管維 蘭時(shí)樂(lè) 詹逸舒 李倩 譚日曉 王璇

摘要?以菜籽餅粕為原料，采用固態(tài)發(fā)酵法研究了單菌和混合菌發(fā)酵對(duì)菜籽餅中抗?fàn)I養(yǎng)因子降解率的影響。通過(guò)單因素試驗(yàn)篩選了菜籽餅發(fā)酵去除抗?fàn)I養(yǎng)因子的菌種及復(fù)合微生物固態(tài)發(fā)酵菜籽餅去除抗?fàn)I養(yǎng)因子的條件。結(jié)果表明，納豆桿菌、側(cè)胞桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、枯草桿菌去除抗?fàn)I養(yǎng)因子的效果比較明顯。最佳條件如下：發(fā)酵時(shí)間為5 d，發(fā)酵溫度為35℃，接種量為6%，發(fā)酵pH為6.5。在此條件下，植酸、纖維素、單寧的降解率最高分別達(dá)到93.74%、36.59%和14.75%。

關(guān)鍵詞?菜籽餅;植酸;纖維素;單寧;發(fā)酵

中圖分類(lèi)號(hào)?S816.6文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼?A

文章編號(hào)?0517-6611（2020）02-0189-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.02.055

開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Study on the Removal Conditions of Anti-nutrients by Rapeseed Meal with Complex Microbe by Solid Fermentation

GUAN Wei1，LAN Shi-le2，ZHAN Yi-shu3 et al?（1.Nanyue District Market Supervision Administration of Hengyang City， Hengyang，Hunan 421900;2.College of Bioscience and Biotechnology，Hunan Agricultural University， Changsha， Hunan 420128;3.Changning Animal Husbandry and Aquatic Affairs Center， Changning， Hunan 421500）

Abstract?The effects of single microbe and mixed microbe fermentation on the degradation rate of anti-nutrients in rapeseed meal were studied by using solid fermentation method， with rapeseed meal as raw materials.Single factor experiment was used to screen out the detoxified strains for removing anti-nutritional factors and the removal conditions of anti-nutritional factors in rapeseed meal.The results showed that the optimal strains were Bacillus natto， Bacillus coagulans，Bacillus laterosporus， Bacillus coagulans andBacillus subtilis.The optimal fermentation conditions were as follows： fermentation time 5 days， fermentation temperature of 35 ℃， inoculum size of 6%，fermentation pH value of 6.5. Under these conditions， the highest degradation rate of phytic acid， cellulose and tannin was 93.74%， 36.59% and 14.75% respectively.

Key words?Rapeseed meal;Phytic acid;Cellulose;Tannin;Fermentation

油菜是我國(guó)重要的油料作物，種植面積和總產(chǎn)量均位居世界第一。菜籽餅的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值與豆餅接近，氨基酸組成接近聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織（FAO）和世界衛(wèi)生組織（WHO）推薦值，是一種優(yōu)良的天然植物蛋白資源。但由于菜籽餅含有硫苷、植酸、纖維素、單寧、芥子堿等抗?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)，因此菜籽餅用作飼料的應(yīng)用受到很大限制[1-3]。筆者通過(guò)以降解限制菜粕飼用的抗?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)——植酸、單寧、纖維素為目標(biāo)，從研究室保藏的菌株中篩選出在菜籽餅粕上生長(zhǎng)能力強(qiáng)、高效降解植酸、單寧、纖維素的菌株;用篩選出的菌株混合發(fā)酵菜籽餅粕，測(cè)定經(jīng)發(fā)酵處理后的菜籽餅粕中各項(xiàng)抗?fàn)I養(yǎng)因子的降解率[4-8]，旨在為混合菌發(fā)酵菜籽餅粕制備益生蛋白飼料提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)參考[9]。在菜粕發(fā)酵單因素優(yōu)化條件研究的基礎(chǔ)上， 探討復(fù)合微生物固態(tài)發(fā)酵菜籽餅粕對(duì)抗?fàn)I養(yǎng)因子的去除條件，探討菜籽餅脫毒的理想發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、發(fā)酵接種量、發(fā)酵pH，并對(duì)其工藝進(jìn)行優(yōu)化，以期獲得最優(yōu)的菜粕固態(tài)發(fā)酵工藝參數(shù)，從而為菜粕的深度開(kāi)發(fā)利用提供技術(shù)支持。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?菌種和菜籽餅粕。

