自上海交通大學農學院實驗實習場，SCXK（滬）2017-0007，皆由上海市第六人民醫(yī)院動物房提供飼養(yǎng)（SPF級，質量合格證號：NO.201705569），實驗動物飼養(yǎng)設施合格證號：SYXK（滬）2016-0020。

2 主要試劑耗材與設備

2.1 試劑：血細胞分析用稀釋液（CELLPACK）（濟南希森美康醫(yī)用電子有限公司，批號：G7164），血細胞分析用溶血劑（STROMATOLYSER-4DL）（希森美康生物科技（無錫）有限公司，批號：R7030），血細胞分析用溶血劑（SULFOLYSER）（SYSMEX CORPORATION，批號：A6001），血細胞分析用染色液（STROMATOLYSER-4DS）（SYSMEX CORPORATION，批號：A7032），清洗液（CELLCLEAN）（SYSMEX CORPORATION，批號：A7001）。血小板糖蛋白-Ib、血小板選擇素、血小板因子-4、β-血小板球蛋白檢測試劑（上海篤瑪生物科技有限公司，批號依次為：180725C、180815B、180810A、180813B）等。

2.2 耗材：一次性使用塑料血袋（上海輸血技術有限公司，注冊證編號：國械注準20153661020，生產許可證號：滬食藥監(jiān)械生產許20000466號），含輸血用1號抗凝液28mL。

2.3 設備：Sysmex自動血液分析儀（日本Sysmex株式會社制造，型號：XE21OO）；酶標儀（瑞士帝肯公司，Infinite F50型）、離心機（湖南湘儀股份有限公司，TG16-W型）等。

3 實驗方法

3.1 血液采集：比格犬16只，應用戊巴比妥鈉麻醉后各放血400 mL至血袋中，每袋200 mL。

3.2 制備冰凍血小板：利用無菌導管連接器將血袋與200 mL轉移袋相連接。將200 mL血袋在（4±2）℃、2500 g離心12 min后，分離出血小板懸液。在無菌條件下，將盛有血小板懸浮液袋置于水平振蕩振蕩儀上輕輕晃動（60-80次/min），同時按2%或5%二甲基亞楓（DMSO）比例使用無菌注射器緩慢注入（1 mL/min）盛有血小板懸浮液袋中，使DMSO與血小板懸液充分混勻后分裝成5袋并標記，將盛有血小板懸浮液袋厚度控制在3-5 cm，平置放于-80℃低溫儲血冰箱內凍存?zhèn)溆谩?/p>

3.3 制備冰凍解凍去甘油紅細胞：將冰凍血小板從-80℃低溫儲血冰箱中取出，立即水平置于42℃水浴中使其快速融化至液體狀態(tài)后取出。

3.4 檢測項目與方法：在冰凍前、冰凍第1天（1 d）、冰凍第35天（35 d）、冰凍第60天（60 d）、冰凍第90天（90 d）、冰凍第180天（180 d）分別進行血小板計數（PLT）、平均血小板體積（MPV）、血小板壓積（PCT）、血小板分布寬度（PDW）、血小板糖蛋白-Ib（GP-Ib）、血小板選擇素（P-Selectin）、血小板因子-4（PF4）、β-血小板球蛋白（β-TG）相關檢測。實驗步驟嚴格按照各檢測項目操作規(guī)程實施。

4 統(tǒng)計學處理 應用SPSS20.0軟件，計量資料以均數±標準差（ ±s） 表示，組內數據比較采用配對t檢驗，組間數據比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 血小板常規(guī)參數變化 2%二甲亞砜組和5%二甲亞砜組冰凍前PLT、PCT分別與冰凍后1 d、35 d、60 d、90 d、180 d比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；而2%二甲亞砜組和5%二甲亞砜組冰凍前MPV、PDW分別與冰凍后1 d、35 d、60 d、90 d、180 d比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。2%二甲亞砜組和5%二甲亞砜組冰凍后1 d、35 d、60 d、90 d、180 d的PLT分別相互間比較差異也均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。2%二甲亞砜組和5%二甲亞砜組冰凍后1d的MPV、PDW、PCT分別與冰凍后35 d、60 d、90 d、180 d比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。2%二甲亞砜組和5%二甲亞砜組冰凍后35 d、60 d、90 d、180 d的MPV、PDW、PCT分別相互比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。2%二甲亞砜組1 d、35 d、60 d、90 d、180 d的PLT、PCV、MPV、PDW分別與5%二甲亞砜組冰凍后1 d、35 d、60 d、90 d、180 d比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表1。

2 血小板生化參數變化 2%二甲亞砜組和5%二甲亞砜組冰凍前GP-Ⅰb、P-Selectin、PF4、β-TG分別與冰凍后1 d比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；而分別與冰凍后35 d、60 d、90 d、180 d比較均有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。2%二甲亞砜組和5%二甲亞砜組冰凍后1 d的GP-Ⅰb、P-Selectin、PF4、β-TG分別與冰凍后35 d、60 d、90 d、180 d比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；冰凍后35 d的GP-Ⅰb、P-Selectin、PF4、β-TG分別與冰凍后60 d、90 d、180 d比較差異均有意義（P＜0.05）。2%二甲亞砜組和5%二甲亞砜組冰凍后60 d GP-Ⅰb、PF4分別與冰凍后90 d、180 d比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；而冰凍后60 d的P-Selectin、β-TG分別與冰凍后90 d、180 d比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。2%二甲亞砜組和5%二甲亞砜組冰凍后90 d的GP-Ⅰb、P-Selectin、PF4、β-TG分別與冰凍后180 d比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。2%二甲亞砜組1 d、35 d、60 d、90 d、180 d的GP-Ⅰb、P-Selectin、PF4、β-TGP分別與5%二甲亞砜組冰凍后1 d、35 d、60 d、90 d、180 d比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表2。

