肖勇 夏正新 方玉明

膿毒血癥是指由感染引起的全身炎癥反應(yīng)，是嚴重感染、創(chuàng)傷、燒傷、休克、大手術(shù)后常見的并發(fā)癥，死亡率約為30%～70%，是ICU患者死亡的主要原因[1，2]。其中炎性反應(yīng) 、免疫及感染等因素均參與膿毒血癥的發(fā)病機制，近年研究提示機體促炎-抗促炎反應(yīng)平衡穩(wěn)態(tài)的失調(diào)在其中發(fā)揮重要作用[3，4]。越來越多的證據(jù)表明，免疫抑制和功能受損在膿毒血癥的發(fā)生、發(fā)展過程中起作用[5]。相比炎性反應(yīng)的早期，超過80%的膿毒癥患者死于免疫狀態(tài)低下的感染[6]。以上研究均提示免疫抑制狀態(tài)是膿毒癥患者預(yù)后不良的重要因素之一。臨床醫(yī)師以患者病情程度作為治療膿毒血癥的基礎(chǔ)，所以需根據(jù)急性生理和慢性健康評分系統(tǒng)（acute physiologyand chronic health evaluation-II，APACHE-II）判斷患者的病情程度，但APACHE-II需要一定時間，無法實時評價膿毒血癥患者的病情[7]。本項目通過檢測膿毒血癥患者血液中炎性指標（PCT、CRP、 IL-6、IL-10、WBC、NE-UT）及免疫指標（CD4+、CD8+、CD4+/CD8+）的變化，旨在闡明上述指標對患者病情程度的預(yù)測價值。

對象與方法

1 對象 根據(jù)2003年國際膿毒血癥診斷標準招募患者[8]，挑選2015年9月～2017年2月本院重癥監(jiān)護病房住院的膿毒血癥患者54例為研究對象。入組標準：排除腫瘤、嚴重營養(yǎng)不良、糖尿病等影響免疫功能的疾病及過敏體質(zhì)者；年齡為18～80歲。其中女24例，男30例；年齡44～75歲，平均（51.6±4.7）歲；其中包括重癥肺炎29例，其他類型感染25例。根據(jù)分級標準[9]，按照入院時病情將全部膿毒血癥患者分為膿毒性休克組（n=17）、嚴重膿毒血癥組（n=19）、膿毒血癥組（n=18）。各組的年齡及性別等一般資料經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

2 方法

2.1 主要儀器與試劑：人淋巴細胞分離液購自達科為生物工程有限公司。ELISA 試劑盒（IL-6、IL-10）均購自美國美國R＆D 公司，熒光素FITC 標記抗人CD4 /CD8抗體購自eBioscience 公司。

2.2 收集標本及指標檢測：患者入院第1天7∶00～8∶00，抗凝管留取空腹靜脈血5 mL，首先取3 mL血樣于離心管，放于離心機，調(diào)轉(zhuǎn)速 3 000 r/min，離心10 min，收集上層血清，-20℃保存以備后續(xù)實驗。收集余下的2 mL血樣，加入熒光素FITC標記抗人CD4/CD8抗體，采用流式細胞儀檢測患者外周血CD4+、CD8+、CD4+/CD8+比例的變化。其余血標本送往院檢驗科。采用電化學(xué)發(fā)光法對血PCT進行檢測，由羅氏公司和德國柏林B.R.A.H.M.S Diagnostica公司提供試劑盒和儀器。采用全自動生化分析儀（雅培Aeroset）檢測CRP水平，試劑盒由寧波德賽生物科技有限公司提供。采用希斯美康血細胞分析儀檢測NEUT水平，原裝配套試劑，校準液，質(zhì)控液。所有參入者均簽署知情同意書?；颊呷朐?4 h內(nèi)進行APACHE-II評分，包括年齡、急性生理學(xué)及慢性健康評分，分數(shù)為0～71分，分數(shù)高低表示患者病情程度，分數(shù)越高越嚴重。

2.3 檢測外周血清細胞因子采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA） 檢測：上述收集的血清樣本，按照試劑盒說明書，分別將50 μL樣本及標準品依次加入已包被反應(yīng)孔中，然后將50 μL酶聯(lián)親和物依次加入每孔，37℃溫育1 h，棄去孔內(nèi)液體; 用洗滌液反復(fù)沖洗5次，加入底物液顯色，37℃下避光反應(yīng)10～30 min，加入終止液50 μL，酶標儀在450 nm處以空白對照孔調(diào)零后測定吸光度（ A） 值。通過標準曲線計算出IL-6和IL-10的水平。

3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計，計量資料用±s表示，組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗，細胞及炎癥因子與NIHSS得分的相關(guān)性采用Spearman 相關(guān)分析。檢驗水準α=0.05，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各亞組APACHE-Ⅱ評分比較 患者入院24 h 內(nèi)進行APACHE-Ⅱ評分，膿毒血癥組評分為（13.87±1.82），嚴重膿毒血癥組評分為（21.82±1.78），膿毒性休克組評分為（28.33±2.05）分，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=88.29，P＜0.000 1）。見圖1。

2 各亞組膿毒血癥患者炎性指標水平 患者入院第1天，將各亞組血液中炎性指標NEUT、CRP、PCT、IL-6、IL-10、WBC表達水平進行比較，結(jié)果顯示膿毒血癥組、嚴重膿毒血癥組、膿毒性休克組表達水平依次升高，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖2。

