歐陽鵬凌，管 玘，曲 丹，丁信文，楊 麗，宋立華,3,*

（1.上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海 200240；2.上海市第七人民醫(yī)院營養(yǎng)科，上海 200137；3.上海交通大學(xué)陸伯勛食品安全研究中心，上海 200240）

非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是由除酒精和其他對肝臟有明確損害因素導(dǎo)致的脂肪在肝細(xì)胞中過度沉積為主要特征的臨床病理表現(xiàn)[1]，包括從簡單的脂肪變性發(fā)展到脂肪性肝炎、肝纖維化及肝硬化的整個疾病譜[2]。調(diào)查顯示，NAFLD的全球患病率為25.24%[3]，在我國的發(fā)病率為20.09%[4]。NAFLD的發(fā)生與2型糖尿病、動脈粥樣硬化、慢性腎病等密切相關(guān)，是代謝綜合征在肝臟中的體現(xiàn)[5]。研究發(fā)現(xiàn)，NAFLD患者患病4 年間2型糖尿病的發(fā)病率約為9.9%[6]，而2型糖尿病患者伴有NAFLD的概率接近60%[7]。NAFLD也是冠狀動脈粥樣硬化的一個危險標(biāo)志[8]，Wong等[9]的研究顯示，84.6%的NAFLD患者體內(nèi)冠狀血管狹窄至少超過50%，而冠狀動脈狹窄程度是冠狀動脈粥樣硬化嚴(yán)重程度的最直接體現(xiàn)。另有研究結(jié)果表明NAFLD患者在5 年內(nèi)慢性腎病的累積發(fā)病率為3.1%，在10 年內(nèi)的累計發(fā)病率為12.2%[10]?？梢奛AFLD與多種疾病互相關(guān)聯(lián)，已成為21世紀(jì)世界范圍內(nèi)的一個重要公共健康問題。

肝臟是人體最大的代謝器官，參與的代謝通路十分復(fù)雜，一旦肝臟出現(xiàn)病變，難以通過檢測單一代謝物的水平來反映代謝改變的全貌，而代謝組學(xué)能夠反映經(jīng)歷一系列變化之后機體在代謝產(chǎn)物上的整體性變化，運用此方法研究肝臟疾病的演變具有技術(shù)優(yōu)勢[9]。血清中含有1 000多種內(nèi)源性小分子代謝物，是代謝組學(xué)中非常重要的體液樣本。Barr[11]利用超高效液相色譜-質(zhì)譜（ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry，UPLC-MS）對NAFLD小鼠的血液進行代謝組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)NAFLD模型組小鼠血清中有機酸、鞘磷脂、卵磷脂、游離脂肪酸以及膽酸含量上升。蘇趙威[12]對NAFLD大鼠血清進行代謝組學(xué)研究，結(jié)果表明大鼠血清中糖類、氨基酸類和脂肪酸類代謝物較正常組有明顯差異，提示NAFLD狀態(tài)下機體能量代謝及脂類代謝出現(xiàn)紊亂。袁洋[13]的研究也發(fā)現(xiàn)NAFLD狀態(tài)下血清類脂含量降低，而乳酸含量顯著升高，進一步證明NAFLD狀態(tài)下機體代謝出現(xiàn)紊亂。上述研究結(jié)果提示，通過檢測分析血清中小分子代謝物，可在一定程度上揭示NAFLD在代謝途徑方面的致病機制及預(yù)防靶點。

