王美垚 馮群

摘要?從轉(zhuǎn)錄組概念、Illumina測序原理及工作流程、Illumina測序技術(shù)中生物信息分析相關(guān)數(shù)據(jù)庫概念等方面，介紹了高通量測序技術(shù)的基本原理，以及該技術(shù)在重要洄游性魚類（鮭魚、鱘魚、刀鱭）研究中的應(yīng)用，旨在為今后更好地開展水生資源修復(fù)奠定理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞?高通量測序;洄游;魚類

中圖分類號?S917.4文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼?A

文章編號?0517-6611（2020）02-0013-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.02.004

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Utilization of High Throughput Sequencing in Major Anadromous Fish Species

WANG Mei-yao1，2，3，F(xiàn)ENG Qun1?（1.Wuxi Fisheries College，Nanjing Agricultural University，Wuxi，Jiangsu 214081;2.Key Laboratory of Freshwater Fisheries and Germplasm Resources Utilization of Agriculture，F(xiàn)reshwater Fisheries Research Center，Chinese Academy of Fishery Sciences，Wuxi，Jiangsu 214081;3.Aquatic Animals Genome Center，F(xiàn)reshwater Fisheries Research Center，Chinese Academy of Fishery Sciences，Wuxi，Jiangsu 214081）

Abstract?This article introduced basic principles of high throughput sequencing and utilizaiton in major anadromous fish species（Oncorhynchus masou，Acipenser sinensis，Coilia ectenes），from transcriptome concepts，Illumina sequencing principle and workflow，database concepts related to bioinformatics analysis in Illumina sequencing technology.This article aimed at laying theoretical foundation for further research on aquatic resource recovery.

Key words?High hroughput sequencing;Anadromous;Fish species

高通量測序技術(shù)，又稱為第二代測序技術(shù)，相比第一代測序技術(shù)，其具有測序速度快、準(zhǔn)確性高、信息量大的顯著特點(diǎn)，可以使研究者在更廣闊又更為深刻的層面上來開展科學(xué)研究[1-2]。洄游性魚類是現(xiàn)今水生資源修復(fù)工作中的重要內(nèi)容，筆者總結(jié)了高通量測序技術(shù)在主要洄游性魚類研究中的應(yīng)用，旨在為今后更好地開展水生資源修復(fù)奠定理論基礎(chǔ)。

1?高通量測序技術(shù)原理

1.1?轉(zhuǎn)錄組概念

轉(zhuǎn)錄組廣義上是指在某一生理狀態(tài)下，機(jī)體內(nèi)特定細(xì)胞內(nèi)全部轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的集合，包括信使RNA以及非編碼RNA如核糖體RNA、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA、小分子RNA等;狹義上是指信使RNA的集合[3-4]。同一細(xì)胞處于不同發(fā)育階段及不同的外界環(huán)境條件下，其基因表達(dá)情況是不同的，因而具有時(shí)間與空間特異性[5]。這也是與具有靜態(tài)特征的基因組學(xué)研究的顯著不同點(diǎn)，轉(zhuǎn)錄組受外源環(huán)境因子和內(nèi)源因子的共同調(diào)控，反映了生物體的特定組織或器官處于某一生理狀態(tài)下，細(xì)胞內(nèi)全部基因表達(dá)水平情況，通過比較不同組織或生理狀況下的基因表達(dá)差異，尋找與特定生理功能相關(guān)、發(fā)揮重要調(diào)控作用的通路、基因等[6]。轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究是一種整體水平的研究方法，作為功能基因組學(xué)研究的重要手段，其改變了先前的單個(gè)基因的研究模式，大大促進(jìn)了生物體基因組學(xué)的研究進(jìn)展。

1.2?Illumina測序原理及工作流程?高通量測序技術(shù)又名“下一代測序技術(shù)”，包括第二代測序技術(shù)及第三代測序技術(shù)，具有測序速度快、準(zhǔn)確性高且成本低等特性。高通量測序不同于以往的測序方法，可以在無參考基因組的情況下，以更快的速率獲得生物體某組織或器官在特定生理狀態(tài)下的整體轉(zhuǎn)錄水平[1-2]?，F(xiàn)今應(yīng)用較為廣泛的是第二代測序技術(shù)，主要包括羅氏公司的454焦磷酸測序技術(shù)[7]、Illumina公司的Solexa測序法[8]、ABI公司的SOLiD測序技術(shù)[9]以及Helicos公司的大規(guī)模并行單分子合成測序法[10]。