3 各亞組膿毒血癥患者細胞免疫功能比較 采用流式細胞儀，檢測各亞組患者CD3+CD4+、CD3+CD8+細胞及CD4+/CD8+比例，結(jié)果提示膿毒血癥組、嚴重膿毒血癥組、膿毒性休克組T細胞亞群依次下調(diào)，比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖3。

4 膿毒血癥患者APACHE-Ⅱ評分與體內(nèi)炎性指標及免疫功能的相關(guān)性分析 Spearman 相關(guān)分析結(jié)果顯示，膿毒血癥患者體內(nèi)炎癥指標（CRP 、PCT、IL-6、IL-10、WBC）與APACHE-Ⅱ評分呈正相關(guān)（r=0.778，0.654，0.685，0.541，0.532，P＜0.05），而免疫功能CD4+、CD8+、CD4+/CD8+與APACHE-Ⅱ評分呈負相關(guān)（r=-0.676，-0.517，-0.612，P＜0.05）。見表1。

討 論

表1 膿液血癥患者血液中炎性指標及免疫功能與APACHE-Ⅱ評分的相關(guān)性分析

目前對膿毒血癥的研究已取得了很大的進展，但發(fā)病機制尚未明確，近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，細胞因子的表達水平在膿毒血癥的發(fā)病及發(fā)展中發(fā)揮重要作用，尤其是炎癥介質(zhì)可能導(dǎo)致患者體內(nèi)炎性反應(yīng)長時間處于高水平狀態(tài)。研究者Bone等[10]最先提出假說-代償性抗炎反應(yīng)綜合征，提示膿毒血癥患者機體發(fā)生了促炎與抗炎機制失調(diào)。而機體免疫功能變化在膿毒癥發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，免疫調(diào)理治療可能是膿毒癥及膿毒癥休克患者的重要治療方法[11]。目前膿毒癥休克仍然具有較高的病死率，是臨床面臨的重大挑戰(zhàn)之一。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)及分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，發(fā)現(xiàn)多種生物標志物在膿毒癥的病情和預(yù)后及療效評估等方面發(fā)揮重要作用[12，13]。因單獨檢測一種生物標志物可能存在敏感性及特異性不高等缺點，可能需要聯(lián)合檢測多種標志物來提高對膿毒癥患者病情及預(yù)后的預(yù)測價值[14]。本研究通過檢測膿毒血癥患者血液中炎性指標（PCT、CRP、IL-6、IL-10、WBC、NEUT）及免疫指標（CD4+、CD8+、CD4+/CD8+）的變化，旨在明確上述指標對對患者病情的預(yù)測價值。

膿毒血癥發(fā)病不同階段，炎癥介質(zhì)種類及表達水平有所不同，在膿毒血癥早期機體呈現(xiàn)以白介素-6（IL-6）為代表的促炎癥介質(zhì)表達水平的增加，作為對抗保護機制，機體隨后啟動抗炎反應(yīng)，以白介素-10（IL-10）為代表，對抗促炎癥介質(zhì)的作用，從而降低失控性爆發(fā)性炎性反應(yīng)，以此來減少對組織的損傷[15]。這是機體自我保護，但過度的抗炎反應(yīng)也可導(dǎo)致免疫功能低下，從而減弱對病原菌的清除，甚至誘導(dǎo)機體呈現(xiàn)“免疫麻痹”狀態(tài)，由此極大增加患者二次感染的風(fēng)險[16，17]，現(xiàn)已明確膿毒癥患者存在T淋巴細胞免疫反應(yīng)低下[18]。C 反應(yīng)蛋白CRP是肝細胞在IL-6 作用下產(chǎn)生的急性時相蛋白，健康人血清CRP濃度很低（＜5 mg /L），但組織損傷、細菌感染或應(yīng)激時其水平明顯升高，且在炎癥早期即顯著升高，是早期反映細菌感染較敏感的指標。PCT 是一種能夠反映感染程度的特異性蛋白質(zhì)，健康人血清濃度一般低于0.1 μg/L，PCT并不直接誘發(fā)膿毒血癥的發(fā)生，但能夠?qū)е虏±砩淼募又豙19，20]。本研究發(fā)現(xiàn)隨著膿毒血癥患者病情加重，血液中CRP 、PCT、IL-6、IL-10、WBC、NEUT 炎癥指標水平依次升高（P＜0.05），而CD3+CD4+、CD3+CD8+細胞及CD4+/CD8+水平依次降低。其中炎癥指標PCT、CRP、IL-6、IL-10、WBC與APACHE-Ⅱ評分呈正相關(guān)（r=0.778，0.654，0.685，0.541，0.532，P＜0.05），而免疫功能CD4+、CD8+、CD4+/CD8+與APACHE-Ⅱ評分呈負相關(guān)（r=-0.676，-0.517，-0.612，P＜0.05）。提示上述炎性指標水平越高，患者病情越嚴重；并且隨著病情的加重，患者存在嚴重的免疫功能抑制，隨之導(dǎo)致免疫麻痹狀態(tài)。

綜上所述，膿毒血癥患者存在促炎/抗炎平衡及免疫功能抑制，隨著病情的加重，患者血液中PCT、CRP、IL-6、IL-10、WBC水平呈高表達，而免疫功能CD4+、CD8+、CD4+/CD8+呈低表達，故在膿毒血癥的臨床診治過程中，臨床醫(yī)師應(yīng)加強對炎性介質(zhì)及免疫功能聯(lián)合動態(tài)監(jiān)測，這樣將有助于指導(dǎo)患者的臨床治療和評判預(yù)后。