目前，誘導(dǎo)大鼠出現(xiàn)NAFLD的主要方法是進行高脂飲食的飼喂。該方法可誘導(dǎo)大鼠肥胖，使其產(chǎn)生胰島素抵抗等癥狀，能較好地體現(xiàn)人體內(nèi)出現(xiàn)NAFLD時的機制[14]。因此，從飲食調(diào)節(jié)和膳食干預(yù)的角度出發(fā)，可從源頭上對NAFLD進行預(yù)防。植物甾醇（phytosterols，PS）是玉米、大豆等油料作物中的主要活性物質(zhì)，其酯類形式植物甾醇酯（phytosterol esters，PSE）較PS具有更好的溶解性和吸收率[15]。前期研究發(fā)現(xiàn)PSE可顯著減輕NAFLD大鼠肝臟的脂肪變性程度[16-17]，并且其可通過調(diào)節(jié)PPAR-α、PPAR-γ等脂代謝相關(guān)基因發(fā)揮預(yù)防NAFLD的作用[16]，但具體機制不明。為進一步探究PSE干預(yù)對NAFLD預(yù)防作用的代謝分子機制，本實驗在前期研究基礎(chǔ)上利用UPLC聯(lián)用四極桿串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜（UPLC-quadrupole-tandem time-of-flight mass spectrometry，UPLC-Q-TOF-MS）技術(shù)檢測NAFLD大鼠血清中小分子代謝物的變化，從代謝組學(xué)的角度進一步闡明PSE發(fā)揮NAFLD預(yù)防作用的機制。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

清潔級SD大鼠，6 周齡，雄性，體質(zhì)量（170f10）g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2012-0002。大鼠飼料購自福貝世亨生物醫(yī)藥（上海）有限公司?；A(chǔ)飼料組成：粗蛋白≥20%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）、水分≤10%、灰分≤8%、粗纖維≤5%、粗脂肪≥4%、鈣1%～1.8%、賴氨酸1.32%、蛋氨酸+胱氨酸0.78%、磷0.6%～1.2%；高脂飼料配方：基礎(chǔ)飼料52.65%、豬油21%、酪蛋白10%、蔗糖10%、麥芽糊精2.7%、預(yù)混料1.9%、膽固醇1.25%、膽鹽0.5%。

PSE混合標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥91%，包括β-谷甾醇（42.0%～55.0%）、菜油甾醇（20.0%～29.0%）、豆甾醇（12.0%～23.0%）） 巴斯夫中國有限公司；乙腈、甲醇（分析純） 國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Acquity UPLC I-Class系統(tǒng)（配備二元泵、真空脫氣機、自動進樣器和柱溫箱）、VION IMS Q-TOF-MS儀美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 灌胃用PSE強化牛奶的制備

于65 ℃水浴鍋中將PSE液化，將其與牛奶混合并通過高壓均質(zhì)乳化（20 MPa），分別制成0.05、0.10 g/mL PSE強化牛奶。

1.3.2 實驗動物分組與樣本收集

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后隨機分為以下4 組：正常對照組（NC，n＝4）、高脂模型組（HF，n＝9）、低劑量PSE組（PSE-L，n＝9）和高劑量PSE組（PSE-H，n＝9）。NC組大鼠飼喂基礎(chǔ)飼料，其余各組飼喂高脂飼料。NC和HF組灌胃給予普通純牛奶（1 mL/100 gmbgd），PSE-L和PSE-H組分別灌胃給予與NC組同體積的低（0.05 g/100 gmbgd）、高劑量（0.10 g/100 gmbgd）PSE強化牛奶（相當(dāng)于成人3 g/d和6 g/d的攝入量），連續(xù)灌胃12 周。大鼠飼養(yǎng)環(huán)境：相對濕度為45%～65%，室溫為（25f1）℃，12 h明暗輪換采光，可自由進食及飲水。實驗期間每天記錄各組大鼠攝食量，每周稱量記錄各組大鼠體質(zhì)量。實驗結(jié)束時，腹腔注射40 mg/kg質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，用普通采血管于腹主動脈取血，血液室溫凝結(jié)后離心取血清。

1.3.3 血清樣品前處理條件優(yōu)化

取50 μL血清，分別加150 μL和200 μL前處理試劑甲醇-乙腈（1∶1（V/V，下同）），振蕩混合均勻，靜置2 h后于12 000 r/min離心20 min，取上清液于試劑瓶中待測。

1.3.4 UPLC-Q-TOF-MS分析

色譜條件：色譜柱為Acquity UPLC BEH C18（100 mmh2.1 mm，1.7 μm），進樣量為1 μL，柱溫為45 ℃，流速為0.4 mL/min。流動相A為體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸溶液，流動相B為體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸-乙腈溶液；梯度洗脫程序為5%～20% B，1 min；20%～40% B，1.5 min；40%～100% B，6.5 min；100% B，3 min；100%～5% B，0.5 min；5% B，2 min。