Illumina是一種邊合成邊測序的技術(shù)，是基于其核心技術(shù)“DNA簇”和“可逆末端終結(jié)”來進(jìn)行的[8]。其工作原理為將DNA隨機(jī)打斷成較小的片段，芯片表面連接有一層與接頭互補(bǔ)的寡核苷酸，DNA片段通過接頭固定在芯片表面，產(chǎn)生DNA簇，形成PCR橋結(jié)構(gòu)。而后開展PCR橋式擴(kuò)增，每個(gè)分子可以形成1000個(gè)以上的單克隆DNA簇群?？赡娼K止子是帶有熒光標(biāo)記的dNTP，在3′羥基端有可被化學(xué)切割的基團(tuán)，可以封閉dNTP的3′端黏性，從而阻止下一個(gè)dNTP與之相連接。進(jìn)行測序反應(yīng)時(shí)，通過加入可逆終止子，檢測釋放的熒光信號，通過邊合成邊測序的方法獲得模板鏈的序列信息。

Illumina的工作流程大體包括如下四方面：①連接接頭：將待測樣品提取出的基因組DNA或RNA反轉(zhuǎn)錄組所得的cDNA打斷成長度為100～200 bp的較小片段，并在單鏈DNA片段兩端加上接頭。②形成DNA簇：芯片表面連接有一層引物堿基，加入接頭的DNA通過接頭使其一段固定在芯片上，另一端與最近的另一引物互補(bǔ)而固定，形成橋狀結(jié)構(gòu)，通過PCR擴(kuò)增后，同片段擴(kuò)增1 000倍以上，所有的擴(kuò)增產(chǎn)物均被固定到了芯片上，形成單克隆DNA簇。而后所有模板被線性化處理為單鏈模板。

③測序反應(yīng)：采用邊合成邊測序方法，加入DNA聚合酶、引物以及4種可逆終止子dNTP進(jìn)行擴(kuò)增，測序儀通過捕捉熒光信號，而后通過計(jì)算機(jī)軟件將光信號轉(zhuǎn)換為測序峰，從而獲得測序片段的序列信息。④數(shù)據(jù)分析：讀取堿基，數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)移至自動(dòng)分析通道進(jìn)行二次分析。

1.3?Illumina測序技術(shù)中生物信息分析相關(guān)數(shù)據(jù)庫概念

1.3.1?Nr（NCBI non-redundant protein sequences）數(shù)據(jù)庫。該數(shù)據(jù)庫是 NCBI 官方發(fā)布的非冗余蛋白序列數(shù)據(jù)庫，它包含有來自GenBank中基因編碼的蛋白序列以及來自Swiss Prot、PDB（Protein Data Bank）、PIR（Protein Information Resource）和PRF（Protein Research Foundation）等數(shù)據(jù)庫的蛋白序列信息。

1.3.2?Nt（NCBInucleotidesequences）數(shù)據(jù)庫。該數(shù)據(jù)庫是NCBI 官方發(fā)布的核酸序列數(shù)據(jù)庫，包含有GenBank、DDBJ以及EMBL數(shù)據(jù)庫中的核酸序列信息。

1.3.3?KOG（eukaryotic ortholog groups）數(shù)據(jù)庫。該數(shù)據(jù)庫是NCBI基于基因直系同源進(jìn)化關(guān)系的蛋白數(shù)據(jù)庫，其主要針對真核生物。其是假定構(gòu)成每個(gè)KOG的蛋白都是來自于同一個(gè)祖先蛋白，因此屬于直系同源蛋白以及旁系同源蛋白。其中直系同源蛋白是由不同物種的由垂直家系（物種形成）進(jìn)化而來的蛋白，保留了原始蛋白的典型功能;旁系同源蛋白是來自于一定物種的基因復(fù)制蛋白，因而可能會(huì)進(jìn)化出新的功能。

1.3.4?Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫。該數(shù)據(jù)庫是由富有經(jīng)驗(yàn)的分子生物學(xué)家和蛋白質(zhì)化學(xué)家搜集整理而成的蛋白序列數(shù)據(jù)庫。 每個(gè)注釋條目都含有結(jié)構(gòu)域、功能位點(diǎn)等詳細(xì)信息。

