王珊珊，孫曉琦，馬玉潔，李娜，周德慶，2，*

（1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，山東青島266071；2.青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室海洋藥物與生物制品功能實(shí)驗(yàn)室，山東青島266000）

豆腐作為一種常見(jiàn)的餐桌食物，距今已有近2 000 年的歷史。豆腐具有口感嫩滑、豆香濃郁、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、種類(lèi)豐富且易于消化吸收等諸多優(yōu)點(diǎn)，深受世界各國(guó)人民的歡迎[1]。一般豆腐的制作主要由浸泡、磨漿、過(guò)濾、煮漿、點(diǎn)腦、蹲腦、破腦、壓榨成型等幾個(gè)環(huán)節(jié)組成[2]。黃漿水是豆腐在壓榨成型時(shí)產(chǎn)生的乳清廢水，產(chǎn)量大，成分復(fù)雜，含有較多有益于人體的大豆異黃酮、蛋白質(zhì)、皂苷、低聚糖等生物活性成分，具有較高的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值。據(jù)統(tǒng)計(jì)，每加工1 t 大豆可排放2 t～5 t 黃漿水[3-4]。由于豆制品加工廠大多規(guī)模較小，受加工工藝和設(shè)備的制約，大部分黃漿水被當(dāng)成廢水簡(jiǎn)單處理后排放，造成資源的極大浪費(fèi)。

近年來(lái)，對(duì)大豆黃漿水進(jìn)行綠色、經(jīng)濟(jì)、高效的綜合利用開(kāi)始引起人們的重視。張瑞等采用脫腥、酶解和配制方式進(jìn)行新型黃漿水配制醬油的研制，所得產(chǎn)品在色澤、香氣和滋味上均與市面釀造產(chǎn)品無(wú)顯著性差異[5]；鄧麗華等采用正交試驗(yàn)對(duì)黃漿水進(jìn)行醋酸發(fā)酵制醋，在經(jīng)過(guò)培養(yǎng)7 d 后即達(dá)到酸度＞3.5%[6]；李麗梅等采用脫臭、澄清、調(diào)配等工藝研制黃漿水紅棗復(fù)合飲料，制得的產(chǎn)品口感柔和、組織狀態(tài)均勻一致[7]。但目前利用乳酸菌發(fā)酵提高黃漿水抗氧化活性的研究報(bào)道相對(duì)較少。前期試驗(yàn)表明，植物乳桿菌、清酒乳桿菌和嗜酸乳桿菌均可在黃漿水中生長(zhǎng)產(chǎn)酸，3 種菌株組合發(fā)酵后黃漿水的抗氧化活性有顯著提高[8]。本試驗(yàn)在前期研究基礎(chǔ)上，通過(guò)單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面法對(duì)黃漿水發(fā)酵液制備工藝進(jìn)行優(yōu)化，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)黃漿水發(fā)酵飲料提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃漿水：青島三聚成有限公司；植物乳桿菌CICC 20265（Lactobacillus plantarum）、嗜酸乳桿菌 CICC 22162（Lactobacillus acidophilus）、清酒乳桿菌 CICC 6245（Lactobacillus sakei）：中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心；總抗氧化能力檢測(cè)試劑盒（ABTS 法）：南京建成生物工程研究所；MRS 培養(yǎng)基：北京陸橋技術(shù)股份有限公司；其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV1102Ⅱ紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海天美科學(xué)儀器有限公司；HCB-1300V 垂直層流潔凈工作臺(tái)：青島海爾醫(yī)療有限公司；Neofuge 15R 高速冷凍離心機(jī)：力康生物醫(yī)療科技控股有限公司；FD5 真空冷凍干燥機(jī)：金西盟公司；RE-52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵組合菌種的準(zhǔn)備

將植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌和清酒乳桿菌分別置于MRS 固體培養(yǎng)基上，于37 ℃條件下活化培養(yǎng)20 h，再以10%接種量接種于MRS 液體培養(yǎng)基。37 ℃培養(yǎng)20 h 后，4 000 r/min 離心5 min，用無(wú)菌生理鹽水洗滌乳酸菌兩次后制備菌懸液，使其濃度為8 log cfu/mL。將植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌和清酒乳桿菌的菌懸液按照1 ∶1 ∶1 的體積比混合作為發(fā)酵組合菌種，接種量以待接種的黃漿水體積計(jì)算[9]。