質(zhì)譜條件：在正、負(fù)電噴霧電離模式下運行。全信息串聯(lián)質(zhì)譜掃描模式：低能量（4 eV）和高能量（20～45 eV）兩種全信息串聯(lián)質(zhì)譜模式在運行期間交替采集信息。碰撞誘導(dǎo)解離氣體：氬氣（99.999%），去溶劑化和錐形氣體：氮氣（＞99.5%）。掃描范圍為50～1 000 amu；一次掃描用時0.2 s；毛細(xì)管電壓分別為2 kV（正離子模式）、1 kV（負(fù)離子模式）；源偏置電壓60 V；錐形電壓40 V；去溶劑化氣體溫度450 ℃；源溫度115 ℃；錐形氣體流量50 L/h；去溶劑化氣體流量900 L/h。通過參比探針將乙腈-水-甲酸（體積比50∶49.9∶0.1）中的250 ng/mL亮氨酸腦啡肽標(biāo)準(zhǔn)校正溶液（5 μL/ min）連續(xù)輸注，從而進行鎖定質(zhì)量校正，每30 s掃描一次。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

UNIFI 1.8.1軟件用于血清代謝組學(xué)數(shù)據(jù)采集，在Progenesis QI v2.3軟件中導(dǎo)入原始數(shù)據(jù)并進行峰采集、比對和歸一化，從而得到保留時間和質(zhì)荷比（m/z）等。將篩選編輯后的數(shù)據(jù)組織為二維矩陣，在SIMCA-P軟件中進行主成分分析（principal component analysis，PCA）和偏最小二乘法判別分析（partial least squares discrimination analysis，PLS-DA），根據(jù)模型得到的變量權(quán)重值（VIP＞1）、最小變異系數(shù)（min CV＜30%）以及Student-t檢驗的P值（P＜0.05）來尋找差異代謝物。在HMDB（the Human Metabolome Database）（http://www.hmdb.ca/）、LIPID MAPS（http://www.lipidmaps.org/tools/）數(shù)據(jù)庫以及UNIFI軟件中，將精確質(zhì)量和高能質(zhì)譜中的碎片做進一步比對，從而鑒定化合物。運用EZinfor V3.0.3軟件對得到的歸一化峰強度做進一步統(tǒng)計分析。通過Metabo Analyst（http://www.metaboanalyst.ca/faces/upload/PathUploadView.xhtml）等在線數(shù)據(jù)庫檢索差異性代謝物及其所參與的代謝通路。利用GraphPad Prism 6軟件作圖，數(shù)據(jù)采用SPSS Statistics 20軟件作單因素方差分析，并用多重比較法兩兩比較，P＜0.05表示兩組差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 血清小分子代謝物檢測不同前處理方法比較

本實驗中150、200 μL甲醇-乙腈（1∶1）處理的血清在正、負(fù)離子模式下得到的基峰離子流圖差別不明顯，圖1為200 μL甲醇-乙腈（1∶1）處理血清后得到的基峰離子流圖。為了使樣品濃度較小時不易污染離子源，從而增加儀器的耐受性，并使蛋白質(zhì)沉淀完全，在50 μL血清中加入200 μL甲醇-乙腈（1∶1）進行前處理。

圖 1 在UPLC-Q-TOF-MS正、負(fù)離子模式下的基峰離子流圖譜Fig. 1 Base peak ion current pattern in positive and negative modes of UPLC-Q-TOF-MS