1.3.5?GO（gene ontology）數(shù)據(jù)庫。該數(shù)據(jù)庫是一個(gè)國際標(biāo)準(zhǔn)化的基因功能分類體系，提供了一套動(dòng)態(tài)更新的標(biāo)準(zhǔn)詞匯表來描述生物體中基因及其基因產(chǎn)物的分類屬性。GO分類系統(tǒng)具有3個(gè)本體，包括描述基因的分子功能、所處的細(xì)胞位置以及參與的生物過程三大子類。GO的基本單位為詞條，均具有相對應(yīng)的屬性。

1.3.6?KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）數(shù)據(jù)庫。在生物體內(nèi)，不同基因通過所處通路、相互協(xié)調(diào)從而發(fā)揮其生物學(xué)功能，通過通路顯著性富集分析能確定差異表達(dá)基因參與的最主要生化代謝途徑以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。

2?高通量測序技術(shù)在主要洄游性魚類研究中的應(yīng)用

在刀鱭上也有基于高通量測序技術(shù)的研究報(bào)道。主要是集中在刀鱭不同組織如性腺組織的深度測序[11-13]，也有操作應(yīng)激對刀鱭肝組織的影響研究[14]。有關(guān)刀鱭洄游中的關(guān)鍵通路及基因的轉(zhuǎn)錄組研究較少，僅見刀鱭嗅覺上皮的比較轉(zhuǎn)錄組分析研究[15]。

2.1?高通量測序技術(shù)在鮭魚研究中的應(yīng)用?高通量測序技術(shù)在鮭魚研究上應(yīng)用涉及的種類較多，包括大西洋鮭（S.salar）[16]、銀大麻哈魚（O.kisutch）[17]、紅大麻哈魚（Oncorhynchus nerka）[18]、大鱗大麻哈魚（O.tshawytscha）[19]等，現(xiàn)已開展了免疫學(xué)、營養(yǎng)學(xué)、繁殖學(xué)等的研究，其中免疫學(xué)方面的研究較多。如 Johansson等[20]開展了降海洄游中大西洋鮭頭腎、小腸以及鰓的免疫轉(zhuǎn)錄組研究。研究結(jié)果表明，頭腎、小腸中的基因差異表達(dá)顯著高于鰓中的?；蛉喊ㄏ忍炜共《久庖?、趨化因子、細(xì)胞因子及其受體、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子、體液及細(xì)胞免疫因子淋巴細(xì)胞等均出現(xiàn)了顯著的下調(diào)表達(dá)。海虱（Caligus rogercresseyi）是大西洋鮭魚體常攜帶的寄生蟲，嚴(yán)重時(shí)甚至?xí)?dǎo)致魚體死亡，因而有關(guān)海虱對大西洋鮭各組織的轉(zhuǎn)錄組研究也多有報(bào)道。如Núez-Acua等[16]開展了植食飼料添加劑對增強(qiáng)大西洋鮭抗海虱感染的轉(zhuǎn)錄組研究。選取頭腎、皮膚開展比較研究，結(jié)果表明免疫應(yīng)答最為顯著的組織為頭腎，飼喂含有免疫增強(qiáng)效應(yīng)物的飼料可以上調(diào)魚體代謝方面基因表達(dá)，另外，MHC-Ⅰ與MHC-Ⅱ在此過程中出現(xiàn)差異表達(dá)，來共同發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功用。Valenzuela-Muoz等[17]近期又開展了感染海虱后鐵離子調(diào)控在大西洋鮭魚與銀鮭的差異表達(dá)研究。選取頭腎以及皮膚開展研究，結(jié)果表明相比銀鮭，大西洋鮭更易感染海虱，且感染會(huì)較顯著影響細(xì)胞鐵離子的代謝。而海虱感染對銀鮭影響較小，會(huì)激活促炎性應(yīng)答。Mueller等[18]還開展了紅大麻哈魚感染IHNV后的腦轉(zhuǎn)錄組影響研究，結(jié)果表明上調(diào)表達(dá)基因集中在抗體生成以及抗原呈遞方面;下調(diào)表達(dá)基因主要與膽固醇合成有關(guān)。Valenzuela-Miranda等[21]開展了ISAV感染對大西洋鮭頭腎、肝、鰓組織的轉(zhuǎn)錄組影響研究，研究表明差異表達(dá)基因多是與干擾素通路、先天免疫應(yīng)答以及細(xì)胞繁殖與分化相關(guān)。另外，在應(yīng)答過程中，各組織內(nèi)部通路受到獨(dú)立調(diào)控。Dahle等[22]開展了大西洋鮭感染PRV后紅細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析研究，研究表明感染后，一些病毒應(yīng)答相關(guān)基因出現(xiàn)顯著表達(dá)，涉及干擾素調(diào)控的抗病毒基因以及MHC-Ⅰ抗原遞呈基因。同時(shí)PRV感染也引起了免疫負(fù)調(diào)節(jié)子的表達(dá)，包括一些免疫基因、細(xì)胞骨架相關(guān)組分基因以及離子交換、細(xì)胞互作、生長與分化調(diào)節(jié)因子等基因的下調(diào)表達(dá)。