1.3.2 黃漿水發(fā)酵液的制備

向100 mL 黃漿水中添加5%葡萄糖和5%脫脂奶粉，混勻后于115 ℃條件下滅菌10 min。然后在無(wú)菌條件下接入1%活化后的發(fā)酵組合菌種，37 ℃恒溫發(fā)酵，測(cè)定發(fā)酵液提取物的DPPH 自由基清除率。

1.3.3 提取物的制備

分別取100 mL 發(fā)酵前后的黃漿水，40 ℃下旋蒸濃縮至10 mL，加入100 mL 80%乙醇，超聲輔助提取40 min 后，離心（10 000 r/min，4 ℃，10 min）取上清液，40 ℃旋蒸濃縮后，真空冷凍干燥得到提取物。用80%乙醇配成不同濃度梯度的待測(cè)樣品液，用于抗氧化活性的測(cè)定。

1.3.4 DPPH 自由基清除率的測(cè)定

取2 mL 不同濃度梯度待測(cè)樣品液，加入2 mL 0.2 mmol/L DPPH·乙醇溶液，混勻后避光靜置30 min，于 517 nm 處測(cè)吸光值[10]。

DPPH 自由基清除率/%=[（1-（A樣液-A空白）/A對(duì)照）]×100

式中：A樣液為2 mL 待測(cè)樣品液與等體積DPPH·乙醇溶液混合反應(yīng)后的吸光值；A空白為2 mL 待測(cè)樣品液與等體積無(wú)水乙醇混合后的吸光值；A對(duì)照為2 mL無(wú)水乙醇與等體積DPPH·乙醇溶液混合后的吸光值。

1.3.5 單因素試驗(yàn)

固定發(fā)酵溫度37 ℃、發(fā)酵時(shí)間24 h、脫脂乳粉添加量5%、葡萄糖添加量5%、接種量1%為基本條件，以DPPH 自由基清除率為測(cè)定指標(biāo)，進(jìn)一步探究發(fā)酵溫度（28、31、34、37、40、43 ℃）、發(fā)酵時(shí)間（12、24、36、48、60、72 h）、脫脂乳粉添加量（1%、3%、5%、7%、9%、11%）、葡萄糖添加量（0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%）及接種量（0.5%、1%、2%、3%、4%、5%）對(duì)發(fā)酵液提取物DPPH 自由基清除率的影響。

1.3.6 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以DPPH 自由基清除率為指標(biāo)，以發(fā)酵時(shí)間（A）、脫脂乳粉添加量（B）、葡萄糖添加量（C）三個(gè)因素為自變量，根據(jù)Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，采用軟件Design-Expert V8.0.6.1 設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，因素與水平設(shè)計(jì)如表1 所示。

表1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and their coded values used in response surface analysis

1.3.7 對(duì)羥自由基清除率的測(cè)定

取1 mL 不同濃度的待測(cè)樣品液，依次加入0.5 mL 2 mmol/L EDTA-Fe2+溶液、1 mL 20 mmol/L 磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS，pH=7.4） 溶液、1 mL 360 μg/mL 番紅花 T 溶液、1 mL 3 %H2O2溶液，混勻，37 ℃水浴 30 min，于 520 nm 處測(cè)吸光值[11]。

羥自由基清除率/%=[（A樣液-A空白）/（A對(duì)照-A空白）]×100

式中：A樣液為待測(cè)樣液吸光值；A空白為 PBS 代替樣液做空白對(duì)照的吸光值A(chǔ)對(duì)照為PBS 代替樣液和H2O2的吸光值。

1.3.8 對(duì)ABTS 自由基清除率的測(cè)定

使用A015-2 試劑盒進(jìn)行測(cè)定，具體操作方法與結(jié)果處理參見(jiàn)南京建成生物工程研究所相應(yīng)說(shuō)明書(shū)。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

每組試驗(yàn)重復(fù)3 次，測(cè)試結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差的形式表示；使用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素驗(yàn)試結(jié)果

2.1.1 發(fā)酵溫度對(duì)黃漿水發(fā)酵液DPPH 自由基清除率的影響

發(fā)酵溫度對(duì)黃漿水發(fā)酵液DPPH 自由基清除率的影響見(jiàn)圖1。

圖1 發(fā)酵溫度對(duì)黃漿水發(fā)酵液DPPH 自由基清除率的影響Fig.1 Effect of fermentation temperature on the DPPH radical scavenging rate