2.2 PSE干預(yù)對NAFLD大鼠血清中小分子代謝物的影響

2.2.1 多維統(tǒng)計分析結(jié)果

利用SIMCA-P軟件對各組大鼠血清小分子代謝物進行無監(jiān)督的數(shù)據(jù)分析（PCA）后，可得到模型概括X矩陣解釋率（R2X），當(dāng)R2X＞0.4時說明該模型可靠。本實驗樣品在正離子模式下R2X＝0.78，負(fù)離子模式下R2X＝0.74，因此所建立的模型可以很好地解釋各組間差異。為了對正交信號進行校正并運用排列試驗和交叉驗證對模型的可靠性進行驗證，以更好地區(qū)分各組間的差異，對數(shù)據(jù)進行標(biāo)準(zhǔn)化處理，采用有監(jiān)督的多維統(tǒng)計分析（PLS-DA）法對樣品做進一步分析，可得到R2Y和Q2兩個數(shù)據(jù)，其中R2Y可反映模型的穩(wěn)定性，其越接近于1說明模型的穩(wěn)定性越好；Q2反映的是模型的預(yù)測性，當(dāng)Q2＞0.5時表明模型可靠。在正離子模式下R2Y＝0.65、Q2＝0.56，負(fù)離子模式下R2Y＝0.80、Q2＝0.50。由圖2中的PLS-DA得分圖可看出，PSE-H組與模型組區(qū)分較明顯，而PSE-L組與模型組差異較小。

圖 2 各組大鼠血清小分子代謝物PCA和PLS-DA得分圖Fig. 2 PCA and PLS-DA score plots for serum samples of rats from different groups

2.2.2 差異代謝物的確認(rèn)

利用TOF-MS可以通過低、高能量掃描得到低能量通道和高能量通道的質(zhì)譜圖。低能量掃描中的一級質(zhì)譜圖能提供精確相對分子質(zhì)量、分子離子峰以及加合峰的信息，可結(jié)合Mass FragmentTM軟件進一步確定化合物的可能分子式。通過高能量掃描產(chǎn)生的碎片離子信息可以明確碎片的元素組成，推斷可能的化合物結(jié)構(gòu)，并結(jié)合已建立的MOL文件數(shù)據(jù)庫對化合物進行初步的定性。圖3A、B分別為本研究得到的化合物在低、高能量掃描下的圖譜，可以看出其準(zhǔn)分子離子峰為m/z482.324 5[M+H]+；溶血卵磷脂（15∶0）的精確相對分子質(zhì)量為481.316 84。該物質(zhì)在高能量通道中的部分碎片離子如圖4所示，通過與UNIFI軟件中數(shù)據(jù)庫給出的結(jié)構(gòu)進行比對從而推斷其為溶血卵磷脂（15∶0）。以此方式對正、負(fù)離子模式下得到的差異代謝物進行篩選比對。表1為篩選后得到VIP值大于1的27 種差異代謝物的質(zhì)荷比和保留時間，以及其在HMDB、LIPID MAPS中的編號。從表1中可以看出，與HF組相比，上述差異代謝物的離子強度在NC組與低、高劑量PSE組（尤其是PSE-H組）中的變化趨勢基本一致（除溶血卵磷脂（18∶2(9Z,12Z)）外），說明在高脂飲食條件下，PSE干預(yù)可糾正NAFLD病理狀態(tài)下發(fā)生的代謝紊亂。

圖 3 正離子模式下溶血卵磷脂（15∶0）的低（A）、高（B）能量譜圖Fig. 3 Low- (A) and high- (B) energy spectra of Lyso PC (15∶0) in positive ion mode

圖 4 溶血卵磷脂（15∶0）高能量譜圖中部分碎片離子Fig. 4 Selected fragment ions Lyso PC (15∶0) in high energy spectra