酵母菌、嗜酸乳桿菌、枯草芽孢桿菌、納豆芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、側(cè)胞芽孢桿菌，購(gòu)買(mǎi)于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室;菜籽餅粕購(gòu)買(mǎi)于衡陽(yáng)市南岳區(qū)迎賓市場(chǎng)菜籽榨油坊。

1.1.2?主要儀器與設(shè)備。分光光度計(jì)，型號(hào)V-5000型，為上海元析儀器有限公司產(chǎn)品;恒溫?cái)嚢柩h(huán)水箱，型號(hào)H.H-60，為常州市華普達(dá)教學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品;電子天平，型號(hào)KF3102，為凱豐集團(tuán)有限公司產(chǎn)品;恒溫鼓風(fēng)干燥箱，型號(hào)DHG-9070型，為上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品;恒溫?fù)u床，型號(hào)QYC 2112，為上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品。

1.1.3?主要試劑及培養(yǎng)基。

1.1.3.1?發(fā)酵培養(yǎng)基。菜籽餅粕88.7%;麥麩10%;葡萄糖 1%;磷酸二氫鉀0.2%;七水硫酸鎂 0.1%，固體與水的比例是1∶1。在125 ℃滅菌25 min即可。

1.1.3.2?PDA培養(yǎng)基（不加瓊脂）。馬鈴薯20 g， 葡萄糖 2 g，水100 mL，pH自然。125 ℃下濕熱滅菌25 min。

1.1.3.3?MRS培養(yǎng)基：葡萄糖2.000%，牛肉膏1.000%，蛋白胨1.000%，酵母提取物0.500%，磷酸二氫鉀0.200%，三水醋酸鈉0.200%，檸檬酸氫二銨0.200%，吐溫-80 0.100%，七水硫酸鎂0.058%，pH 6.2～6.4。125 ℃下濕熱滅菌25 min。

1.1.3.4?牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（不加瓊脂）。牛肉膏 3 g，蛋白胨 10 g，氯化鈉 5 g，水1 000 mL，pH 7.0～7.2。125 ℃下濕熱滅菌25 min。

1.2?試驗(yàn)方法

1.2.1?植酸含量的測(cè)定。采用碘量法[10]測(cè)定植酸含量。

1.2.2?纖維素含量的測(cè)定。采用硫代硫酸鈉滴定（碘量法）[11]測(cè)定纖維素含量。

1.2.3?單寧含量的測(cè)定。采用六氰合鐵（Ⅲ）酸亞鐵鉀吸光光度法[12-13]測(cè)定單寧含量。

1.2.4?種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)。

1.2.4.1?種子培養(yǎng)。將保存于斜面上的菌種接種到種子液培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)2 d，備用。

1.2.4.2?發(fā)酵培養(yǎng)。將接種好的種子液按6%（V/W）的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)5 d，50 ℃下烘干粉碎，測(cè)定抗?fàn)I養(yǎng)因子的含量，并按以下公式計(jì)算出其降解率：降解率=發(fā)酵前的含量-發(fā)酵后的含量/發(fā)酵前的含量×100%。

1.2.5?菜籽餅去除抗?fàn)I養(yǎng)因子菌種的篩選。將枯草桿菌、凝結(jié)桿菌、側(cè)胞桿菌、酵母菌、乳酸菌、納豆桿菌的種子液按6%接種發(fā)酵培養(yǎng)基中，35 ℃下培養(yǎng)5 d，50 ℃下烘干粉碎，測(cè)定抗?fàn)I養(yǎng)因子的含量。

1.2.6?復(fù)合菌發(fā)酵條件的研究。

通過(guò)菜籽餅脫毒，篩選出4種菌（枯草桿菌、凝結(jié)桿菌、側(cè)胞桿菌、納豆桿菌）作為復(fù)合菌，發(fā)酵菜籽餅。改變菜籽餅固體發(fā)酵條件，如發(fā)酵溫度、起始pH、接種量及發(fā)酵時(shí)間，考察其對(duì)抗?fàn)I養(yǎng)因子去除的影響。