由圖1 可知，在28 ℃～43 ℃的發(fā)酵溫度范圍內(nèi)，黃漿水發(fā)酵液的DPPH 自由基清除率變化幅度較小。當(dāng)發(fā)酵溫度為37 ℃時(shí)，發(fā)酵液的DPPH 自由基清除率（72.67%）顯著高于其他發(fā)酵溫度（P＜0.05）。因此確定37 ℃為發(fā)酵黃漿水的最佳溫度。

2.1.2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)黃漿水發(fā)酵液DPPH 自由基清除率的影響

發(fā)酵時(shí)間對(duì)黃漿水發(fā)酵液DPPH 自由基清除率的影響見(jiàn)圖2。

圖2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)黃漿水發(fā)酵液DPPH 自由基清除率的影響Fig.2 Effect of fermentation time on the DPPH radical scavenging rate

由圖2 可知，與未發(fā)酵黃漿水相比，發(fā)酵12 h 的黃漿水對(duì)DPPH 自由基的清除率從56.68 %升高到67.27%。此后隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，發(fā)酵液的DPPH自由基清除率持續(xù)升高，直到第36 h 達(dá)到最高（74.32%）。這可能是由于發(fā)酵過(guò)程中復(fù)雜的大分子酚類(lèi)物質(zhì)被逐漸轉(zhuǎn)化為小分子游離酚類(lèi)物質(zhì)，小分子酚類(lèi)物質(zhì)易于給出H+，H+能夠與DPPH 自由基發(fā)生共振雜化生成穩(wěn)定產(chǎn)物[12-13]。第36 h～第60 h 時(shí)發(fā)酵液的DPPH 自由基清除率開(kāi)始降低，這可能是由于發(fā)酵液中的小分子游離酚類(lèi)等抗氧化物質(zhì)被乳酸菌進(jìn)一步分解，降低了發(fā)酵液總體的抗氧化活性。因此，適宜的發(fā)酵時(shí)間為36 h。

2.1.3 脫脂乳粉添加量對(duì)黃漿水發(fā)酵液DPPH 自由基清除率的影響

脫脂乳粉添加量對(duì)黃漿水發(fā)酵液DPPH 自由基清除率的影響見(jiàn)圖3。

圖3 脫脂乳粉添加量對(duì)黃漿水發(fā)酵液DPPH自由基清除率的影響Fig.3 Effect of skimmed milk powder content on the DPPH radical scavenging rate

由圖3 可知，隨著脫脂乳粉添加量的增加，黃漿水發(fā)酵液對(duì)DPPH 自由基的清除率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，在脫脂乳粉添加量為7 %時(shí)，其DPPH 自由基清除率為75.38%。此后隨著脫脂乳粉的添加量繼續(xù)增加，發(fā)酵液的DPPH 自由基清除能力則有所降低。因此，適宜的脫脂乳粉添加量為7%。

2.1.4 葡萄糖添加量對(duì)黃漿水發(fā)酵液DPPH 自由基清除率的影響

葡萄糖添加量對(duì)黃漿水發(fā)酵液DPPH 自由基清除率的影響見(jiàn)圖4。

圖4 葡萄糖添加量對(duì)黃漿水發(fā)酵液DPPH 自由基清除率的影響Fig.4 Effect of glucose content on the DPPH radical scavenging rate

由圖4 可知，當(dāng)葡萄糖添加量為0.5%～4%時(shí)，黃漿水發(fā)酵液的DPPH 自由基清除能力逐漸升高。當(dāng)添加量為4%時(shí)，發(fā)酵液對(duì)DPPH 自由基的清除率達(dá)到最高（77.99%）。在此之后，黃漿水發(fā)酵液的抗氧化活性則逐步趨于穩(wěn)定。因此，適宜的葡萄糖添加量為4%。

2.1.5 接種量對(duì)黃漿水發(fā)酵液DPPH 自由基清除率的影響

接種量對(duì)黃漿水發(fā)酵液DPPH 自由基清除率的影響見(jiàn)圖5。

圖5 接種量對(duì)黃漿水發(fā)酵液DPPH 自由基清除率的影響Fig.5 Effect of inoculum concentration on the DPPH radical scavenging rate