圖5為通過單因素方差分析得到的27 種差異代謝物在各組大鼠血清中離子強度的比較結(jié)果。與NC組相比，HF組27 種差異代謝物的離子強度均有顯著性差異（P＜0.05）。與HF組相比，PSE-H組甘油二酯（15∶0/18∶3(6Z,9Z,12Z)/0∶0、14∶0/22∶2(13Z,16Z)/0∶0）、溶血卵磷脂（18∶2(9Z,12Z)、15∶0、16∶1(9Z)、20∶3(5Z,8Z,11Z)、20∶3(8Z,11Z,14Z)、18∶1(9Z)）、磷脂酰膽堿（16∶0/P-18∶0、17∶1(10Z)/0∶0)、20∶3(8Z,11Z,14Z)/18∶0、18∶1(11Z)/20∶1(11Z)、O-18∶0/0∶0）、磷脂酸（22∶4(7Z,10Z,13Z,16Z)/0∶0）、磷脂酰乙醇胺（16∶0/0∶0、20∶3(8Z,11Z,14Z)/0∶0）、磷脂酰肌醇（20∶0/22∶2(13Z,16Z)）的離子強度降低，鞘磷脂（d18∶1/24∶0、d16∶1/25∶0）、鞘糖脂（d18∶1/18∶1(9Z)）、神經(jīng)酰胺（d18∶2/20∶0）的離子強度升高；PSE-L組甘油二酯（16∶0/20∶3(8Z,11Z,14Z)/0∶0）、二十一烷二酸和磷脂酰乙醇胺（18∶4(6Z,9Z,12Z,15Z)/18∶0）離子強度下降，甘油二酯（18∶1(11Z)/18∶1(11Z)/0∶0）、磷脂酰膽堿（16∶0/20∶3(5Z,8Z,11Z)）、磷脂酰乙醇胺（18∶3(6Z,9Z,12Z)/22∶6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)）離子強度顯著下降。

表 1 PSE干預(yù)對NAFLD大鼠血清中差異代謝物的影響Table 1 Effect of PSE intervention on differential metabolites in the serum of NAFLD rats

圖 5 各組大鼠血清中主要差異代謝物的離子強度比較Fig. 5 Comparison of ionic strengths of major different metabolites in serum of rats in each group

2.2.3 代謝通路分析

將表1中差異代謝物輸入Metabo Analyst（http://www.metaboanalyst.ca/faces/upload/PathUploadView.xhtml）數(shù)據(jù)庫中進行代謝通路的檢索及分析評估，構(gòu)建的代謝通路如圖6所示。圖6包含了甘油磷脂代謝、醚脂質(zhì)代謝以及糖基磷脂酰肌醇-錨生物合成這3 種代謝通路，其影響值分別為0.275、0.214 29和0.043 9。選擇影響值大于0.10的代謝通路作為潛在的靶向途徑，得到由磷脂酰膽堿（16∶0/P-18∶0、18∶1(11Z)/20∶1(11Z)、20∶3(8Z,11Z,14Z)/18∶0、16∶0/20∶3(5Z,8Z,11Z)）、磷脂酰乙醇胺（18∶3(6Z,9Z,12Z)/22∶6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)、18∶4(6Z,9Z,12Z,15Z)/18∶0）以及溶血卵磷脂（15∶0、16∶1(9Z)、18∶1(9Z)、18∶2(9Z,12Z)、20∶3(5Z,8Z,11Z)、20∶3(8Z,11Z,14Z)）參與的甘油磷脂代謝通路（圖7）和磷脂酰膽堿（O-18∶0/0∶0）參與的醚脂質(zhì)代謝通路（圖8）。表2為這14 種VIP＞1的差異代謝物在HMDB、PubChem和KEGG數(shù)據(jù)庫中的編號。由代謝通路的分析可以看出，NAFLD病理狀態(tài)下PSE干預(yù)主要調(diào)節(jié)甘油磷脂以及醚脂質(zhì)的代謝紊亂。

圖 6 通過Metabo Analyst數(shù)據(jù)庫構(gòu)建的通路分析概要圖Fig. 6 Pathway analysis profile obtained by Metabo Analyst

圖 7 通過Metabo Analyst數(shù)據(jù)庫得到的甘油磷脂代謝通路Fig. 7 Glycerophospholipid metabolism pathway obtained by Metabo Analyst

圖 8 通過Metabo Analyst數(shù)據(jù)庫得到的醚脂質(zhì)代謝通路Fig. 8 Ether lipid metabolism pathway obtained by Metabo Analyst