在營養(yǎng)學(xué)方面，主要開展了飼料添加劑對大西洋鮭消化等的影響研究。如Król等[23]開展了植物蛋白飼料對大西洋鮭腸轉(zhuǎn)錄組的影響研究，結(jié)果表明混合型植物蛋白飼料在改善魚體組成等方面功能優(yōu)于單一組分植物蛋白飼料。De Santis等[24]開展了不同替代水平的蠶豆蛋白飼料對大西洋鮭肝轉(zhuǎn)錄組的影響研究，研究表明大西洋鮭可利用中度替代水平的蠶豆蛋白飼料，最適添加量為120 g/kg。同年，De Santis等[24]開展了不同磷脂添加水平及組成的飼料對大西洋鮭腸轉(zhuǎn)錄組影響研究，結(jié)果表明，發(fā)育早期增加磷脂添加量可以對魚體腸道轉(zhuǎn)錄組產(chǎn)生影響，而幼魚期增大添加可以促進(jìn)生長，但是對腸道轉(zhuǎn)錄組基因無顯著作用。

在繁殖學(xué)方面，為了探討上皮組織在大西洋鮭性成熟中的調(diào)控作用，Palstra等[25]開展了馬蘇大麻哈魚上皮轉(zhuǎn)錄組的比較研究，發(fā)現(xiàn)了75個(gè)已知的以及27個(gè)未知的發(fā)揮重要作用的差異表達(dá)基因。Gomez-Uchida等[19]開展了大鱗大麻哈魚精巢的轉(zhuǎn)錄組測序研究，獲得了大量的基因及GO、KEGG富集通路信息，為今后進(jìn)一步開展大鱗大麻哈魚的相關(guān)研究奠定了理論基礎(chǔ)。另外，有關(guān)鮭魚研究多是集中在大西洋鮭上，Kim等[26]還開展了銀鮭13個(gè)組織的轉(zhuǎn)錄組研究，為后續(xù)進(jìn)一步開展銀鮭這一物種的相關(guān)研究奠定了理論基礎(chǔ)。

2.2?高通量測序技術(shù)在鱘魚研究中的應(yīng)用

有關(guān)鱘魚的高通量測序研究涉及的種類也較多，包括史氏鱘（A.schrenckii）[27]、中華鱘（A.sinensis）[28]、俄羅斯鱘（A.gueldenstaedtii）[29]、意大利鱘（A.naccarii）[30]等，主要集中在性腺組織、免疫組織測序等理論基礎(chǔ)研究方面。如Chen等[29]選取不同發(fā)育階段俄羅斯鱘的性腺組織開展了高通量測序研究，結(jié)果表明信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因富集最顯著，體現(xiàn)了信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制對于俄羅斯鱘性腺發(fā)育的調(diào)控作用。雌性個(gè)體的蛋白合成、細(xì)胞色素C氧化酶亞單元、核糖體蛋白等相關(guān)基因表達(dá)顯著高于雄性個(gè)體，雄性個(gè)體在轉(zhuǎn)座元件轉(zhuǎn)座酶、反轉(zhuǎn)錄酶以及轉(zhuǎn)座酶等相關(guān)基因表達(dá)方面高于雌性。Jin等[27]開展了史氏鱘精巢及卵巢的比較轉(zhuǎn)錄組研究，獲得了1 309個(gè)差異表達(dá)基因，精巢中有782個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，卵巢中出現(xiàn)527個(gè)基因上調(diào)表達(dá)。Yuan等[31]開展了史氏鱘miRNA的高通量測序研究，獲得了103個(gè)miRNA，其中58個(gè)具有強(qiáng)烈的檢測信號，25個(gè)miRNA在5個(gè)檢測的組織中均有表達(dá)。Yue等[28]開展了中華鱘的精巢與卵巢的轉(zhuǎn)錄組測序及比較研究，獲得了1 896個(gè)差異表達(dá)基因，其中1 894個(gè)基因在卵巢中出現(xiàn)上調(diào)表達(dá)，2個(gè)基因在精巢中出現(xiàn)上調(diào)表達(dá)。Vidotto等[30]開展了意大利鱘性腺以及腦組織的高通量測序研究，獲得了32個(gè)性別相關(guān)基因，并發(fā)現(xiàn)了其中7個(gè)關(guān)鍵基因，在后續(xù)的組織學(xué)檢測中發(fā)現(xiàn)其中5個(gè)位于雄性個(gè)體中，其余2個(gè)位于雌性個(gè)體中。Jin等[27]開展了多肽激素Kp處理對史氏鱘腦部下丘腦-垂體-性腺軸的轉(zhuǎn)錄組影響研究，研究表明多肽激素Kp將會(huì)引起G蛋白偶聯(lián)受體54、促性腺激素釋放激素、雄激素受體、雌激素受體等基因的上調(diào)表達(dá)。Zhu等[32]首次開展了中華鱘免疫組織的高通量測序研究，獲得了67 000 000的高質(zhì)量讀本以及91 739個(gè)基因序列。GO及KEGG富集分析結(jié)果表明獲得的大量免疫相關(guān)基因包括PRR信號通路、JAK-STAT信號通路、補(bǔ)體凝集通路、T細(xì)胞受體與B細(xì)胞受體信號通路等。為進(jìn)一步開展該物種的相關(guān)研究奠定了理論基礎(chǔ)。