接種量的高低會(huì)影響發(fā)酵初期乳酸菌的生長(zhǎng)速度，接種量過(guò)低時(shí)，乳酸菌生長(zhǎng)的延滯期變長(zhǎng)易導(dǎo)致雜菌污染，甚至發(fā)酵失?。唤臃N量過(guò)高時(shí)，乳酸菌延滯期縮短并很快到達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在此階段被迅速消耗掉，不利于后期發(fā)酵的持續(xù)性進(jìn)行，因此適宜的接種量有利于發(fā)酵過(guò)程的良好進(jìn)行[14]。由圖5 可知，當(dāng)接種量為1%～5%時(shí)，發(fā)酵液的DPPH 自由基清除率無(wú)顯著性差異，當(dāng)接種量為0.5 %時(shí)，發(fā)酵液DPPH 自由基清除率則相對(duì)較低?？紤]到經(jīng)濟(jì)等因素，將發(fā)酵黃漿水的最適接種量定為1%。

2.2 響應(yīng)面分析法優(yōu)化黃漿水發(fā)酵液制備工藝

2.2.1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果與分析

綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，固定乳酸菌接種量1%，發(fā)酵溫度37 ℃，選擇發(fā)酵時(shí)間（A）、脫脂乳粉添加量（B）、葡萄糖添加量（C）3 個(gè)因素為自變量，以黃漿水發(fā)酵液提取物DPPH 自由基清除率為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken 設(shè)計(jì)原理進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案和結(jié)果如表2 所示，方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

回歸模型方程：DPPH 自由基清除率/%=77.63+2.06A+3.90B+3.11C+2.57AB-0.34AC-0.60BC-11.63A2-3.29B2-1.46C2。由表3 可知，模型 P 值小于 0.000 1，表示該回歸模型高度顯著；失擬項(xiàng)P 值為0.106 9，顯示該模型失擬不顯著；模型相關(guān)系數(shù)R2值為0.988 7，值為0.974 2，初步說(shuō)明該模型具有較好的擬合度，試驗(yàn)誤差較小?；貧w方程各項(xiàng)的方差分析表明，A、C、AB、B2、C2均達(dá)到顯著水平，B、A2為極顯著水平。根據(jù)各因素F 值的大小可知，各因素主效應(yīng)關(guān)系為：B（脫脂乳粉添加量）＞C（葡萄糖添加量）＞A（發(fā)酵時(shí)間）。

表2 Box-Behnken 響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Experimental design and results of response surface

表3 方差分析結(jié)果Table 3 ANOVA for response surface

圖6 是發(fā)酵時(shí)間（A）、脫脂乳粉添加量（B）和葡萄糖添加量（C）兩兩交互作用對(duì)黃漿水發(fā)酵液DPPH自由基清除率的三維響應(yīng)面圖，直觀反映了各因素間的相互影響[15]。

圖6 三因素交互作用對(duì)DPPH 自由基清除率的影響Fig.6 Surface response plots showing the effect of three factors on the DPPH radical scavenging rate

圖6（a）顯示發(fā)酵時(shí)間和脫脂乳粉添加量有顯著交互作用，黃漿水發(fā)酵液DPPH 自由基清除率隨著兩者的升高均呈現(xiàn)先增加后減少趨勢(shì)。發(fā)酵時(shí)間與葡萄糖添加量的交互作用如圖6（b）所示，在一定發(fā)酵時(shí)間內(nèi)，黃漿水發(fā)酵液的DPPH 自由基清除能力隨葡萄糖添加量的升高而升高，碳源的及時(shí)補(bǔ)充有利于發(fā)酵的正向進(jìn)行，提高黃漿水發(fā)酵液的抗氧化活性。圖6（c）為發(fā)酵36 h 時(shí)的脫脂乳粉與葡萄糖添加量的交互作用響應(yīng)面圖，葡萄糖可作為乳酸菌生長(zhǎng)的碳源，其含量較低時(shí)，乳酸菌生長(zhǎng)受限，而脫脂乳粉中含有蛋白質(zhì)、小分子肽等乳酸菌生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，能夠促進(jìn)乳酸菌生長(zhǎng)，進(jìn)而對(duì)黃漿水中的活性物質(zhì)進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，提高發(fā)酵液的抗氧化活性。當(dāng)葡萄糖添加量較高時(shí)，乳酸菌生長(zhǎng)所需的碳源較為充足，能夠較好地完成發(fā)酵，從而削弱了脫脂乳粉對(duì)黃漿水發(fā)酵液抗氧化活性的影響。