2?結(jié)果與分析

2.1?單菌固體發(fā)酵菜籽餅對(duì)植酸降解率的影響

在250 mL三角瓶中裝入45 g菜籽餅發(fā)酵培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)含水量為50%，pH 為7.0，37 ℃下靜置培養(yǎng)6 d，每隔1 d搖動(dòng)1次，50 ℃下烘干，測(cè)定植酸含量，并計(jì)算其降解率，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，用不同的微生物發(fā)酵后，菜籽餅中植酸的含量都有所降低，但降低程度各不相同。經(jīng)過(guò)側(cè)胞芽孢桿菌發(fā)酵的菜籽餅，其中植酸的降解率最高（89.22%），說(shuō)明側(cè)胞芽孢桿菌的脫毒效果最為明顯。其次，枯草桿菌、納豆桿菌、凝結(jié)桿菌的脫毒效果較為理想，降解率分別為74.93%、69.74%和79.48%。這可能說(shuō)明這4種菌能產(chǎn)生大量植酸酶，分解了菜籽餅中的植酸。脫毒效果較差的是酵母菌和嗜酸乳桿菌，降解率分別為26.75%和11.56%。

2.2?單菌固體發(fā)酵菜籽餅對(duì)纖維素降解率的影響

在250 mL的三角瓶中裝入45 g菜籽餅發(fā)酵培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)含水量為50%，pH為7.0， 37 ℃下靜置培養(yǎng)6 d，每隔1 d搖動(dòng)1次，50 ℃下烘干，測(cè)定纖維素含量，并計(jì)算其降解率，結(jié)果圖2所示。

由圖2可知，通過(guò)不同的微生物發(fā)酵后，其纖維素含量均有所降低。微生物在發(fā)酵的過(guò)程中產(chǎn)生了纖維素酶，纖維素酶分解了纖維素，將纖維素轉(zhuǎn)化為還原性糖可溶性物質(zhì)，從而降低了其含量。其中，枯草芽孢桿菌對(duì)纖維素的降解率最高（30.75%），去除抗?fàn)I養(yǎng)因子的效果最為明顯。這可能是因?yàn)樵诎l(fā)酵過(guò)程中微生物產(chǎn)生纖維素酶分解了纖維素。納豆桿菌、凝結(jié)桿菌和側(cè)胞桿菌的降解率分別為23.15%、15.32%和15.32%。乳酸菌、酵母菌對(duì)纖維素的降解率較低（7.66%）。

2.3?單菌固體發(fā)酵菜籽餅對(duì)單寧降解率的影響

2.3.1?單寧標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。分別測(cè)得不同單寧濃度下的吸光度，以試劑空白為對(duì)照，以容量瓶中單寧的濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖3所示。

2.3.2?單菌發(fā)酵對(duì)單寧降解率的影響。

在250 mL的三角瓶中裝入45 g菜籽餅發(fā)酵培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)含水量為50%，pH為7.0，37 ℃下靜置培養(yǎng)6 d，每隔1 d搖動(dòng)1次，50 ℃下烘干，測(cè)定單寧含量，并計(jì)算其降解率，結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知，通過(guò)微生物發(fā)酵后，各自菜籽餅中單寧的含量稍有降低，說(shuō)明微生物在發(fā)酵的過(guò)程中產(chǎn)生的單寧酶降解了一部分單寧。其中枯草芽孢桿菌對(duì)單寧的降解率最高（10.62%），對(duì)菜籽餅的脫毒有一定的效果。側(cè)胞桿菌、納豆桿菌、凝結(jié)桿菌對(duì)單寧的降解率分別為7.77%、5.44%和3.89%。酵母菌、乳桿菌對(duì)單寧的降解率最低分別為2.85%和1.55%，說(shuō)明乳桿菌幾乎不降解單寧。

2.4?復(fù)合微生物發(fā)酵條件研究

2.4.1?發(fā)酵時(shí)間的確定。將發(fā)酵培養(yǎng)基置于37 ℃、180 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)。從發(fā)酵第2天開(kāi)始取樣，以后每隔1 d取樣1次，直至第6天終止培養(yǎng)，在50 ℃下烘干粉碎，測(cè)定其抗?fàn)I養(yǎng)因子的含量，并計(jì)算各抗?fàn)I養(yǎng)因子（單寧、植酸、纖維素）的降解率。由圖5可知，發(fā)酵時(shí)間達(dá)到4 d時(shí)，植酸的降解率達(dá)到最高，發(fā)酵天數(shù)為5 d時(shí)單寧、纖維素的降解率達(dá)到最高。發(fā)酵時(shí)間為6、7 d時(shí)，各抗因子的降解率基本保持不變。因此，發(fā)酵5 d是去除抗?fàn)I養(yǎng)因子的最佳條件。