表1 不同濃度二甲亞砜深低溫保存實驗犬血小板常規(guī)參數變化

表2 不同濃度二甲亞砜深低溫保存實驗犬血小板生化參數變化

討 論

為了最大限度提高實驗犬的生存率[5]，及時給實驗犬輸血是一種重要的治療手段。然而，犬間輸血的血源十分匱乏[6-7]，尤其是對血小板數量減少或/和功能低下伴有嚴重出血傾向的實驗犬，是否可像人類一樣在緊急情況時輸注血小板，從而延長其生存期的國內外報道甚少。目前國內對血小板數量減少或/和功能低下伴有嚴重出血傾向患者，通常輸注保存期5天血小板。然而，諸多原因導致我國血小板供需矛盾十分突出。因此，部分嚴重出血患者在無保存期5天血小板前提下，也接受5%二甲亞砜制備冰凍血小板緊急輸注，起到了一定的止血效果，挽救了患者的生命[8-12]。

涉及血小板相關功能與因子參數主要包括：血小板計數（PLT）、平均血小板體積（MPV）、血小板壓積（PCT）、血小板分布寬度（PDW）、血小板糖蛋白-Ib（GP-Ib）、血小板選擇素（P-Selectin）、血小板因子-4（PF4）、β-血小板球蛋白（β-TG）等。其中GP-Ib是膠原、凝血酶、血管性假性血友病因子、纖維蛋白原和二磷酸腺苷等受體的成分，參與血小板黏附、聚集和活化反應，是生理性止血和病理性血栓形成的重要部分。P-Selectin主要分布于血小板α顆粒及內皮細胞的棒狀（Weibel-Palade）小體；當血小板及內皮細胞受到凝血酶、組胺、補體、氧自由基等刺激后迅速與質膜融合而在血小板和內皮細胞表面表達，啟動了血小板與內皮細胞間以及相關細胞與白細胞的相互黏附，也參與血栓形成的病理過程。PF4是由血小板α顆粒合成的一種特異蛋白質，是一種堿性多肽的四聚體；易結合并中和肝素，也易結合于血管內皮細胞表面的硫酸乙酰肝素上，以減慢凝血酶滅活過程，從而促進血栓形成。β-TG是一種血小板特異性球蛋白，在誘導劑刺激下由血小板α顆粒釋放至血漿中，可反映血小板特異的釋放功能。因此，為了進一步明確深低溫保存對實驗犬血小板的影響必須進行相關功能參數研究，為實驗犬安全、及時和有效輸血提供實驗依據。

二甲亞砜（DMSO）是一種重要的滲透型細胞保護劑，能夠降低細胞冰點，在深低溫（-200℃）保存細胞時，能快速穿透細胞膜進入細胞中，降低冰點、延緩凍存過程，同時提高細胞內離子濃度，減少細胞內冰晶的形成和細胞結構紊亂，避免細胞損傷的發(fā)生。因此，DMSO是目前最常用的細胞凍存保護劑。然而，DMSO也存在一定的毒性作用，與蛋白質疏水基團發(fā)生作用可導致蛋白質變性，具有血管毒性和肝腎毒性。6%DMSO于-80℃進行血小板冰凍保存，可使其保質期由7天延長至2年[13]，而該濃度下冷凍后的犬血小板活性有所降低[14]。另外，有研究結果表明，5%DMSO于-80℃進行血小板冰凍保存后，會導致血小板微粒表面受體表型發(fā)生變化，改變其中肌動蛋白、細絲蛋白、原肌球蛋白的表達[15]。因此，本研究在應用常規(guī)5%DMSO進行血小板冰凍保存研究，同時嘗試使用低濃度DMSO（2%）進行犬血小板冰凍保存研究，其目的在于為了盡量避免實驗犬在輸注冰凍血小板后，由于殘留DMSO導致臨床動物試驗各種結果的不確定性。

本研究結果表明應用2%二甲亞砜濃度和5%二甲亞砜濃度分別深低溫保存血小板，其保存前后PLT、PCT、GP-Ⅰb、P-Selectin、PF4、β-TG變化均不明顯（P＞0.05）；而MPV、PDW則有不同程度變化（P＜0.05）。隨著深低溫保存血小板時間的延長，在1-180d內除PLT外MPV、PCT、PDW、GP-Ib、P-Selectin、PF4、β-TG分別均有不同程度增高。筆者認為在180天內應用2%和5%二甲亞砜濃度對實驗犬血小板進行深低溫保存，隨著保存時間的延長，血小板相關因子促凝活性沒有明顯減弱趨勢。另外，2%二甲亞砜濃度進行深低溫保存血小板的PLT、MPV、PCT、PDW、GP-Ib、P-Selectin、PF4、β-TG分別與5%二甲亞砜濃度進行深低溫保存血小板比較無明顯區(qū)別（P＞0.05）。因此，筆者認為為了減少殘留DMSO量導致臨床動物試驗各種結果影響，在遇到實驗犬因血小板因素引起的出血可推薦應用2%二甲亞砜濃度深低溫保存血小板。