經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析優(yōu)化得到最佳發(fā)酵條件為：發(fā)酵時(shí)間37.65 h，脫脂乳粉添加量8.12 %，葡萄糖添加量4.93 %，此時(shí)發(fā)酵液DPPH 自由基清除率的理論值達(dá)到80.31 %。

2.2.2 最佳發(fā)酵條件驗(yàn)證

結(jié)合實(shí)際可操作性，調(diào)整發(fā)酵條件為：發(fā)酵時(shí)間37.5 h，脫脂乳粉添加量8%，葡萄糖添加量5%，得到實(shí)際的發(fā)酵液DPPH 自由基清除率為（82.36±1.57）%，與預(yù)測(cè)值接近。由此可見(jiàn)該模型對(duì)黃漿水發(fā)酵工藝條件參數(shù)優(yōu)化較為可靠，具有一定的實(shí)用價(jià)值。

2.3 黃漿水發(fā)酵液的體外抗氧化活性研究

優(yōu)化發(fā)酵前后黃漿水提取物抗氧化活性見(jiàn)表4。

表4 優(yōu)化發(fā)酵前后黃漿水提取物抗氧化活性的測(cè)定Table 4 Antioxidant activity of extracts from optimized fermented and unfermented tofu whey

如表4 所示，通過(guò)4 種不同的抗氧化體系來(lái)檢測(cè)優(yōu)化發(fā)酵前后黃漿水抗氧化能力的變化。在最優(yōu)發(fā)酵條件下所制備的黃漿水發(fā)酵液清除DPPH 自由基、ABTS 自由基和羥自由基能力均得到顯著提升。其中，發(fā)酵后黃漿水清除羥自由基的IC50值顯著低于陽(yáng)性對(duì)照抗壞血酸（P＜0.05）。

研究表明，黃漿水發(fā)酵液的抗氧化效應(yīng)是多種具有抗氧化活性的物質(zhì)通過(guò)不同機(jī)制協(xié)同作用的結(jié)果。乳酸菌發(fā)酵提高黃漿水抗氧化活性可能與發(fā)酵過(guò)程中的蛋白水解、大分子酚類(lèi)物質(zhì)降解以及大豆異黃酮的生物轉(zhuǎn)化有關(guān)[16-17]。一方面，乳酸菌胞外酶能夠?qū)⑼庠创蠓肿拥鞍踪|(zhì)逐步水解為具有抗氧化活性的多肽[18]。另一方面，發(fā)酵過(guò)程中復(fù)雜的大分子酚類(lèi)物質(zhì)被逐漸降解為小分子游離酚類(lèi)物質(zhì)，能夠與自由基反應(yīng)形成較為穩(wěn)定的酚氧自由基，從而降低自由基的氧化損傷[19-20]。此外，研究表明乳酸菌發(fā)酵有利于大豆異黃酮抗氧化活性和生物利用度的提高，這是由于乳酸菌產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶將糖苷型異黃酮轉(zhuǎn)化為游離苷元型異黃酮，苷元型異黃酮具有更強(qiáng)的抗氧化活性，且更易被腸道吸收[21-22]。

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以DPPH 自由基清除率為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面法優(yōu)化黃漿水發(fā)酵液制備條件。結(jié)果表明最佳發(fā)酵參數(shù)為：接種量1%、發(fā)酵溫度37 ℃、發(fā)酵時(shí)間37.50 h、脫脂乳粉添加量8%、葡萄糖添加量5%。在此條件下制備的黃漿水發(fā)酵液DPPH 自由基清除率為82.36%，與預(yù)測(cè)值接近，說(shuō)明通過(guò)響應(yīng)面法建立的回歸模型方程較為可靠。在最佳發(fā)酵條件下制備的黃漿水發(fā)酵液清除DPPH 自由基、ABTS 自由基以及羥自由基能力均得到顯著提升，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)黃漿水發(fā)酵飲料提供理論基礎(chǔ)。