2.4.2?發(fā)酵溫度的確定。

設(shè)計(jì)發(fā)酵溫度為25、30、35、40 ℃，在不同的溫度下發(fā)酵5 d，將采集樣品在50 ℃下烘干粉碎，測(cè)定其抗?fàn)I養(yǎng)因子的含量，并計(jì)算各抗?fàn)I養(yǎng)因子（單寧、植酸、纖維素）的降解率。

由圖6可知，當(dāng)發(fā)酵溫度為25 ℃時(shí)，抗?fàn)I養(yǎng)因子的降解率很低，說(shuō)明溫度低不適合微生物的生長(zhǎng)或影響酶的活性。當(dāng)發(fā)酵溫度為30～35 ℃時(shí)，各抗?fàn)I養(yǎng)因子的降解率達(dá)到最高。當(dāng)發(fā)酵溫度為40 ℃時(shí)，各抗?fàn)I養(yǎng)因子的降解率有所降低，溫度高對(duì)微生物的生長(zhǎng)、酶的活性都有影響。因此，發(fā)酵溫度為35 ℃是去除抗?fàn)I養(yǎng)因子的最佳條件。

2.4.3?接種量的確定。發(fā)酵的接種量設(shè)置為2%、4%、6%、8%和10%，復(fù)合菌組比例為1∶1∶1∶1，35 ℃下發(fā)酵5 d，發(fā)酵后采樣在50 ℃下烘干粉碎，測(cè)定其抗?fàn)I養(yǎng)因子的含量，并計(jì)算各抗?fàn)I養(yǎng)因子（單寧、植酸、纖維素）的降解率。由圖7可知，當(dāng)接種量為2%時(shí)，各抗?fàn)I養(yǎng)因子的降解率幾乎為零，說(shuō)明接種量太少時(shí)微生物的數(shù)量也少。當(dāng)接種量為6%時(shí)，各因子的降解率達(dá)到最高。當(dāng)接種量分別為8%和10%時(shí)，各因子的降解率有所降低，說(shuō)明接種量大，微生物數(shù)量多，供微生物生長(zhǎng)、活動(dòng)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不夠，導(dǎo)致微生物死亡。因此，發(fā)酵接種量為6%是去除抗?fàn)I養(yǎng)因子的最佳條件。

2.4.4?發(fā)酵pH的確定。發(fā)酵的pH設(shè)置為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5和8.0，接種量為6%，復(fù)合菌組內(nèi)比例為1∶1∶1∶1，在35 ℃下發(fā)酵5 d，發(fā)酵后采樣在50 ℃下烘干粉碎，測(cè)定其抗?fàn)I養(yǎng)因子的含量，并計(jì)算單寧、植酸、纖維素的降解率。

由圖8可知，當(dāng)pH為5.5時(shí)，各抗?fàn)I養(yǎng)因子的降解率很

低，說(shuō)明偏酸性不適合微生物的生長(zhǎng)，降低了各種酶的活性。

當(dāng)pH為6.5時(shí)，降解率達(dá)到最高。當(dāng)pH在7.0以上時(shí)，各因子的降解率逐漸降低。這說(shuō)明堿性環(huán)境不適合微生物的生長(zhǎng)與活動(dòng)。因此，發(fā)酵的pH為6.5是去除抗?fàn)I養(yǎng)因子的最佳條件。

3?結(jié)論

該研究對(duì)復(fù)合微生物固態(tài)發(fā)酵菜籽餅粕對(duì)抗?fàn)I養(yǎng)因子的去除條件進(jìn)行研究。從實(shí)驗(yàn)室提供的6種菌（酵母菌 、嗜酸乳桿菌 、枯草芽孢桿菌、納豆芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、側(cè)胞芽孢桿菌）中篩選出對(duì)抗?fàn)I養(yǎng)因子（單寧、植酸、纖維素）降解率較高的4種優(yōu)良菌株（枯草芽孢桿菌、納豆芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、側(cè)胞芽孢桿菌），用4種優(yōu)良菌株復(fù)合微生物來(lái)發(fā)酵菜籽餅粕。研究去除抗?fàn)I養(yǎng)因子的4個(gè)條件因素（發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、發(fā)酵接種量、發(fā)酵pH）。確定其他變量，設(shè)計(jì)單一變量，篩選出每個(gè)變量的最優(yōu)條件。該試驗(yàn)結(jié)果表明，最佳發(fā)酵條件為發(fā)酵時(shí)間為5 d，發(fā)酵溫度為35 ℃，接種量為6%，發(fā)酵pH為6.5。

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