表 2 參與代謝通路的差異代謝物Table 2 Differential metabolites involved in metabolic pathways

3 討 論

目前，代謝組學(xué)技術(shù)已經(jīng)被廣泛用于營養(yǎng)學(xué)、毒理學(xué)、藥物開發(fā)等方面的研究，揭示營養(yǎng)、毒性物質(zhì)及藥物等因素對人體或動物體代謝的分子機制。本研究利用甲醇-乙腈（1∶1）混合試劑處理血清樣本，檢測PSE對NAFLD大鼠血清中小分子代謝物的影響，篩選出甘油二酯（14∶0/22∶2(13Z,16Z)/0∶0、15∶0/18∶3(6Z,9Z,12Z)/0∶0、16∶0/20∶3(8Z,11Z,14Z)/0∶0、18∶1(11Z)/18∶1(11Z)/0∶0）、神經(jīng)酰胺（d18∶2/20∶0）、鞘糖脂（d18∶1/18∶1(9Z)）、二十一烷二酸、溶血卵磷脂（15∶0、16∶1(9Z)、20∶3(5Z,8Z,11Z)、20∶3(8Z,11Z,14Z)、18∶1(9Z)、18∶2(9Z,12Z)）、磷脂酸（22∶4(7Z,10Z,13Z,16Z)/0∶0）、磷脂酰膽堿（16∶0/20∶3(5Z,8Z,11Z)、16∶0/P-18∶0、18∶1(11Z)/20∶1(11Z)、17∶1(10Z)/0∶0、20∶3(8Z,11Z,14Z)/18∶0、O-18∶0/0∶0）、磷脂酰乙醇胺（16∶0/0∶0、18∶3(6Z,9Z,12Z)/22∶6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)、20∶3(8Z,11Z,14Z)/0∶0、18∶4(6Z,9Z,12Z,15Z)/18∶0）、磷脂酰肌醇（20∶0/22∶2(13Z,16Z)）、鞘磷脂（d16∶1/25∶0、d18∶1/24∶0）共27 種差異代謝物。代謝途徑檢索結(jié)果表明，部分磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺以及溶血卵磷脂參與了甘油磷脂代謝通路，磷脂酰膽堿（O-18∶0/0∶0）參與了醚脂質(zhì)代謝通路。結(jié)合代謝通路中部分差異代謝物在NAFLD發(fā)生發(fā)展中的生理作用，可初步闡述PSE調(diào)節(jié)NAFLD大鼠脂代謝紊亂的作用途徑。

在27 種差異代謝物中，HF組血清中甘油二酯離子強度較NC組顯著升高，提示甘油磷脂代謝出現(xiàn)紊亂，這與Wang Ya等[18]的研究結(jié)果相同；而PSE組中（尤其是PSE-L組）部分甘油二酯離子強度顯著低于HF組。研究表明，甘油二酯與NAFLD的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[19]。甘油二酯含量的增加會激活蛋白激酶C，而蛋白激酶C可抑制胰島素受體酪氨酸激酶的自身磷酸化，從而加劇胰島素抵抗[20]，而胰島素抵抗是NAFLD的致病因素之一[21]。另外，甘油二酯含量的提高會導(dǎo)致肝臟脂肪變性，增加活性氧的產(chǎn)生，加劇氧化應(yīng)激及脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，進一步促進NAFLD的發(fā)生發(fā)展[20]。

HF組中鞘磷脂、神經(jīng)酰胺、鞘糖脂的離子強度也顯著低于NC組，而PSE-H組中這些差異代謝物的離子強度顯著高于HF組，提示較高劑量PSE干預(yù)可以有效糾正NAFLD病理狀態(tài)所引起的鞘脂類代謝異常。

鞘磷脂由鞘氨醇、磷酸膽堿和脂酸構(gòu)成，在鞘磷脂酶的作用下可以生成神經(jīng)酰胺[22]，是體內(nèi)含量第二的磷脂。文獻[23]表明血清中的鞘磷脂（d18∶1/24∶0）含量可以間接反映肝損傷程度，與炎癥等級呈負(fù)相關(guān)。神經(jīng)酰胺是鞘脂類的一種重要化合物，作為第二信使存在于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)之間，是與胰島素抵抗、氧化應(yīng)激以及炎癥等相關(guān)的重要細(xì)胞信號因子[24]，能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡、分化等過程。神經(jīng)酰胺可通過抑制由炎癥因子比如炎癥因子所導(dǎo)致的超氧化物含量升高，進一步對炎癥反應(yīng)進行調(diào)節(jié)[25]。鞘糖脂是由神經(jīng)酰胺經(jīng)過葡糖基轉(zhuǎn)移酶的糖基化作用合成[26]，是所有動物細(xì)胞中的重要生物小分子，通過糖基轉(zhuǎn)移酶和糖苷水解酶等調(diào)控機制維持生物體內(nèi)的鞘脂類動態(tài)平衡[27]，參與信號傳導(dǎo)、細(xì)胞生長、分化以及凋亡等生命活動[28]。