2.3?高通量測序技術(shù)在刀鱭研究中的應(yīng)用

高通量測序技術(shù)也已應(yīng)用在刀鱭的相關(guān)研究上，但總體來說，研究較少。已見有關(guān)刀鱭不同組織的深度測序研究報(bào)道[11-13]，Duan等[12]開展了刀鱭卵巢組織的轉(zhuǎn)錄組研究，獲得了63 141個(gè)基因。其中8 570個(gè)基因注釋到了COG的25個(gè)條目中，12 358個(gè)基因注釋到了234條KEGG通路中。Shen等[13]開展了刀鱭10個(gè)組織包括腦、鰓、心、腸、腎、肝、肌肉、胃、卵巢以及精巢組織的高通量測序研究，共獲得了65 350個(gè)非冗余轉(zhuǎn)錄本，序列平均長度為1 520 bp，其中15 055個(gè)基因注釋到了COG的25個(gè)條目中，40 688個(gè)基因被注釋到GO條目中，32 882個(gè)基因富集到了KEGG通路上。另外，Du等[14]也開展了急性操作應(yīng)激對刀鱭肝組織轉(zhuǎn)錄組的影響研究，獲得了6 406個(gè)差異表達(dá)基因。其中，3 416個(gè)基因出現(xiàn)下調(diào)表達(dá)，2 990個(gè)基因出現(xiàn)上調(diào)表達(dá)。KEGG富集分析結(jié)果表明，最顯著富集的通路集中在代謝相關(guān)包括糖以及脂代謝等。另外，也有有關(guān)刀鱭洄游機(jī)理的關(guān)鍵通路及基因的高通量研究報(bào)道，例如Zhu等[15]開展的刀鱭嗅覺上皮的比較轉(zhuǎn)錄組分析研究，試驗(yàn)選取野生洄游刀鱭以及非洄游刀鱭上皮組織開展研究，研究表明差異表達(dá)基因集中在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路以及酶活性調(diào)節(jié)相關(guān)通路。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)許多對洄游行為發(fā)揮調(diào)控作用的基因包括嗅覺受體、環(huán)核苷酸門控陽離子通道、依賴鈣離子激活的氯離子通道、光傳感因子、G蛋白受體激酶等基因。

3?展望

高通量測序技術(shù)已成為深入開展科學(xué)研究的有效手段，在人、哺乳動(dòng)物、魚類等均有廣泛的應(yīng)用。洄游性魚類是水生資源修復(fù)中的重要組成部分，但其魚體調(diào)控機(jī)制個(gè)體差異性明顯，今后還應(yīng)針對物種自身特性應(yīng)用高通量測序技術(shù)開展深入研究，為更好實(shí)現(xiàn)水生生物資源修復(fù)奠定理論基礎(chǔ)。參考文獻(xiàn)

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