此外，本研究還發(fā)現(xiàn)HF組中溶血卵磷脂和磷脂酰膽堿的離子強度顯著高于NC組，與Barr[11]的研究結(jié)果相同；而PSE干預(yù)可降低溶血卵磷脂和磷脂酰膽堿的含量，使其趨于正常。磷脂酰膽堿含量增加時可被分解，代謝后可生成甘油三酯，導(dǎo)致肝臟脂質(zhì)堆積和變性[29]；磷脂酰膽堿合成異常加劇還會引起血液中低密度脂蛋白的分泌增多，造成脂代謝異常[30]。

由圖7可看出，溶血卵磷脂、磷脂酰膽堿以及磷脂酰乙醇胺參與了甘油磷脂代謝通路，圖8顯示磷脂酰膽堿（O-18∶0/0∶0）參與了醚脂質(zhì)代謝通路。甘油磷脂是細(xì)胞膜的重要組成成分，甘油磷脂代謝通路紊亂會導(dǎo)致炎癥、內(nèi)皮功能障礙、細(xì)胞膜破壞等情況的發(fā)生[31]。溶血卵磷脂是血液中的重要信號傳導(dǎo)分子，參與細(xì)胞遷移、增殖、血管的生成以及炎癥效應(yīng)等[32]。溶血卵磷脂與G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合后可發(fā)揮誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞的趨化、刺激巨噬細(xì)胞活化等作用，從而促進炎癥的發(fā)生[33]；并可在組織間轉(zhuǎn)運甘油磷脂組分，如脂肪酸、磷脂酰甘油和膽堿。以上研究結(jié)果提示PSE可通過糾正甘油磷脂和醚脂質(zhì)代謝通路，減輕NAFLD大鼠肝臟脂質(zhì)積累引發(fā)的炎癥反應(yīng)。

磷脂酸由磷脂酶D催化水解卵磷脂生成[34]。磷脂酸可通過磷脂酸磷酸水解酶轉(zhuǎn)化為甘油二酯，進一步參與細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)的調(diào)節(jié)和脂質(zhì)代謝[35]。在NAFLD病理狀態(tài)下細(xì)胞膜的通透性會增加[36]，促進炎癥反應(yīng)，可能會導(dǎo)致磷脂酶D進入血液的量增多且活性增強[37]，最終引起磷脂酸含量升高。本研究結(jié)果顯示，HF組的磷脂酸離子強度較NC組顯著上升，而高劑量PSE干預(yù)則可顯著降低磷脂酸的離子強度，進一步證明PSE能夠有效緩解肝臟脂質(zhì)積累引發(fā)的炎癥反應(yīng)。

4 結(jié) 論

本實驗通過UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)檢測PSE干預(yù)后NAFLD大鼠血清中小分子代謝物的變化，篩選出27 種差異代謝物，包括甘油二酯、神經(jīng)酰胺、鞘糖脂、溶血卵磷脂、磷脂酸、磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、鞘磷脂以及脂肪酸，涉及的代謝通路為甘油磷脂代謝和醚脂質(zhì)代謝通路。研究結(jié)果表明，PSE干預(yù)可降低血清中甘油二酯、溶血卵磷脂、磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酸、磷脂酰肌醇、二十一烷二酸的離子強度，升高鞘磷脂、神經(jīng)酰胺、鞘糖脂的離子強度，說明PSE可以通過對甘油磷脂以及醚脂質(zhì)代謝通路進行調(diào)節(jié)以糾正脂類代謝紊亂，減輕高脂飲食造成的脂質(zhì)積累，影響NAFLD的發(fā)生發(fā)展。